우리는 우리의 연구의 지원과 협력 박사 조지 커먼즈 박사 딘 Vistnes 감사드립니다. 세인트 조셉 머시 병원 GME에서 지원하는이 작품은 치과와 Craniofacial 연구 기금 1 R21 DE019274-01, R01EB009689 및 RC2 DE020771-02, MTL 박사 현에 소아 재생 의료에 대한 오크 재단과 Hagey 연구소의 국립 연구소에 의해 지원됩니다 .

1. 셀 절연 및 확장 <ol><li> 모든 환자의 동의 및 실험 프로토콜은 스탠포드 대학 (Stanford University) 기관 검토위원회 (프로토콜 # 2188과 # 9999)에 의해 검토 및 승인되었습니다. </li><li> 일반 / 국소 마취하에 선택 lipoaspiration 절차에서 인간의 피하 지방 조직을 가져옵니다. </li><li> lipoaspirate 두 레이어 (그림 1A)이 될 것입니다. 표면에 뜨는는 가공 세포 물질의 대부분이 포함되어 있습니다. 아래 층은 대부분 stromal 세포가 어느 계층에서 수확 할 수 지방 - 유래. 생리 주입하지만, 수율은 표면에 뜨는에서 훨씬 더 있습니다. </li><li> stromal 혈관 분율 (SVF)를 분리하려면, 1X의 동등한 볼륨 생리 (PBS)가 betadine없이 1X PBS (1 개)의 동등한 양에 이어 2.5 % betadine (X2)를 포함하는 인산염 버퍼와 깊이 lipoaspirate을 씻는다. 침전물을 세척 할 수 있습니다. </li><li> 멸균 테를 유지하기 위해주의가공 인체 조직과 오염 등의 과정에서 chnique가 발생할 수 있습니다. </li><li> 맨 아래 레이어를 기음과 각 세척 후에는 폐기합니다. </li><li> 나누어지는 50 ML BD 팔콘 원뿔 튜브에 지방 조직의 15 ML. </li><li> 37 번 행크의 균형 소금 솔루션의 필터링 0.075 % 유형 II collagenase의 동일한 볼륨 (15 ML) (HBSS) ° C 물 목욕에 60 분을위한 지속적인 교반 이하 (약 180 / 분을 흔드는)와 지방 조직을 소화 - 각 튜브마다 15 분 환기. </li><li> 15 ML PBS는 ° C는 고밀도 SVF 펠릿을 얻기 위해 4시 5 분에 1,000 rpm으로 10 % (태아 소 혈청) FBS, 그리고 원심 분리기를 포함하는과 효소 활동을 중화. 펠렛은 지방 - 파생 stromal 세포와 적혈구가 혼합 된 것입니다. </li><li> 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 기존의 성장 미디어 10 ML (Dulbecco의 수정 된 이글 매체 [DMEM] / 10 % FBS / 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션)에 펠렛을 Resuspend. </li><li> 필터 suspen<html> 세포 파편을 제거하는 100 μm 나일론 셀 스트레이너를 통해 시온. </li><li> 한 번에 깊게 50 ML 원뿔에 3 관을 결합합니다. 4 ° C.에서 5 분 1,000 rpm으로 원심 분리기 </li><li> 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 기존의 성장 미디어의 5 ML에있는 펠릿을 Resuspend </li><li> 한 10cm 판 또는 15cm 접시를위한 다섯 50 ML conicals 당 50 ML conicals 조화를 이루고 있습니다. </li><li> 37 ° C/21 % O 2, 5 % CO 2에서 밤새 차 문화를 설정합니다. </li><li> 박 부화 후, 잔여 비 점착성의 적혈구를 제거하는 PBS로 광범위하게 판을 씻는다. 그 결과 세포 인구는 지방 - 파생 stromal 세포입니다. </li><li> 37 ° C/21 % O 2, 5 % CO 성장 미디어의 2 자연 차별화를 방지하기 위해 하위 합류 수준에서 세포를 유지하고 있습니다. 세포는 일반적으로 50 % 합류에 도금 할 때 정기적 인 성장 미디어의 모든 3~4일 분할해야합니다. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 2. 발판 준비 <ol><li> 치과의 학교 - 공사장 공중 발판는 캘리포니아 대학에서 박사 민 리, 로스 앤젤레스에 의해 만들어졌다. </li><li> PLGA의 공사장 공중 발판은 용매 캐스팅와 미립자 침출 과정에서 15분의 85 폴리 (락트산 - 공동 glycolic 산성) (고유 점도 = 0.61 DL / g, 버밍엄 (Birmingham)의 폴리머)에서 가공되었습니다. </li><li> PLGA / 클로로포름 솔루션은 92% 다공성 (볼륨 분율) 및 테플론 금형의 얇은 시트로 압축을 얻기 위해 200-300 μm 직경 자당과 혼합되었다. </li><li> 밤새 동결 건조 후, 공사장 공중 발판은 자당을 분해 두 번 증류 (DD) H 2 O의 세 변화에 익숙해했고, 부드럽게 미세 팁 주걱으로 테플론 판에서 삭제되었습니다. </li><li> 미립자 침출 후, 모든 공사장 공중 발판이 ddH 2 O. 세 린스 그 다음, 30 분 각 50 %, 60 % 및 70 % 에탄올에 빠져 소독 된 </li><li> 모든 공사장 공중 발판은 층류의 후드 아래에 건조되었다. </li><li> 후 비계 제조, Scaffolds는 인회석으로 코팅했다. <ol class="ualpha"><li> SBF (시뮬레이션 신체 유체) 솔루션은 그 인간 혈장의 5 배이었다 이온 농도로 준비했습니다. 모든 솔루션은 0.22 μm PES 멤브레인 (Nalgene)를 통해 필터링 무균했다. 바로 코팅 공정 전에 PLGA의 공사장 공중 발판이 으러 및 코팅 균일 성을 향상시키기 위해 글로우 방전, 아르곤 플라즈마 에칭 (Harrick 과학)를 받게되었다 건조. </li><li> 에칭 PLGA의 공사장 공중 발판이 후 37 SBF에 incubated되었습니다 ° MG이 다음 12 시간에 물 외피 보육 내부 C, +와 HCO 3-37에서 다른 12 시간을 무료로 SBF 2 ° C 부드럽게 저어 아래에. </li><li> 코팅 PLGA의 공사장 공중 발판은 층류 후드에 건조 및 70 % 에탄올로 소독을 초과 나트륨 염화물 솔루션을 씻어하기 위해 멸균 ddH 2 O로 부드럽게 헹구어했다. </li><li> 인회석 코팅의 무결성은 스캔 전자 현미경 (SEM)으로 분석되었다. 인회석 코팅 SCAffolds는 SEM 명세서 (테드 펠라)에 장착하여 전도성을 향상시키기 위해 탄소로 코팅되었습니다. 보조 전자 모드는 SEM (페이 / 필립스 XL-30) 관찰 기간 동안 적용되었습니다. 에너지 분산 X-선 스펙트럼은 인회석 구조의 원소 구성을 확인하기 위해 얻은 것입니다. </li></ol></li></ol> 3. 셀 심는 <ol><li> 하위 합류 수준에 도달시, PBS (X2)으로 세포를 씻고 trypsinize. </li><li> 퍼 뜨리고에 대한 수량화하기 위해 셀을 카운트 </li><li> 1.5 × 10 5 세포와 사전 컷 4.0 mm 직경의 공사장 공중 발판로 씨. <ol class="ualpha"><li> 96 - 웰 플레이트 잘에 장소 개별 발판 </li><li> 미디어의 20 μl 당 약 1.5 × 10 5 세포의 농도와 일반 성장 미디어에서 다시 일시 중지 세포 </li><li> 30 분을위한 세포 배양 배양기에 Pipet 20 바로 발판 위에 μl과 장소를. </li><li> 30 분 후, 미디어 200 μl를 추가하고 셀 품다 할 수수술에 대한 발판에서 하루 아침에 전 </li><li> 그것은 세포의 충분한 숫자를 퍼 뜨리고로 발판 위에 세포의 접착력은 대부분의 발판에 첨부 할 수 있도록합니다 보장 할 필요는 없습니다. 이것은 bioluminescence와 조직 학적 분석 생체에 우리가 실험실에서 검증되었습니다. </li></ol></li></ol> 4. Calvarial 결함 및 생체 주입에서의 창조 <ol><li> 마취 성인 (60 하루 미만) 마취 칵테일 CD-1 누드 마우스. (케타민 / xylazine / acepromazine) 50 % 농도 (0.9 % NaCl로 1시 1분 희석)에서 또는 기관 프로토콜 당 권장 마취 처방 당. hASCs가 면역 반응을 일으키지 않도록 이러한 마우스는 athymic 있습니다. <ol class="lalpha"><li> 용량 : 케타민 염산염 (80 MG / kg), Xylazine (2.5 밀리그램 / kg) Acepromazine (2.5 밀리그램 / kg) </li><li> 효과의 기간 : 약 30 분 </li></ol></li><li> 수술 동물을 내리면 t 수술을 소독betadine과 알코올 (X3)와 사이트 전에 오른쪽 정수리 뼈를 노출 동물의 두피에 중간 선 시상 절개에 연고를 마우스 눈을 다룹니다. 무딘 해주세요 (그림 1B)와 오른쪽 정수리 뼈에서 머리를 제거합니다. </li><li> 살균 다이아몬드 코팅 trephine 드릴 비트를 사용하여 오른쪽 비 봉합 관련 정수리 뼈의 일방적 인 4 mm 전체 두께 결함을 만듭니다. 익스트림주의는 마우스 calvarial 두께로 기본 경질의 팀 이잖아요 (그림 1B)를 방해하지 않도록해야합니다 &lt;0.3 mm입니다. </li><li> 주입하기 전에 중간 유래 성장 인자의 전달을 방지하기 위해 멸균 PBS로 공사장 공중 발판을 씻어. </li><li> 결함에 비계를 놓으십시오. </li><li> 마지막으로, 피부가 폐쇄 봉합 및 설립 수술 프로토콜을 당 동물을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 포스트 operatively - 예를 들어 필요에 따라 동물 보호 프로토콜의 지시에 따라 설립 진통제를 사용합니다. buprenorphine 0.1 MG / Kg. </li></ol> 5. 뼈 같은 형성의 정량화 <ol><li> MicroCT는 마우스에서 수행 된 후, 3 차원 이미지는 이전에 다음 1에 설명 된대로 MicroView 소프트웨어를 사용하여 복원되었습니다. </li><li> 어도비 포토샵을 사용하여 이미지의 표준 높이로 크기있었습니다. </li><li> 마술 지팡이 기능을 사용하면, 픽셀이 calvarial 결함 측정 하였다. </li><li> 결함의 비율 치료는 이후 중부 표준시 스캔은 calvarial 결함 영역을 측정 및 픽셀 수를 결정하고 원래 결함의 픽셀 수로 나누어 계산 한 </li><li> MicroCT를 사용할 수없는 경우 따라서, 대안은 어도비 포토샵을 사용하고 조직학에 대한 결정 시간 지점에서 calvaria를 수확하고 있습니다. </li><li> 뼈 같은 형성을 나타냅니다 아닐린 블루와 Pentachrome 같은 조직 학적 얼룩을 사용하여 결함의 범위를 따라 여러 섹션 스테인드해야 </li><li> 어도비 포토샵이 아닌 모든 영역에서 자르기를 사용하여calvarial 결함에 </li><li> 마법의 지팡이 기능을 사용하여 결함의 영역에 드 노보 뼈 형성 픽셀 수를 결정하고 컨트롤 또는 기타 변수를 비교합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 지방 조직은 임상 응용 프로그램에 대한 전구 세포의 생성에 중요한 역할을 제공 할 수있는 가능성이 있습니다. 지방 조직은 최소한의 병적 상태와 사망률과 관련된 비교적 간단한 절차에 수확 할 수있는 즉시 사용할 수 공급이 점에서 독특한 장점이 있습니다. 조직 수확 및 수집되면, 우리의 프로토콜은 그림 2에 설명되어 있습니다. 지방 - 파생 stromal 세포 세척 단계 시리즈 collagenase를 소화하고, 원심 분리를 통해 분리되어 있습니다. 세포 문화에 도금되면, 그것들은, 확장 체외에서 다양한 차별화 프로토콜에 배치하거나, ​​생체에 직접 배치 할 수 있습니다. C4mm 중요한 크기 calvarial 결함 reation은 우리의 지방 유래 stromal 세포의 osteogenic 차별화 능력을 테스트하는 생체 모델에서 쉽게 접근 할 수와 재현 제공합니다. MicroCT의 사용을 통해, 우리는 생체에서 골격 조직의 형성에 따라 우리의 개입의 진행 상황 (그림 3)을 추적 할 수 있습니다. 중요한 크기 calvarial 결함 동물의 수명 내에 치유되지 않으며, 우리는 결함의 약 90 %가 팔주 주위에 특허 유지를 참조하십시오. 비계 자체가 (토론 참조) osteogenic 유도 특성을 가지고 있으며 일부 뼈 재생을 유도 할 수있는 능력을 보여 주었다. 세포가없는 비계 배치의 전형적인 결과는 결함의 삼분의 일을 주위에 팔주에 드 노보 뼈 형성을해야합니다 것으로 나타났습니다. variab가 있지만 지방 - 파생 stromal 세포의 확대로 완전히 결함의 3 분의 2 이상은 8 주변 주에서 뼈의 재생을 보여줍니다각 동물과 수술 사이 ility. 골격 조직의 형성은 조직 학적 소견을 통해 정량, 전형적인 결과는 아닐린 블루와 Pentachrome의 착색 (그림 3C)를 통해 ASCs과 샘플의 증가 뼈 같은 형성을 표시 할 수 있습니다. 또한, 우리는 (그림 3D) 주입 된 인간의 세포가 calvarial 결함에 드 노보 뼈 형성 지역 근처에 이주에 생체에 착색을 보여 GFP-라벨 hASCs의 사용을 통해 기본 드 노보 뼈의 형성에 기여하는 것을 보여 . 또한, 우리는 결함의 영역 (그림 3E)에 인간의 세포 생존과 기여를 보여 인간의 특정 항체와 immunohistochemistry를 사용합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig1.jpg" /> 그림 1 A -. lipoaspirate은 두 층이 있습니다. 상단 층은 adipocytes와 PR의 대부분을 포함아래 층은 lipoaspiration 과정에서 사용 된 염분을 포함하는 동안 세포 자료를 ocesses. B - 기본 경질 한 학교의 중단없이 오른쪽 정수리 뼈, 4mm 중요한 크기 calvarial 결함의 후속 작성을 분리 할 수​​있는 머리를 통해 중간 선 절개를 통해 calvarial 결함의 생성. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig2.jpg" /> 그림 2.의 확장, 차별화 및 체외 및 생체 내 사용에 지방 - 파생 stromal 세포의 분리에서 lipoaspirate의 수확 및 응용 프로그램의 개요. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4221/4221fig3.jpg" /> 그림 3. hyd을 통해 ASCs의 응용 프로그램과 함께 중요한 크기 calvarial 결함 생체 치료에 게재 A-MicroCTroxyapatitie 비계 (하단 행). ASC 그룹에서 크게 증가 치유를 표시하는 MicroCT에서 뼈의 치유의 정량화 - 컨트롤 세포 (중간 행) B없는 발판의 위치를​​ 가진 비계 및 결함 (상단 행) 및 결함을 포함하지 않습니다. C - 조직학은 아닐린 블루와 Pentachrome 염색을 통해 ASC 그룹 (하단 행)의 증가 뼈 같은 형성을 보여주고 있습니다. 아닐린 블루를 들어, 뼈 같은 얼룩 푸른 색과 어두운 Pentachrome, 뼈 같은 얼룩 노란색하십시오. D - GFP으로 표시 hASCS는 비계에 놓는와 배치 calvarial 결함으로와 이주에 희생되었다. 얼룩은 결함의 영역에서 재생에 기여 인간의 세포를 게재 할 수 GFP 표시 항체로 이루어졌다. E -. 이주의 결함의 영역에서 인간 세포의 유행을 보여주는 인간 핵 항원 immunohistochemistry은 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4221/4221fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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	<li>Levi, B., James, A. W., Nelson, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose-derived+stromal+cells+heal+critical+size+mouse+calvarial+defect.">Human adipose-derived stromal cells heal critical size mouse calvarial defect.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Zuk, P. A., Zhu, M., Ashjia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells.">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).</li><li>Keefe, M. S., Keefe, M. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-integrating+knockdown+and+customized+scaffold+design+enhances+human-adipose-derived+stem+cells+in+skeletal+repair.">Non-integrating knockdown and customized scaffold design enhances human-adipose-derived stem cells in skeletal repair.</a> Stem Cells. 29, 21028-21029 (2011).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

의 고립 때문에 지방은 - 파생 lipoaspirate에서 stromal 세포 2를,이 세포는 세포 lineages 다양한으로 차별화되었습니다. 지방 조직은 mesodermal 기원에서이므로, multipotent 지방 파생 stromal 세포 가능성이 mesodermal 계보 (Lineage)에 대한 응용 프로그램 가장 효과적입니다. 골격 조직을 생성하는 기능을 기증 autograft에 대한 사이트 및 감염, 거부, 시간 3 이상 고장 등의 합성 재료의 고유 제한 부?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 : </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 수확을 Lipoaspirate </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> 행크의 균형 소금 솔루션 </td><td> Cellgro </td><td> 21-023 - CV </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 시그마 </td><td> C6885-500MG </td><td></td></tr><tr><td> 셀 스트레이너 100 μm </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td> Steri-500 ML 0.22 μm 필터 </td><td> Millipore </td><td> SCGPT05RE </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Calvarial 결함 </td></tr><tr><td> Z500 브러시리스 MicromotorsUM50C </td><td> NSK </td><td> NSKZ500 </td><td></td></tr><tr><td> 원형 나이프 4.0 mm </td><td> Xemax 외과 </td><td> CK40 </td><td></td></tr></tbody></table>

repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate

Craniofacial 골격 수리 및 재생은 줄기 세포를 이용한 세포 기반의 접근 방식을 통해 드 노보 조직 형성의 약속을 제공합니다. 지방 - 파생 stromal 세포는 (ASCs) osteogenic, chondrogenic adipogenic 및 myogenic 차별화를 진행 할 수 multipotent 줄기 세포의 풍부한 소스로 입증되었습니다. 많은 연구가 세포 전달을위한 다양한 비계의 biomaterials를 이용하여 생체에서 이러한 세포의 osteogenic 가능성을 살펴 보았다. 이 입증 된 그 osteoconductive, 히드 록시 아파타이트 코팅 폴리 (락트산 - 공동 glycolic 산성) (HA-PLGA) ASCs있는 발판 시드, 중요한 크기 calvarial 결함, 자연 받아야하기위한 무능력으로 정의됩니다 결함을 활용하여 , 동물의 수명 동안 치료하면 효율적으로 강력한 뼈의 재생을 표시 할 수 있습니다. 생체 모델에서이 뼈 조직을 다시 생성하기위한 병진 접근의 기초를 보여줍니다 - 세포구성 요소 및 생물학적 매트릭스. 이 방법은 특정 조직 결함의 수리에 대한 전구 세포의 궁극적 인 임상 응용 프로그램에 대한 모델 역할을합니다.

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Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

이 프로토콜은의 고립을 설명 지방 - 파생 lipoaspirate과 골격 재생을 평가하는 4mm 중요한 크기 calvarial 결함의 생성의 stromal 세포를.

Lipoaspirate에서 수확 지방 - 파생 Stromal 셀을 사용하여 임계 크기 Calvarial 결함 모델의 수리

Craniofacial skeletal repair and regeneration offers the promise of de novo tissue formation through a cell-based approach utilizing stem cells. ...

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

인간 Mammary 섬유아 세포에서 암종 - 관련 섬유아 세포의 실험 세대 (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

연구

의학

A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of spinal cord injury (SCI) in which the thoracic spinal cord is injured. Additionally, because most human cord injuries occur as the result of blunt, non-penetrating trauma (e.g. motor vehicle accident, sporting injury) where the spinal cord is violently struck by displaced bone or soft tissues, the majority of SCI researchers are of the opinion that the most clinically relevant injury models are those in which the spinal cord is rapidly contused.1 Therefore, an important step in the preclinical evaluation of novel treatments on their way to human translation is an assessment of their efficacy in a model of contusion SCI within the cervical spinal cord. Here, we describe the technical aspects and resultant anatomical and behavioral outcomes of an unilateral contusive model of cervical SCI that employs the Infinite Horizon spinal cord injury impactor.
Sprague Dawley rats underwent a left-sided unilateral laminectomy at C5. To optimize the reproducibility of the biomechanical, functional, and histological outcomes of the injury model, we contused the spinal cords using an impact force of 150 kdyn, an impact trajectory of 22.5&deg; (animals rotated at 22.5&deg;), and an impact location off of midline of 1.4 mm. Functional recovery was assessed using the cylinder rearing test, horizontal ladder test, grooming test and modified Montoya's staircase test for up to 6 weeks, after which the spinal cords were evaluated histologically for white and grey matter sparing.
The injury model presented here imparts consistent and reproducible biomechanical forces to the spinal cord, an important feature of any experimental SCI model. This results in discrete histological damage to the lateral half of the spinal cord which is largely contained to the ipsilateral side of injury. The injury is well tolerated by the animals, but does result in functional deficits of the forelimb that are significant and sustained in the weeks following injury. The cervical unilateral injury model presented here may be a resource to researchers who wish to evaluate potentially promising therapies prior to human translation.

A reliable and repeatable way to produce a cervical unilateral spinal cord injury using the Infinite Horizon impactor is described. The method takes advantage of a custom designed frame and clamp to stabilize the spine. The standardized procedure and biomechanical injury parameters result in sufficient and sustained injuries.

무한 호라이즌 임팩터을 사용하여 일방적 경부 척수의 부상의 Contusive 모델

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Creating Rigidly Stabilized Fractures for Assessing Intramembranous Ossification, Distraction Osteogenesis, or Healing of Critical Sized Defects

Assessing modes of skeletal repair is essential for developing therapies to be used clinically to treat fractures. Mechanical stability plays a large role in healing of bone injuries. In the worst-case scenario mechanical instability can lead to delayed or non-union in humans. However, motion can also stimulate the healing process. In fractures that have motion cartilage forms to stabilize the fracture bone ends, and this cartilage is gradually replaced by bone through recapitulation of the developmental process of endochondral ossification. In contrast, if a bone fracture is rigidly stabilized bone forms directly via intramembranous ossification. Clinically, both endochondral and intramembranous ossification occur simultaneously. To effectively replicate this process investigators insert a pin into the medullary canal of the fractured bone as described by Bonnarens4. This experimental method provides excellent lateral stability while allowing rotational instability to persist. However, our understanding of the mechanisms that regulate these two distinct processes can also be enhanced by experimentally isolating each of these processes. We have developed a stabilization protocol that provides rotational and lateral stabilization. In this model, intramembranous ossification is the only mode of healing that is observed, and healing parameters can be compared among different strains of genetically modified mice 5-7, after application of bioactive molecules 8,9, after altering physiological parameters of healing 10, after modifying the amount or time of stabilization 11, after distraction osteogenesis 12, after creation of a non-union 13, or after creation of a critical sized defect. Here, we illustrate how to apply the modified Ilizarov fixators for studying tibial fracture healing and distraction osteogenesis in mice.

This article describes a method for stabilizing long bone fractures that is based on the application of modified Ilizarov external fixators 1-3. After application of the fixators and creation of the bone injury, healing can be assessed, distraction osteogenesis can be performed, or non-union or critical sized defect can be created and used to study therapeutic interventions.

산만 Osteogenesis, 또는 임계 크기의 결함의 치유는 Intramembranous 골화을 평가하기위한 Rigidly 안정 골절 만들기

Assessing modes of skeletal repair is essential for developing therapies to be used clinically to treat fractures. Mechanical stability plays a large role ...

A New Murine Model of Endovascular Aortic Aneurysm Repair

Endovascular aneurysm exclusion is a validated technique to prevent aneurysm rupture. Long-term results highlight technique limitations and new aspects of Abdominal aortic aneurysm (AAA) pathophysiology. There is no abdominal aortic aneurysm endograft exclusion model cheap and reproducible, which would allow deep investigations of AAA before and after treatment. We hereby describe how to induce, and then to exclude with a covered coronary stentgraft an abdominal aortic aneurysm in a rat. The well known elastase induced AAA model was first reported in 19901 in a rat, then described in mice2. Elastin degradation leads to dilation of the aorta with inflammatory infiltration of the abdominal wall and intra luminal thrombus, matching with human AAA. Endovascular exclusion with small covered stentgraft is then performed, excluding any interactions between circulating blood and the aneurysm thrombus. Appropriate exclusion and stentgraft patency is confirmed before euthanasia by an angiography thought the left carotid artery. Partial control of elastase diffusion makes aneurysm shape different for each animal. It is difficult to create an aneurysm, which will allow an appropriate length of aorta below the aneurysm for an easy stentgraft introduction, and with adequate proximal and distal neck to prevent endoleaks. Lots of failure can result to stentgraft introduction which sometimes lead to aorta tear with pain and troubles to stitch it, and endothelial damage with post op aorta thrombosis. Giving aspirin to rats before stentgraft implantation decreases failure rate without major hemorrhage. Clamping time activates neutrophils, endothelium and platelets, and may interfere with biological analysis.

Histological and biochemical modifications after aneurysm endograft exclusion are still unclear. We describe a new model of endograft implantation on a murine aneurysm. Through thrombus analysis with and without persistant circulating blood stream interface, and new endovascular biomaterials evaluation, this model will help to better understand endovascular aneurysm exclusion pathobiology.

혈관 동맥류 수리의 새로운 쥐과 모델

Endovascular aneurysm exclusion is a validated technique to prevent aneurysm rupture. Long-term results highlight technique limitations and new aspects of ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

자궁 적출술 검체에서 차 인간의 자궁 내막 기질 세포를 구축하는 두 가지 방법

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

흉터 상처 수리의 마우스 태아의 피부 모델

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

마우스의 간단한 임계 크기의 대퇴 결함 모델

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients with impeded blood flow or with large wounds might be prolonged. Cell-based therapies have appeared as a new technique for the treatment of diabetic ulcers, and cell-sheet engineering has improved the efficacy of cell transplantation. A number of reports have suggested that adipose-derived stem cells (ASCs), a type of mesenchymal stromal cell (MSC), exhibit therapeutic potential due to their relative abundance in adipose tissue and their accessibility for collection when compared to MSCs from other tissues. Therefore, ASCs appear to be a good source of stem cells for therapeutic use. In this study, ASC sheets from the epididymal adipose fat of normal Lewis rats were successfully created using temperature-responsive culture dishes and normal culture medium containing ascorbic acid. The ASC sheets were transplanted into Zucker diabetic fatty (ZDF) rats, a rat model of type 2 diabetes and obesity, that exhibit diminished wound healing. A wound was created on the posterior cranial surface, ASC sheets were transplanted into the wound, and a bilayer artificial skin was used to cover the sheets. ZDF rats that received ASC sheets had better wound healing than ZDF rats without the transplantation of ASC sheets. This approach was limited because ASC sheets are sensitive to dry conditions, requiring the maintenance of a moist wound environment. Therefore, artificial skin was used to cover the ASC sheet to prevent drying. The allogenic transplantation of ASC sheets in combination with artificial skin might also be applicable to other intractable ulcers or burns, such as those observed with peripheral arterial disease and collagen disease, and might be administered to patients who are undernourished or are using steroids. Thus, this treatment might be the first step towards improving the therapeutic options for diabetic wound healing.

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Adipose-derived stem cells (ASCs) are easily isolated and harvested from the fat of normal rats. ASC sheets can be created using cell-sheet engineering and can be transplanted into Zucker diabetic fatty rats exhibiting full-thickness skin defects with exposed bone and then covered with a bilayer of artificial skin.

생성 및 당뇨병 치유 하는 부상을 모델에서 줄기 세포 지방이 많은 파생 (ASC) 시트의 이식

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

A Novel Clinical Grade Isolation Method for Human Kidney Perivascular Stromal Cells

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and transplantation. Perivascular Stromal Cells (PSCs) share characteristics with bone marrow MSCs (bmMSCs). However, they also possess, most likely due to local imprinting, tissue-specific properties and play a role in local tissue homeostasis. This tissue specificity may result in tissue specific repair, also within the human kidney. We previously showed that human kidney PSCs (kPSCs) have enhanced kidney epithelial wound healing whereas bmMSCs did not have this potential. Moreover, kPSCs can ameliorate kidney injury in vivo. Therefore, kPSCs constitute an interesting source for cell therapy, particularly for kidney diseases and renal transplantation. Here we show the detailed isolation and culture method for kPSCs from transplant-grade human kidneys based on whole-organ perfusion of digestive enzymes via the renal artery and enrichment for the perivascular marker NG2. In this way, large cell quantities can be obtained that are suitable for cellular therapy.

Here we present a novel clinical grade isolation and culture method for kidney Perivascular Stromal Cells (kPSCs) based on whole organ perfusion with digestive enzymes and NG2-cell enrichment. With this method, it is possible to acquire sufficient cell numbers for cellular therapy.

인간의 신장 혈관 주위 Stromal 세포에 대 한 새로운 임상 등급 격리 방법

Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are tissue homeostatic and immune modulatory cells that have shown beneficial effects in kidney diseases and ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Myography 와이어를 사용 하 여 마우스 Mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...