Les auteurs remercient les sources de financement suivantes: P01CA040035 (FE / JAS) et VA Prix le développement de carrière (JAS).

1. Entretien cellule <ol><li> Beaucoup de sous-clones osseuse métastatique de cellules MDA-MB-231 existent qui ont la propension variable pour la colonisation et la croissance osseuse. Pour nos expériences, nous utilisons un clone dérivé de la GFP-étiqueté MDA-MB-231 développé à UTHSCA 2. Ce sous-clone former des lésions osseuses ostéolytiques visibles à environ 3 post-inoculation semaines, avec sacrifice à 4 semaines. </li><li> Maintenir les cellules dans du DMEM contenant 10% de FBS et 0,1 mg / ml de pénicilline-streptomycine à 37 ° C dans 5-8% de CO 2 7. </li><li> Le passage des cellules à confluence de 80-90% et re-plaque à une dilution de 1:10 (cela varie en fonction du type cellulaire et la plaque de taille. Par MDA-MB-231 cellules dans un T-75 est d&#39;environ 6x10 cet 5), qui est à peu près tous les 72 heures. </li><li> MDA-MB-231 cellules maintenir une apparence généralement fibroblastique avec pseudopodes nombreux. Toute l&#39;arrondissement est indicative de stress indésirable surpeuplement ou autre, et doit être évitée car ellepeut affecter le potentiel métastatique in vivo. </li><li> Idéalement, les cellules doivent être maintenues en culture que brièvement avant l&#39;inoculation (nous vous recommandons de moins de 1 semaine ou jusqu&#39;à ce que vous avez suffisamment de cellules pour l&#39;expérience), et un nouveau flacon doit être décongelée si l&#39;arrondissement ou des changements de taux de croissance cellulaire se produire. </li></ol> 2. Préparation des cellules <ol><li> Trypsiniser cellules à confluence de 80-90% avec 0,15% de trypsine / EDTA (Gibco diluer 0,5% de trypsine EDTA 1:2 dans du PBS). Cette concentration permet de détachement rapide (&lt;2 min) et de réduire l&#39;agglutination des cellules. </li><li> Immédiatement éliminer les cellules de la plaque avec 10 ml glacée DMEM contenant 10% de FBS, une pipette dans 15 ml tube conique et centrifuger à 200 xg pendant 5 min. </li><li> Resuspendre le culot dans un tube conique de 50 ml dans 25 ml PBS glacé (sans Ca et Mg) et à compter. </li><li> Centrifuger à nouveau à granulés, et remettre en suspension à 10 6 cellules par ml (intracardiaque) ou à 250.000 cellules/10 ul (intratibial) dans du PBS glacé. La températureture de PBS est important pour empêcher l&#39;agglutination des cellules et une embolie suite après l&#39;injection. La suspension cellulaire doit rester sur la glace tout en effectuant des injections et sera viable et restent non agglomérées pendant 30 min. Bien que le nombre exact de plaques requis variera d&#39;un enquêteur à l&#39;enquêteur, on utilise généralement 1 T-75 pour les souris entre 8-10. </li></ol> 3. L&#39;inoculation intracardiaque <ol><li> 6.4 féminine semaine vieux (Foxn nu-/ -: Harlan) souris sont utilisées pour ces expériences, bien que d&#39;autres souris immunodéprimées (RAG1-/ -, RAG2-/ -, SCID, XID, et etc) peuvent également être utilisé avec l&#39;homme des expériences de cellules cancéreuses. </li><li> Les souris nues doivent être nourris au jour Teklad régime 2920x 5-10 avant l&#39;injection pour réduire la mortalité de la procédure d&#39;injection, et de réduire la fluorescence de fond dans les procédures d&#39;imagerie (puisque la nourriture est la luzerne gratuit). </li><li> Si vous utilisez d&#39;autres souris de nu / nu, enlever les poils par le rasage ou l&#39;utilisation de Nair (dans notre expérience Nair fonctionne mieux) sur abdominale area avant de commencer la procédure. </li><li> Anesthésier la souris dans une chambre d&#39;isolement à l&#39;aide d&#39;un vaporisateur d&#39;isoflurane (2,5% Iso: 2-3 L / min O 2) ou autre anesthésie préféré (dans notre expérience isoflurane est le mieux toléré pour les inoculations intra-cardiaques). </li><li> Déplacer une souris à la fois à la pointe avant de l&#39;appareil d&#39;anesthésie à l&#39;intérieur d&#39;une hotte ventilée en acier inoxydable. </li><li> Placez chaque souris sur son dos avec la poitrine vers le haut. </li><li> Laver la poitrine avec un 10% povidone / iode tampon / solution suivie d&#39;éthanol à 70%, en répétant 2 fois. </li><li> Mark souris poitrine pour injection (en utilisant un marqueur stérile ou le marquage légèrement sur le côté pour garder le site d&#39;injection stérile). Nous utilisons un emplacement à mi-chemin entre la marque et la fourchette sternale supérieure du processus xiphoïde, et légèrement à gauche (anatomique) du sternum. Dessiner une petite bulle d&#39;air dans la seringue pour créer un espace entre le piston et le ménisque (important pour voir pulsation cardiaque) de 300 ul de 28 g ½ seringue à insuline, etétablir 100 ul de cellules. </li><li> Gardez l&#39;aiguille verticale. Tout en tenant la peau tendue de la souris avec l&#39;autre main, introduire l&#39;aiguille. </li><li> Insertion réussie dans le ventricule cardiaque gauche devrait se traduire par une impulsion distincte rouge vif du sang dans la seringue. A cette profondeur, soigneusement appuyer piston de la seringue (volume de 100 pl), sans mouvement significatif de l&#39;aiguille pour éviter de percer le coeur ou les cellules déversant dans la cavité thoracique. </li><li> Après que les cellules sont injectées, tirez légèrement sur le piston pour créer une petite quantité de pression négative pour réduire l&#39;égouttement des cellules dans la cavité thoracique. </li><li> Tirer l&#39;aiguille directement de la poitrine tout en étant sûr d&#39;éviter inclinaison de l&#39;aiguille lors de l&#39;enlèvement, qui peut déchirer la paroi interne du cœur et causer des saignements. </li><li> Appliquez une légère pression sur la poitrine sur le site d&#39;injection pour réduire le saignement. </li><li> Enlevez la souris de l&#39;ogive et de continuer à appliquer une légère pression pendant environ 1 min. </li><li> Déplacez la souris pour coussin chauffant jusqu&#39;à ce que complètement conconsciente. </li><li> Si la souris commence à tourner ou à se contracter après la guérison, la cause probable est une embolie. Injecter souris intraperitoneale avec 80-120 mg / kg de kétamine pour augmenter le débit sanguin et le débit cardiaque tout en diminuant la résistance vasculaire. Cela devrait aider à passer la souris le caillot. Lorsque cela se produit, il est préférable de changer les préparations cellulaires, car il indique que les cellules sont agglutination. Nous changeons de préparations de cellules après environ 8 souris, ou 30 min. </li></ol> 4. Intratibial <ol><li> Injecter la souris avec Buprenex (0,1 mg / kg) ou similaire analgésique approuvées immédiatement avant l&#39;intervention. </li><li> Anesthésier la souris en utilisant l&#39;isoflurane, puis passer à cône de nez et maintenir une anesthésie. </li><li> Nettoyer les deux jambes avec povidone 10% / iode tampon / solution, puis de l&#39;éthanol, de répéter 2 fois. Jambes épiler (avec Nair ou produit similaire) avant de les nettoyer le cas échéant fourrure. </li><li> Saisir délicatement la malléole externe, malléole interne, et la moitié inférieure du tibia avec l&#39;index et le eUMB, puis la jambe coude (combinaison de flexion et de rotation latérale, de telle sorte que le genou est visible et accessible. </li><li> Mouiller avec de l&#39;EtOH 70% d&#39;accroître la visibilité du sous-jacent ligament rotulien, qui doit être visible en tant que distinct, épaisse ligne blanche. Tout en saisissant fermement la cheville / pied d&#39;insert souris 28g ½ aiguille sous la rotule, par l&#39;intermédiaire du ligament rotulien, et dans la zone intercondylienne en haut antérieure du tibia. </li><li> Lors de l&#39;insertion d&#39;aiguilles dans le tibia, guider attentivement à travers la plaque de croissance en utilisant une pression constante et ferme avec une légère action de forage. </li><li> Lors de la pénétration de la plaque de croissance du tibia, l&#39;aiguille se heurter à une résistance nettement moins. </li><li> Utilisez un léger mouvement latéral de l&#39;aiguille afin d&#39;assurer l&#39;aiguille est dans le tibia et à travers la plaque de croissance. Mouvement sera limité si l&#39;aiguille est en place au sein du tibia. </li><li> Enfoncez lentement le piston pour injecter 10 ul de solution cellulaire. Peu ou pas de résistance doit se faire sentir à ce point. </li><li> Slowly extraire l&#39;aiguille. </li><li> Selon la même procédure, passez à l&#39;étape suivante pour injecter 10 ul de PBS. </li><li> Enlevez la souris de l&#39;anesthésie et de garder le coussin chauffant jusqu&#39;à récupéré. </li><li> Surveiller les souris au cours de la prochaine 24 heures et injecter Buprenex supplémentaire toutes les 12 heures si les animaux continuent à montrer des signes de détresse. </li></ol> 5. Cours de temps d&#39;imagerie <ol><li> Imagerie luciférase: Le cas échéant, l&#39;imagerie luciférase devraient être utilisés à partir de 7 jours après l&#39;inoculation cellulaire post-tumorale (bien que dans la plupart des modèles de métastases osseuses, détectables près de 14 jours). Souris est injecté par voie intrapéritonéale de 150 mg / kg luciférine, anesthésié, et imagée 8 min après l&#39;injection à l&#39;aide IVIS équipement 8. </li><li> GFP imagerie: En règle générale exprimant la GFP tumeurs commencent à être détectable autour du jour 10-14 pour injections intratibial et 16-21 pour les expériences utilisant intracardiaques Maestro équipement d&#39;imagerie (CRi) 9. En bref, les souris sont anesthésiés à l&#39;isoflurane (3%) Et maintenu sous anesthésie à travers un cône de nez dans la chambre Maestro imagerie. Pour nos cellules exprimant eGFP nous utilisons l&#39;ensemble filtre bleu (498 excitation/515 émission pour eGFP) à 500 ms exposition par pas de 10 nm. </li><li> Faxitron (rayons X): les rayons X sont prises hebdomadaires de départ entre 7 à 14 jours. Les lésions sont visibles dans le modèle intracardiaque au jour 21 et une semaine plus tôt dans le intratibial injections 3. Nos données radiographiques ex vivo et in vivo ont été acquises avec un Faxitron LX-60 à 35 kV pendant 8 secondes d&#39;exposition. </li><li> Imagerie Autre: modalités d&#39;imagerie sera entièrement basé sur la recherche spécifique. En plus des méthodes ci-dessus, l&#39;imagerie des animaux vivants 3D basé sur la micro-tomographie assistée par ordinateur (μCT), tomographie par émission de micro-positons (μPET), et d&#39;autres modalités 10,11 peuvent fournir des informations précieuses. </li></ol> 6. Sacrifice de la souris <ol><li> Chaque modèle dispose d&#39;un cours à temps légèrement différent. Avec MDA-MB-2Souris 31 cellules deviennent habituellement cachectiques ou paraplégique entre 21 et 35 jours et habituellement environ 28 jours (IT injecté des souris entre 21-28 jours). </li><li> Une fois que plusieurs souris développent des lésions qui commencent à percer l&#39;os cortical, devenu paraplégique, ou perdre entre 10-20% du poids corporel, sacrifiez toutes les souris dans l&#39;étude utilisant la kétamine / xylazine surdosage à la dislocation cervicale (ou autre méthode approuvée IACUC). </li><li> Enlever les os pour poursuivre des études et de stocker dans un tampon formol à 4%. </li><li> Souris présentant des tumeurs thoraciques sont le signe d&#39;une injection oubliée et devraient être exclus de l&#39;étude. </li></ol> 7. Analyse ex vivo <ol><li> μCT: balayage dans EtOH 70% permet de paramètres structurels et histologique à mesurer sur l&#39;échantillon un même os. </li><li> Contour et analyser en fonction de la conception expérimentale individuelle et de l&#39;équipement disponible 10. Nos données ont été obtenues avec un μCT Scanco 40 en utilisant une résolution de 12 uM. </li><li> Histomorphometry: spécimens de processus utilisant les méthodes préférées histologiques et colorer avec hématoxyline / éosine 7 </li></ol> 8. Les résultats représentatifs Après inoculation intracardiaque ou intratibial des cellules tumorales (figure 1) souris sont suivis chaque semaine par la radiographie et la fluorescence (ou luminescence). Les lésions se manifestent normalement par x-ray entre la semaine 2 et 3, alors qu&#39;elles peuvent être visibles par fluorescence et la luminescence dès la semaine 2, selon le modèle (Figure 2). Les lésions sont visibles comme des trous noirs dans l&#39;os, et s&#39;accentuer avec le temps (figure 3). Les lésions ont été quantifiées en utilisant une analyse Metamorph des radiographies et la fluorescence a été quantifiée avec une carte Maestro (CRi) d&#39;imagerie logiciel d&#39;acquisition et d&#39;analyse. Comme les lésions commencent à se développer, les souris deviennent souvent cachectiques. Le sacrifice est nécessaire lorsque les souris ont perdu entre 10-20% de leur poids initial. L&#39;état de l&#39;<html> souris peuvent changer rapidement et doivent être surveillés à plusieurs reprises pendant la journée. Entre 3-4 semaines souris ont commencé à faire glisser un ou les deux membres postérieurs et toute l&#39;étude a été sacrifié. Les images ont été prises avant le sacrifice. Après une surdose d&#39;anesthésie, le sang a été recueilli pour mesurer les marqueurs du remodelage osseux ou d&#39;autres facteurs. Après la dislocation cervicale, la peau a été retirée de la souris et en os excisés et nettoyé pour l&#39;imagerie ex vivo (figure 3) qui permettra la visualisation des foyers tumoraux au moins 7 jours plus tôt que dans les techniques d&#39;imagerie in vivo. Une fois que l&#39;imagerie des os a été dûment remplis ont été placés dans des cassettes étiquetés et entreposés dans du formol pour la fixation et le traitement ultérieur histologique ou l&#39;analyse μCT. Histomorphométrie a été effectuée sur les échantillons pour indiquer la charge tumorale et BV / TV après μCT a été réalisée sur un tibia de quantifier l&#39;ampleur de la destruction osseuse (figure 4). / 4260/4260fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Mise en place correcte de l&#39;injection. Ventrale vue radiographique (A) du thorax de la souris adulte montrant un placement correct de l&#39;aiguille dans l&#39;espace intercostal et 4 ème dans le ventricule gauche pour l&#39;inoculation intracardiaque. Les repères anatomiques sont représentés avec des lignes horizontales en pointillés sur le sternum (contour blanc). Sur la peau de la souris la fourchette sternale et le processus xiphoïde servir de points de repère, et l&#39;aiguille est insérée légèrement à gauche du sternum. Vue radiographique ventrale (B) de la jambe de la souris adulte présentant un placement correct de l&#39;aiguille dans le tibia proximal, alignées entre les condyles. Du point de vue latéral de la pointe de l&#39;aiguille est placé derrière la tubérosité tibiale et profonde à la plaque épiphysaire. Situation idéale pour injection est représenté par un cercle blanc. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig2.jpg" /> Figure 2. Évolution dans le temps des modèles de métastases osseuses. Progression du CAmaladie osseuse induite par ncer montré avec les rayons X et la GFP + images de fluorescence des tumeurs in vivo à partir intratibial injections (A) et intracardiaque injections (B). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig3.jpg" /> Figure 3. Évolution dans le temps des intracardiaque MDA-MB-231 modèle Rangée du haut:. L&#39;image ex vivo montrant fluorescence de la GFP au jour 0, 14, 21, et 28 jours après l&#39;injection intracardiaque de cellules MDA-MB-231. Notez que foyers tumoraux à 14 jours ne sont visibles qu&#39;en ex vivo après le retrait des tissus mous. Rangée du bas: les images radiographiques ex vivo des fémurs mêmes illustrant des lésions osseuses ostéolytiques. Notez que la destruction osseuse n&#39;est généralement pas visible jusqu&#39;à 3 semaines après l&#39;injection cardiaque. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4260/4260fig4.jpg" /> Figure 4. Quantification de l&#39;os progression. Métastatique GFP + tumeur visualisée par imagerie ex vivo Maestro de tibiae de souris portant pas de tumeur (A) et une souris 4 semaines après l&#39;injection intracardiaque d&#39;une GFP exprimant MDA-MB-231 clone (B). Foyers tumoraux en corrélation avec les zones de destruction osseuse, comme indiqué par Faxitron (D) par rapport un os sans tumeur (C). Les données de structure osseuse et minéral à partir des mesures microCT est rendu sous la forme d&#39;images en 3D d&#39;un os sain (e) et un palier tumeur osseuse (F), où les zones de destruction osseuse sont présentés comme zone de vide. De plus amples informations os et tumeur est vu en H &amp; E correspondant coupes histologiques colorées (G et H).

<ol>
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Cancer Res. , (2012).</li><li>Yoneda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actions+of+bisphosphonate+on+bone+metastasis+in+animal+models+of+breast+carcinoma.">Actions of bisphosphonate on bone metastasis in animal models of breast carcinoma.</a> Cancer. 88, 2979-2988 (2000).</li><li>Rose, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoactivin+promotes+breast+cancer+metastasis+to+bone.">Osteoactivin promotes breast cancer metastasis to bone.</a> Mol. Cancer Res. 5, 1001-1014 (2007).</li><li>Sterling, J. 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Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).</li><li>Oyajobi, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+effects+of+macrophage+inflammatory+protein-1alpha+on+osteolysis+and+tumor+burden+in+the+murine+5TGM1+model+of+myeloma+bone+disease.">Dual effects of macrophage inflammatory protein-1alpha on osteolysis and tumor burden in the murine 5TGM1 model of myeloma bone disease.</a> Blood. 102, 311-319 (2003).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les études sur les maladies osseuses d&#39;origine tumorale s&#39;appuyer sur plusieurs modèles animaux dont les deux les plus couramment utilisés sont les inoculations intracardiaques et intratibial. Dans de nombreux cas intracardiaque est la meilleure option pour l&#39;étude des métastases osseuses, mais il ne représente pas l&#39;ensemble du processus métastatique, et donc du coussinet adipeux mammaire ou autres injections orthotopiques devraient idéalement être utilisés à cette fin. Les cellules tumorales...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 cellules humaines de cancer du sein </td><td> A l&#39;origine ATCC-cloné interne et sélectionné </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech Inc </td><td> 21-040 CV- </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Atlas biologique </td><td> F-0050A </td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> GIBCO </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> Faxitron </td><td> Faxitron </td><td></td></tr><tr><td> Maestro </td><td> CRi </td><td></td></tr><tr><td> μCT scanner </td><td> Scanco </td><td></td></tr><tr><td> Des souris nues athymiques </td><td> Harlan </td><td> Fox nu - / - </td></tr><tr><td> Seringues à insuline (300 ul, 28,5 g) </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309300 </td></tr><tr><td> IVIS </td><td> Pied à coulisse </td><td></td></tr><tr><td> Diet rongeurs irradié </td><td> Teklad </td><td> 2920x </td></tr></tbody></table>

models of bone metastasis

Les métastases osseuses sont un phénomène fréquent dans les tumeurs malignes, y compris plusieurs seins, la prostate et du poumon. Une fois mis en place dans les os, les tumeurs sont responsables d&#39;une morbidité et une mortalité importantes 1. Ainsi, il existe un besoin important de comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent l&#39;établissement, la croissance et l&#39;activité des tumeurs dans les os. Plusieurs modèles in vivo ont été mis en place pour étudier ces événements et chacun présente des avantages et des limitations spécifiques. Le modèle le plus couramment utilisé utilise inoculation intracardiaque de cellules tumorales directement dans l&#39;approvisionnement en sang artériel de athymiques (nude) BalbC souris. Cette procédure peut être appliquée à de nombreux types de tumeurs différentes (y compris les PC-3 cancer de la prostate, cancer du poumon et les tumeurs mammaires de souris coussinet adipeux), mais dans ce manuscrit, nous nous concentrerons sur le modèle du cancer du sein MDA-MB-231. Dans ce modèle, nous utilisons un clone fortement os sélective, à l&#39;origine dérivé dans le groupe du Dr Mundy à San Antonio 2, que hque depuis été transfectées pour l&#39;expression de la GFP et re-cloné par notre groupe 3. Ce clone est une variante osseuse métastatique avec un taux élevé de métastases ostéotropisme et très peu de poumon, du foie ou des glandes surrénales. Alors que les injections intracardiaques sont les plus couramment utilisés pour les études de métastases osseuses 2, dans certains cas intratibial 4 ou mammaire injections coussinet adipeux sont plus appropriées. Injections intracardiaques sont généralement effectuées lors de l&#39;utilisation des cellules tumorales humaines dans le but de surveiller stades de métastases, en particulier la capacité des cellules cancéreuses à l&#39;arrestation de l&#39;os, de survivre, proliférer et établir des tumeurs qui se développent dans la maladie osseuse induite par le cancer. Intratibial injections sont effectuées si la focalisation sur la relation entre les cellules cancéreuses et les os, après une tumeur a métastasé aux os, ce qui correspond à peu près à la maladie osseuse métastatique établi. Aucun de ces modèles récapitule les premières étapes du processus métastatique avant l&#39;embolie et l&#39;entréedes cellules tumorales dans la circulation. Si surveiller la croissance des tumeurs primaires ou de métastases à partir du site principal de l&#39;os, puis mammaires inoculations coussinet adipeux sont généralement préféré, mais très peu de lignées cellulaires tumorales de manière constante métastaser à l&#39;os à partir du site primaire, avec 4T1 os préférentiels clones, un mammaire de la souris carcinome, l&#39;exception étant 5,6. Ces procédures manuscrits inoculation détails et les étapes clés dans l&#39;analyse met en évidence après l&#39;inoculation. Plus précisément, il comprend la culture de cellules, tumorales procédures d&#39;inoculation de cellules pour des inoculations intracardiaques et intratibial, ainsi que de brèves informations concernant le suivi hebdomadaire par rayons X, fluorescence et analyses histomorphométriques.

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Models of Bone Metastasis

Les modèles animaux sont fréquemment utilisés pour étudier la métastase du cancer de l&#39;os. Dans ce protocole, nous allons décrire deux méthodes courantes de inoculation de la tumeur pour les études de métastases osseuses et décrire brièvement quelques-unes des analyses utilisés pour surveiller et quantifier ces modèles.

Modèles de métastases osseuses

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

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Medicine

41.9K vues.  Vanderbilt University. Les modèles animaux sont fréquemment utilisés pour étudier la métastase du cancer de l'os. Dans ce protocole, nous allons décrire deux méthodes courantes de inoculation de la tumeur pour les études de métastases osseuses et décrire brièvement quelques-unes des analyses utilisés pour surveiller et quantifier ces modèles.

Vidéo: Models of Bone Metastasis

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Assay Métastases expérimentales

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

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Médecine

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

Test in vitro avec dégagement mésothéliales que les modèles les étapes précoces de métastases du cancer de l&#39;ovaire

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multi-modale d&#39;imagerie de l&#39;angiogenèse dans un modèle de rat nu des métastases osseuses du cancer du sein par imagerie par résonance magnétique, la tomodensitométrie et volumétrique ultrasons

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

Évaluation pré-clinique des inhibiteurs de tyrosine kinase pour le traitement de la leucémie aiguë

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un modèle murin orthotopique de cancer de la prostate humain métastases

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Adjustable Stiffness, External Fixator for the Rat Femur Osteotomy and Segmental Bone Defect Models

The mechanical environment around the healing of broken bone is very important as it determines the way the fracture will heal. Over the past decade there has been great clinical interest in improving bone healing by altering the mechanical environment through the fixation stability around the lesion. One constraint of preclinical animal research in this area is the lack of experimental control over the local mechanical environment within a large segmental defect as well as osteotomies as they heal. In this paper we report on the design and use of an external fixator to study the healing of large segmental bone defects or osteotomies. This device not only allows for controlled axial stiffness on the bone lesion as it heals, but it also enables the change of stiffness during the healing process in vivo. The conducted experiments have shown that the fixators were able to maintain a 5 mm femoral defect gap in rats in vivo during unrestricted cage activity for at least 8 weeks. Likewise, we observed no distortion or infections, including pin infections during the entire healing period. These results demonstrate that our newly developed external fixator was able to achieve reproducible and standardized stabilization, and the alteration of the mechanical environment of in vivo rat large bone defects and various size osteotomies. This confirms that the external fixation device is well suited for preclinical research investigations using a rat model in the field of bone regeneration and repair.

One constraint of preclinical research in the field of bone repair is the lack of experimental control over the local mechanical environment within a healing bone lesion. We report the design and use of an external fixator for bone repair with the ability to change fixator stiffness in vivo.

Rigidité réglable, fixateur externe pour les modèles Rat fémur ostéotomie segmentaire et défauts osseux

The mechanical environment around the healing of broken bone is very important as it determines the way the fracture will heal. Over the past decade there ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Haute fréquence imagerie par ultrasons de souris cervicales ganglions lymphatiques

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

A "Patient-Like" Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of cancer metastasis are still unclear. Animal models are essential for elucidating the mechanisms and for evaluating novel strategies for the treatment of metastatic cancers. Here, an in-depth description of a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model for exploring the mechanisms of metastasis of solid organ tumors is provided. The survival surgical implantation of BNL 1ME A.7R.1 mouse hepatocellular carcinoma cells directly into the liver (the organ of origin) of the inbred wild-type immune competent laboratory mouse strain, BALB/c is described. The success and reproducibility of this methodology recommends it for widespread use in elucidating the biological mechanisms of solid organ cancer metastasis.

A &quot;Patient-Like&quot; Orthotopic Syngeneic Mouse Model of Hepatocellular Carcinoma Metastasis

The metastatic spread of cancer is the major cause of cancer-related deaths. We provide an in-depth description of our survival surgery methodology for establishing a &#8220;patient-like&#8221; orthotopic syngeneic mouse model system for studying the mechanisms of metastasis in solid organ tumors.

Un «Patient-Like&quot; Orthotopique Syngénique modèle de souris de carcinome hépatocellulaire Métastases

The majority of cancer-related deaths are caused by the metastasis of the cancer rather than the primary tumor itself. Yet, the underlying mechanisms of ...

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Quantification du commerce intra-péritonéale Cancer de l&#39;ovaire Métastase

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Évaluation des métastases pulmonaires chez la souris tumeur mammaire modèles par PCR quantitative en temps réel

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...