L&#39;imagerie in vivo a été réalisée à l&#39;aide du SIIV de ressources partagées à l&#39;Université du Colorado Cancer Center (soutenu par subvention P30-CA046934). Cytométrie en flux a été réalisée à la cytométrie en flux de ressources partagées, de l&#39;Université du Colorado Cancer Center (soutenu par subvention P30CA046934). Ce travail a été financé en partie par les Instituts nationaux de sanitaires (RO1CA137078 à DKG). Antipatinage est membre du programme de développement scientifique de pédiatrie, soutenue par des subventions de l&#39;American Academy of Pediatrics, l&#39;American Pediatric Society, et l&#39;Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health et le développement humain (K12-HD000850).

Toutes les expériences impliquant des animaux ont suivi les normes réglementaires approuvées par l&#39;Université de comité de protection et d&#39;utilisation des animaux Colorado. Le protocole a été approuvé par démontré l&#39;Université de comité de protection et d&#39;utilisation des animaux Colorado. Une. Phospho-protéine Western Blot <ol><li> Préparation des lysats <ol><li> des lignées cellulaires de culture exprimant le récepteur tyrosine kinase d&#39;intérêt. Récupération des cellules et la plaque 3-5 x 10 6 cellules / échantillon dans 400 pi de milieu de croissance dans une boîte de culture tissulaire à 48 puits. Incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant 2-3 heures. </li><li> Ajouter 100 ul de solution 5x TKI dans un milieu de croissance et laisser incuber pendant 60 min. </li><li> Préparer le tampon de lyse avec de l&#39;HEPES 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, 10% (v / v) de glycerol, 1% (v / v) de Triton X-100, et les inhibiteurs de protéase. Si les cultures ne seront pas traités avec pervanadate avant la récolte, ajouter des inhibiteurs de phosphatase (de orthova 1 mM de sodiumnadate et 0,1 mM de molybdate de sodium) à un tampon de lyse. </li><li> Préparer pervanadate (PV) solution de l&#39;inhibiteur de la phosphatase, immédiatement avant utilisation. Préparer une solution à 0,3% de peroxyde d&#39;hydrogène (ATTENTION) dans une solution saline froide tamponnée au phosphate (PBS) dans un tube sombre sur la glace (1:100 dilution d&#39;une solution mère à 30%). Faire bouillir une aliquote de 0,2 M orthovanadate de sodium (OV, ATTENTION) solution mère pendant 5 min. Diluer à 1:10 dans du PBS pour obtenir une solution 20 mM de OV à la température ambiante (RT). Mélanger 0,3% de peroxyde d&#39;hydrogène et de 20 mM OV 01:01 et incuber dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 20 min. </li><li> Diluer PV en milieu complet (60 pi PV + 940 moyen pi). Ajouter 100 pi de PV dilué / bien. Incuber à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant 3 minutes, puis placez la plaque sur la glace. </li><li> Récolter les cellules dans des tubes de microcentrifugation à froid à 2500 rpm pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre les cellules dans 120 ul de tampon de lyse. Incuber sur de la glace pendant 15 min. Clarifier le lysat dans une micro-froid à 6000 rpm pendant 3 min. Transfert supernatant dans un nouveau tube froid. Conserver à -80 ° C. </li></ol></li><li> Immunoprécipitation <ol><li> Centrifuger les billes de protéine G sépharose à centrifuger à 1000 rpm pendant 1 min. Retirer le surnageant et laver perles 2x avec 1 ml de PBS froid. Ajouter un volume égal de PBS pour faire une bouillie de 50%. Ajouter l&#39;anticorps primaire et 20 ul de 50% des perles de protéine G pour chaque échantillon. Incuber pendant 2 heures - O / N à 4 ° C sur un agitateur. </li><li> Pulse bas perles dans une micro-froid à 9000 tours par minute. Retirer le surnageant et laver perles 2x avec 150 pi de tampon de lyse froid. Spin dans centrifuger à froid à 1000 rpm pendant 1 min. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 20 ul d&#39;échantillon 2X SDS tampon avec le 2-mercaptoéthanol (ATTENTION). Utiliser immédiatement ou conserver à -80 ° C. </li><li> Échantillons de faire bouillir pendant 5 min et course sur un gel de tris-glycine SDS-PAGE. Transférer les protéines sur une membrane de nitrocellulose et de détecter les phospho-protéine par transfert de Western. </li><li> Rincer blot à l&#39;eau puis incuber à 2% de SDS, Tris 62,5 mM (pH 6,8), 0.1 M β-mercaptoéthanol (ATTENTION) pendant 30 min à 50 ° C. Rincer avec de l&#39;eau 2x, puis laver à 60-90 min à 5-6 changements de TBS-T pour éliminer la solution de décapage. </li><li> Détecter la protéine totale par western blot. </li></ol></li></ol> 2. Méthylcellulose Assay <ol><li> Aliquote de 4 ml de milieu de base humaine méthylcellulose dans 50 ml tubes coniques à l&#39;aide d&#39;une aiguille émoussée grand alésage final stérile. (Remarque:. Méthylcellulose peut être aliquote et stocké à -20 ° C. Décongeler à RT O / N avant de l&#39;utiliser) </li><li> Ajouter 500 pl de 10x TKI ou un véhicule dans un milieu de croissance à 4 ml de la méthylcellulose et de mélange au vortex pendant 10 s. </li><li> La récolte des cellules et de comptage. Préparer une suspension de cellules dans un milieu de croissance à une concentration qui est 10 fois supérieure à la concentration cellulaire finale. Ajouter 500 pi de suspension cellulaire à mélange de méthylcellulose. Vortex pendant 10 secondes et laisser reposer pendant 10 min pour éliminer les bulles. </li><li> Dresser 4 ml de mélange de méthylcellulose en utilisant une seringue de 5 ml et stérile large portait aiguille extrémité émoussée. Éviter de tirer des bulles. Distribuer 1 ml du mélange de méthylcellulose dans le centre de trois 35 mm des plaques de culture de tissus. Agiter les plats jusqu&#39;à ce que le fond est entièrement recouvert de méthylcellulose. </li><li> Pour chaque plaque de la méthylcellulose, de préparer une plaque de culture tissulaire stériles de 10 cm avec deux 35 mm des plaques de culture de tissus supplémentaires remplis avec de l&#39;eau stérile afin d&#39;assurer un environnement humide. Placer les cultures dans l&#39;incubateur à chemise d&#39;eau à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant 10 à 14 jours. </li><li> Compter les colonies après 1-2 semaines. Colonies devraient être plus de 20 cellules et ne se chevauchent pas. Les colonies peuvent être comptées en utilisant un microscope inversé équipé d&#39;une platine de microscope avec une grille ou à l&#39;aide d&#39;un compteur de colonies automatisé. Changements dans la taille de la colonie ou la morphologie de réponse au traitement par TKI doivent également être évalués. Pour améliorer la détection de compteur de colonies, les colonies de coloration en ajoutant de 60 à 100 ul de (3 - (4,5-diméthyl-2-thiazolyl) -2,5-diphényl-2H-tétrazolium bromure solution (MTT, 5 mg / ml en H 2 O, conserver à -20 ° C, protéger de la lumière, ATTENTION) goutte à goutte sur la surface de chaque plaque et incuber pendant 8 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2. </li></ol> 3. Agar mou Assay <ol><li> Préparer agar noble de 1% pour la couche inférieure, noble agar 0,7% pour la couche supérieure et 2x milieu de croissance. Équilibrer un milieu de croissance 2x dans un bain d&#39;eau à 42 °. Chauffer 1% et noble 0,7% de gélose dans un micro-ondes (environ 1 min/100 ml) et s&#39;équilibrer dans un bain d&#39;eau à 42 ° C. Mélanger des parties égales de 1% d&#39;agar et 2x moyen et séparément 0,7% d&#39;agar et 2x moyen dans 50 ml Coniques. Régime de 10 ml de mélange / plaque de six puits agar mou pour chaque couche. </li><li> Étiquette à 6 puits des plaques de culture tissulaire. Remplir chaque puits avec 1,5 ml de 1% mélange agar mou. Éviter les bulles pendant le placage. Plaques sèches avec des couvercles hors de hotte stérile pendant 30 min. </li><li> Compter les cellules. Préparer une suspension de cellules dans un milieu de croissance à une concentration, qui est 500x plus élevée que la concentrati cellulaire finalesur. Ajouter la suspension de cellules au mélange de l&#39;agar à 0,7%, bien mélanger et distribuer 1,5 ml du mélange de cellules sur de la gélose au sommet de la couche d&#39;agar à 1%. Laissez la couche supérieure solidifier pendant 30 min. </li><li> Préparer un milieu de croissance contenant 1x TKI ou de contrôle du véhicule. Ajouter 2 ml de milieu avec la concentration désirée de TKI sur le dessus de la couche supérieure de gélose. </li><li> Incuber les cultures pendant 10 jours à 37 ° C dans 5% de CO 2. Retirer et remplacer le milieu recouvrant tous les 3 jours. </li><li> Lorsque les colonies sont visibles à l&#39;œil nu, moyen d&#39;aspiration recouvrant et ajouter une solution de bleu nitro-tétrazolium 200 pi (1 mg / ml de NBT en H 2 O, conserver à 4 ° C, protéger de la lumière, ATTENTION). Retour à l&#39;incubateur pendant 24-48 h. Déplacer à 4 ° C pendant au moins 2 heures avant le comptage. Souillé plaques peuvent être stockées à 4 ° C pendant un mois. Compter les colonies à l&#39;aide d&#39;un microscope ou un compteur de colonies automatisé. </li></ol> 4. Evaluation de Phospho-protéine Inhibition in vivo <ol><li> Recueillir caunes de plus en plus en phase de journal par centrifugation dans une centrifugeuse de dessus de table à 1500 rpm pendant 5 min. Laver les cellules une fois avec du PBS stérile et remettre en suspension dans du PBS à une concentration appropriée (typiquement 1 à 5 x 10 7 cellules / ml). cellules de la transplantation dans un volume de 100 ul dans 6-12 semaines vieilles souris NSG par injection intraveineuse dans la veine de la queue en utilisant un 28 G seringue à insuline. Placez l&#39;animal dans un dispositif de retenue, faire chauffer la queue dans un bécher d&#39;eau chaude pour dilater les veines, et nettoyer la queue avec un tampon de chlorhexidine avant l&#39;injection. Après l&#39;injection, appliquer une pression au site d&#39;injection à l&#39;aide de gaze stérile jusqu&#39;à ce que le saignement cesse. Transplantés au moins 3 animaux / groupe. Maintenir la souris sur l&#39;eau contenant 1 mg / ml de sulfate de gentamycine. </li><li> Quatorze jours après la transplantation, traiter les animaux avec TKI ou véhicule seulement et des échantillons de récolte pour l&#39;analyse de l&#39;inhibition de la cible. Peser les animaux et traiter avec une dose appropriée (mg / kg de poids corporel) de TKI ou véhicule. Administrer un traitement dans un volume de 5 ml / kg de poids corporel par voie intrapéritonéale (ip) ou par injection de 10 ml / kg de poids corporel par gavage oral. Pour injection ip, retenir la souris manuellement et injecter dans le quadrant inférieur droit de l&#39;abdomen avec une aiguille 29 G. Pour gavage oral, retenir la souris à la main et tenir l&#39;animal debout. Placer le tube de gavage dans la bouche sur la langue et à l&#39;arrière de la bouche. Appliquez une légère pression pour passer le tube dans l&#39;œsophage et dans l&#39;estomac. Appuyez sur le piston de la seringue pour administrer un traitement. Si le plongeur ne déprime pas facilement l&#39;aiguille de gavage doit être enlevé et repositionné. Préparer des formulations TKI immédiatement avant utilisation. </li><li> Si le traitement pervanadate est souhaitée, préparer une solution de PV 20 min avant la récolte, comme décrit ci-dessus (étape 1.1.4) et diluer dans un milieu avec 1 uM MgCl2 et 100 U / ml de DNase (120 pi PV + 880 pl de milieu). Remarque: PV est stable pendant au moins 1 heure après dilution. </li><li> Sacrifier des animaux en CO 2 narcose à l&#39;aptemps (s) de propriées de post-traitement. Disséquer fémurs en enlevant la fourrure, la peau et les muscles de la jambe entière de sorte que les os sont complètement exposés. Retirez les fémurs par clipsage de dissection ciseaux juste en dessous de l&#39;articulation de la hanche et de nouveau au-dessus de l&#39;articulation du genou. Transfert à une boîte de Pétri et rincer la moelle osseuse avec 1 ml de PBS froid ou solution PV dilué aide d&#39;une seringue et d&#39;une aiguille 27 G. Si le traitement avec PV, incuber à la température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 10 min. </li><li> Préparer lysats et analyser les niveaux de phospho-protéine et protéine totale, comme indiqué ci-dessus (étapes 1.1.6-1.2.5). </li><li> Quantifier phospho-protéine relative et les niveaux de protéine totale pour chaque échantillon en utilisant la densitométrie. Calculer phospho-protein/total-protein par rapport à la valeur moyenne de phospho-protein/total-protein pour les animaux traités avec le véhicule. </li></ol> 5. Evaluation de l&#39;activité anti-leucémique de TKI dans tous les modèles de xénogreffes <ol><li> Si nécessaire, exposer des souris à 200 cGy de rayonnement dans un irradiateur de RS-2000 prio un jourr à la transplantation. Transplant souris avec des lignées cellulaires de leucémie, comme décrit ci-dessus (étape 4.1). Greffe au moins 6 souris par groupe. Identifiez-souris à l&#39;oreille poinçon. Alternativement, un marqueur noir peut être utilisé pour identifier des souris avec des hachures sur leurs queues. Ajouter enrichissement de cages pour réduire le risque d&#39;agression cage de compagnon au cours de l&#39;étude. </li><li> Traiter les souris avec un TKI ou véhicule uniquement comme décrit ci-dessus (étape 4.2). Surveillance de l&#39;état de santé de souris quotidiennement par examen physique et la détermination du poids. Symptômes prévus de leucémie (diminution du niveau d&#39;activité, la perte de poids, paralysie des membres postérieurs, et les infections oculaires). La perte de poids de plus de 10% à 15% est généralement associée à la mort de la souris dans les deux jours et est généralement un critère de substitution en cas de décès, conformément aux exigences du IACUC standard. </li><li> Surveillance de la prise de greffe et le développement de la leucémie par une bioluminescence in vivo système d&#39;imagerie jusqu&#39;à 2x par semaine. Préparer une solution stock de D-luciférine 200x (30 mg / ml) dans sterile l&#39;eau. Mélanger doucement par retournement jusqu&#39;à ce que D-luciférine est complètement dissous. Utiliser immédiatement ou aliquote et le gel à -20 ° C. Avant l&#39;imagerie in vivo en utilisant un système d&#39;imagerie par bioluminescence dans, refroidir les parties aliquotes de D-luciférine à la température ambiante et diluée à 1:2 dans du PBS à une concentration finale de 15 mg / ml et stériliser par filtration à travers un filtre de 0,2 um. </li><li> Anesthésier la souris avant l&#39;imagerie avec 1,5% d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène inhalé. Surveillance de l&#39;anesthésie suffisante, caractérisé par la relaxation musculaire, perte de mouvement, et la perte de la réponse à la stimulation orteil-pincement. </li><li> Immédiatement avant l&#39;imagerie, l&#39;administration de 150 mg / kg de poids corporel D-luciférine par injection intrapéritonéale (10 ul de 15 mg / ml de luciférine / g de poids corporel). </li><li> Utilisez un système d&#39;imagerie par bioluminescence in vivo pour capturer 2 série d&#39;images séquentielles avec 30, 60 et 90 expositions sec et une image finale avec une exposition de 120 secondes. Après l&#39;exposition, le retour des souris dans des cages et surveiller pour la récupération de l&#39;anesthésie. En fonction de l&#39;intensité de bioluminescence, des temps d&#39;exposition peuvent varier. Temps d&#39;exposition optimales doivent être prédéterminés pour un modèle donné et maintenir la cohérence de telle sorte que les intensités de signal pour les points de temps individuelles sont comparables dans l&#39;ensemble de l&#39;étude. </li><li> Déterminer l&#39;intensité de la bioluminescence pour chaque souris en utilisant l&#39;image vivante de 3,2 acquisition et d&#39;analyse des logiciels. Déterminer le total des valeurs de flux mesurées en photons / seconde en dessinant des régions d&#39;intérêt (ROI) de taille identique sur chaque souris. </li><li> Sacrifier les souris par le CO 2 et l&#39;exposition dislocation cervicale si moribond, présentant une paralysie, dans le cas de plus de 15% de perte de poids, ou à la fin de l&#39;étude. Disséquer les souris et les observations d&#39;enregistrement (par exemple l&#39;élargissement de noeuds rate, le foie, ou lymphatiques; pâle moelle osseuse). Disséquer fémurs et rincer la moelle osseuse avec du PBS froid à l&#39;aide d&#39;une aiguille 27 G. </li><li> Recueillir les cellules dans une microcentrifugeuse à 2500 rpm pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans du PBS contenant 2% de FBS et incuber pendant 5 minutes à température ambiante.Recueillir les cellules et tache avec 20 mg / ml DAPI (4,6-Diamidino-2-phénylindole, 1:1000) et conjugué à du FITC α-hCD45 (1:100) ou IgG de souris de contrôle 1 isotype (1:100) . Évaluer la leucémie greffe par cytométrie de flux. Porte sur la population viable (DAPI négatif) et déterminer le pourcentage de CD45 + cellules blastes (% de la moelle osseuse). </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Ce manuscrit décrit une stratégie efficace pour l&#39;évaluation de nouveaux inhibiteurs de tyrosine kinase dans le traitement de la leucémie aiguë. En utilisant cette approche, les activités biochimiques et anti-leucémie sont évaluées en premier dans les tests cellulaires in vitro et dans des modèles de xénogreffe in vivo. analyse par immunotransfert a été utilisée avec succès pour démontrer l&#39;inhibition de la tyrosine kinase cible dans des cellules de leucémie après traitement a...

Leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est la tumeur maligne la plus fréquente chez les enfants 1,2. Le taux de survie globale pour pédiatrique ALL lignée B (B-ALL) est d&#39;environ 85%, mais les sous-types biologiques spécifiques, y compris T-ALL lignée (T-ALL), ont un pronostic plus pauvre encore, même avec les protocoles thérapeutiques actuels. Un traitement supplémentaire de rechute TOUT reste un défi 3. Bien que la majorité des patients adultes atteints de leucémie aiguë atteindre une rémission avec la chimiothérapie à l&#39;avance, de nombreux patients souffrent encore rechute 4. Chimiothérapies actuelles dans le traitement de la leucémie aiguë sont connus pour causer des effets secondaires à court et à long terme la toxicité associée. Par conséquent, les traitements moins toxiques qui ciblent spécifiquement les cellules cancéreuses avec un effet minimal sur les tissus normaux sont grandement nécessaires. Au cours des dernières années, l&#39;accent a été mis sur le développement de nouveaux agents moléculaires ciblés avec une spécificité pour les cellules cancéreuses, souvent en utilisant la chimie itératifde générer des composés actifs multiples qui doivent ensuite être comparés et priorisés 5. Ce manuscrit décrit une stratégie efficace pour l&#39;évaluation préclinique de TKIs pour le traitement de la leucémie aiguë, qui peut être utilisé pour l&#39;évaluation d&#39;un composé unique ou pour une comparaison directe de composés multiples, afin de faciliter le développement de médicaments. La méthode présentée ici se compose de quatre étapes. Tout d&#39;abord la substance biochimique (1) et anti-leucémie (2) les activités du composé (s) sont évalués dans une culture cellulaire, puis l&#39;inhibition de la cible est confirmé dans des modèles animaux (3), et l&#39;efficacité finalement thérapeutique du TKI (s) est déterminée dans des modèles de xénogreffe de leucémie orthotopique (4). Pour ces études, il est important de choisir des lignées cellulaires compétentes, qui sont des représentants de sous-types biologiques les plus fréquemment utilisés. Les lignées cellulaires doivent être choisis, qui à la fois, exprimer la cible d&#39;intérêt et n&#39;ont pas la cible d&#39;intérêt, afin de déterminer si les effets biologiques sont mediated par inhibition de la cible. Ceci est particulièrement pertinent pour le développement d&#39;inhibiteurs de petites molécules, qui ont des effets hors cible qui peuvent être importantes pour l&#39;activité anti-tumorale. Il est également nécessaire de choisir une lignée cellulaire qui est dépendante de la cible pour les effets fonctionnels tels que la prolifération ou la survie. Études de validation de cibles préliminaires (en dehors de la portée de cet article) en utilisant l&#39;interférence ARN ou d&#39;autres moyens spécifiques pour inhiber la cible peuvent être utilisés pour identifier des lignées de cellules cibles dépendant. Il est également souhaitable de choisir des lignées de cellules qui peuvent former des xénogreffes de souris, de telle sorte que les résultats de la culture de cellules peuvent être plus directement traduits à des expériences in vivo. Pour l&#39;évaluation de l&#39;activité biochimique médiée par EGFR dans les cellules de la leucémie, une diminution de la phosphorylation du récepteur peut être utilisé comme un indicateur de l&#39;inhibition de la cible. Analyse par Western blot ou ELISA dosages peuvent être employés, en fonction de la disponibilité et de la spécificité des anticorps.Si des anticorps ayant une spécificité suffisante pour que la cible sont disponibles, des tests ELISA sont préférables car ils sont plus efficaces et quantitative. Dans les cas où des anticorps ayant une spécificité suffisante pour le test ELISA ne sont pas disponibles, l&#39;analyse western blot peut être nécessaire. Dans ce cas, l&#39;immunoprécipitation d&#39;une grande quantité de lysat peut être utile pour la détection des cibles qui sont en faible abondance. Cette approche est particulièrement pertinente pour la mesure de phospho-protéines, qui peuvent avoir une demi-vie courte pour permettre des changements rapides dans la signalisation en réponse à des stimuli environnementaux. Certaines protéines phosphorylées sont extrêmement labile, très probablement en raison de la formation de complexes avec des phosphatases. Pour la détection fiable et cohérente de ces protéines phosphorylées, il peut également être possible de traiter les cellules avec pervanadate, un inhibiteur de protéine tyrosine phosphatase irréversible 6, pour stabiliser la protéine phospho-avant pour la préparation de lysats de cellules entières. Àdéterminer si l&#39;activité biochimique se traduit par des effets anti-tumoraux, des processus biologiques dépendant de cibles peuvent être contrôlés dans les expériences à base de cellules. Pour les lignées cellulaires de leucémie, activité anti-leucémie induite par TKI peut être évaluée en utilisant des dosages de formation de colonies en méthylcellulose effectuées sur gélose molle ou 7. L&#39;agar mou peut être préféré car il s&#39;agit d&#39;un milieu solide qui se prête mieux à une manipulation répétée si le traitement avec un TKI est nécessaire. Alors que de nombreux leucémie myloid (AML) lignées cellulaires aigus seront former des colonies en agar mou, la plupart des toutes les lignées cellulaires seront seulement forment des colonies dans de la méthylcellulose, qui est un milieu semi-solide. Bien qu&#39;il soit possible de rafraîchir moyen et / ou EGFR dans des cultures de méthylcellulose, seuls de petits volumes peuvent être utilisés et avec une fréquence limitée. De même, il est plus difficile pour colorer les colonies sans les perturber dans la méthylcellulose. Des études préliminaires doivent définir la capacité des lignées cellulaires appropriées pour former des colonies dans de la méthylcellulose et / ou de l&#39;agar mou et til densité optimale des cellules en culture de telle sorte que les colonies ne se chevauchent pas et en nombre suffisant pour obtenir des données statistiquement pertinentes (généralement 50-200 colonies par 35 mm plaque). Bien que des essais in vitro sont robustes et rentables, et ont des implications éthiques de moins que les expérimentations animales entières, l&#39;avancement de composés thérapeutiques nécessite une preuve de l&#39;efficacité et de la sécurité dans des modèles animaux. Pour les études in vivo, les lignées cellulaires de la leucémie aiguë humains peuvent être transplantées dans orthotopiquement NOD.Cg-PRKDC scid je l2rg tm1Wjl / SZJ des souris (NSG) et ITK peuvent être facilement administrés par injection ou par gavage oral. Certaines lignées cellulaires peuvent nécessiter l&#39;exposition de souris NSG à une faible dose de ligne cellulaire dépendante de rayonnement afin de xénogreffes d&#39;établir, et dans ce cas les souris ne peuvent pas tolérer gavage oral sans une période de récupération de 5-10 jours post-irradiation. Ce manuscrit décrit la génération de B-ALL et T-ALL xénogreffes aidedes lignées cellulaires spécifiques (697) et Jurkat comme exemples, mais peut être créé, des xénogreffes chez des souris NSG utilisant une grande variété de lignées cellulaires. Dans le cas où d&#39;autres lignées cellulaires sont plus applicables, l&#39;obligation pour l&#39;irradiation, le nombre optimal de cellules de greffe, et le moment d&#39;apparition et de progression de la maladie doit être déterminée expérimentalement. Idéalement, ces modèles auront pénétrance complète (tous les animaux transplantés développe une leucémie), la cinétique cohérentes (leucémie progresse de manière similaire chez tous les animaux), et une fenêtre de traitement raisonnable (idéalement 20 à 30 jours entre le début du traitement et le retrait de l&#39;étude en raison d&#39;une maladie) . Le nombre de cellules transplantées peut être augmentée afin d&#39;améliorer la cohérence et la pénétrance cinétique ou réduite afin d&#39;améliorer la fenêtre de traitement si nécessaire. Pour déterminer si l&#39;inhibition de EGFR médiation cible in vivo, les échantillons sont collectés à partir de souris atteintes de leucémie xénogreffes après traitement par TKI ou le véhicule seul. Idéalement, la dose d&#39;und schéma d&#39;administration pour ces expériences sont guidés par des études pharmacocinétiques, qui peuvent souvent être réalisées par des laboratoires commerciaux et sont en dehors du champ d&#39;application de cet article. Si les données pharmacocinétiques sont disponibles, la concentration du composé nécessaire pour une inhibition efficace de la cible dans une culture de cellules et la concentration sérique maximale après une dose unique de TKI peut être utilisé pour définir une dose de départ pour des études sur les animaux. Les études pharmacocinétiques peuvent également informer le calendrier de la collecte de l&#39;échantillon de post-traitement pour les études pharmacodynamiques et la voie d&#39;administration. L&#39;inhibition de la cible peut être évaluée dans n&#39;importe quel organe affecté, mais les tissus qui sont le plus facilement collectées et traitées sont préférables. Des lignées cellulaires de leucémie plus aigus établir dans le foie, la moelle osseuse, de la rate, du sang périphérique et du système nerveux central, bien que les organes spécifiques touchés et la mesure de la prise de greffe dans ces organes varient selon les modèles. Le protocole présenté ici évalue phosphinhibition o-protéine dans la moelle osseuse en utilisant une analyse Western blot, mais les organes solides peuvent être plus faciles à récolter constamment et nécessitent peu ou pas de traitement avant la congélation, ce qui permet moins de possibilités pour la dégradation de phospho-protéines pendant la collecte et le traitement des échantillons. L&#39;immunohistochimie peut être utilisée pour évaluer des tumeurs ou des organes affectés par la leucémie solides. Enfin, l&#39;efficacité thérapeutique de la TKI (s) est déterminée dans des modèles de xénogreffe de leucémie orthotopique. Pour ces études, le moment de l&#39;initiation du traitement peut varier, de sorte que la maladie est plus ou moins établi. Le traitement peut commencer immédiatement après la transplantation pour les études initiales et ensuite être retardé dans des études ultérieures jusqu&#39;à ce que la charge de morbidité importante est détectée de rapprocher plus étroitement un modèle de traitement de diagnostic. Idéalement, ces modèles animaux ont également la capacité pour la mesure non invasive de la charge de la maladie. Nous avons optimisé les méthodes pour l&#39;introduction de la lucifer luciolease gène dans des lignées cellulaires de leucémie à l&#39;aide de particules de type virus, ce qui permet, à l&#39;analyse non-invasive longitudinal de l&#39;apparition et de la progression et de l&#39;évaluation de la charge de la maladie de la moelle osseuse et les organes solides maladie. Cruciale de cette approche est l&#39;utilisation de lignées de cellules de luciférase monoclonaux marqués pour éviter la variabilité dans le développement de la leucémie exprimant la luciférase lié à l&#39;utilisation de lignées cellulaires polyclonales et est sans rapport avec le traitement par un ITK 8. Prises ensemble, ces mesures peuvent être utilisées pour l&#39;évaluation d&#39;un seul TKI ou pour une comparaison directe et le classement de plusieurs ITK. Bien que les protocoles présentés ici se concentrent sur le développement de ITK, ces méthodes peuvent être adaptées à d&#39;autres objectifs et considérations pour le développement de tests sont décrits. Ainsi, cette stratégie peut être plus largement applicable à l&#39;évaluation pré-clinique d&#39;agents moléculaires ciblées pour le traitement de la leucémie aiguë.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1065px;" width="1064">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:167px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:233px;">#02194057</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS07, H302-H318</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Sodium Orthovanadate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#S6508</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302+ H312+H332 </td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:443px;">2-Mercaptoethanol </td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M7522</td>
			<td style="width:223px;">GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">ColonyGel Human Base Medium </td>
			<td style="width:167px;">ReachBio</td>
			<td style="width:233px;">#1101</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#M5655</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Difco Noble Agar </td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:233px;">#214883</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Nitrotetrazolium Blue Chloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#N6639</td>
			<td style="width:223px;">GHS07, H302 </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">D-Luciferin Firefly, Potassium Salt</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#122796</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">4&#39;,6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D9542</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC CD45 </td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#347463</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">FITC Mouse IgG1 Isotype control</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#51-35404X-2</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Gentamycin Sulfate</td>
			<td style="width:167px;">Sparhawk</td>
			<td style="width:233px;">#NDC58005-633-04</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protease Inhibitors </td>
			<td style="width:167px;">Roche </td>
			<td style="width:233px;">#11836153001</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">DNase</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:233px;">#D4263 </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Protein G Beads</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:233px;">#10-1242</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Isofluran</td>
			<td style="width:167px;">VETONE</td>
			<td style="width:233px;">#NDC13985-030-60</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;"> </td>
			<td style="width:167px;"> </td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 35 mm &#215; H 10 mm</td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D7804-500EA</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm </td>
			<td style="width:167px;">Nunclon</td>
			<td style="width:233px;">#D8429-1CS</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">6-well plates</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#353046</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">14 gauge x 4 inch blunt-end needles</td>
			<td style="width:167px;">Cadence science</td>
			<td style="width:233px;">#7956</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">5 ml syringe with luer-lok</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309646</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">GelCount automated colony counter</td>
			<td style="width:167px;">Oxford Optronix</td>
			<td style="width:233px;"> </td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">In vivo bioluminescence imaging system</td>
			<td style="width:167px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:233px;">#IVIS200</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scout pro portable balances, scale</td>
			<td style="width:167px;">Ohaus</td>
			<td style="width:233px;">#SP202</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:443px;">Broome style rodent restrainer</td>
			<td style="width:167px;">Plas-labs</td>
			<td style="width:233px;">#551-BSRR</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Ear punch, punch diameter: 2 mm</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#24210-02</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Chlorhexidine swabs, Prevantics</td>
			<td style="width:167px;">PDI</td>
			<td style="width:233px;">#B10800</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2</td>
			<td style="width:167px;">Monoject </td>
			<td style="width:233px;">#8881500042</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile</td>
			<td style="width:167px;">Instech</td>
			<td style="width:233px;">#FTP-20-38</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">1 mL Luer-Lok disposable syringe</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#309628</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:443px;">Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x &#189;, permanently attached needle</td>
			<td style="width:167px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:233px;">#329465</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine bonn scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#14084-08</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Student fine scissors</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#91460-11</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Moria ultra fine forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11370-40</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Extra fine graefe forceps</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#11150-10</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10003-12</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:443px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:167px;">FST</td>
			<td style="width:233px;">#10011-00</td>
			<td style="width:223px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for treatment of acute leukemia

Les récepteurs tyrosine kinases ont été impliquées dans le développement et la progression de nombreux cancers, y compris la leucémie et les tumeurs solides, et sont des cibles thérapeutiques druggable attractifs. Nous décrivons ici une stratégie efficace en quatre étapes pour l&#39;évaluation préclinique des inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) dans le traitement de la leucémie aiguë. Dans un premier temps, l&#39;analyse western blot est utilisé pour confirmer l&#39;inhibition de la cible dans les cellules leucémiques en culture. L&#39;activité fonctionnelle est ensuite évaluée en utilisant des tests clonogéniques dans la méthylcellulose ou cultures agar mou. Composés expérimentaux qui montrent une activité dans des essais de culture de cellules sont évalués in vivo sur des souris NOD-SCID-gamma (NSG) des souris transplantées avec des lignées de cellules leucémiques humaines orthotopique. Vivo études initiales en pharmacodynamiques évaluer l&#39;inhibition de la cible dans les explosions isolées leucémiques de la moelle osseuse. Cette approche est utilisée pour déterminer la dose et le schéma d&#39;administration requis pour blocage cible efficaceion. Des études ultérieures évaluer l&#39;efficacité de l&#39;EGFR in vivo en utilisant des cellules exprimant la luciférase de la leucémie, permettant ainsi une surveillance non invasive de bioluminescence de la charge de la leucémie et de l&#39;évaluation de la réponse thérapeutique à l&#39;aide d&#39;un système d&#39;imagerie in vivo de la bioluminescence dans. Cette stratégie a été efficace pour l&#39;évaluation des inhibiteurs de tyrosine kinase in vitro et in vivo et peut être appliquée pour l&#39;identification d&#39;agents moléculaires ciblés à fort potentiel thérapeutique ou pour une comparaison directe et la priorisation des composés multiples.

Les analyses présentées ici d&#39;évaluer les effets biochimiques et fonctionnelles à médiation par EGFR et peuvent être utilisées pour classer les nouveaux composés basés sur le degré d&#39;inhibition de la cible in vitro et in vivo, la réduction de la formation de colonies, et le retard dans leucémogénèse chez la souris NSG transplantées avec la luciférase- marqué les cellules leucémiques. analyse par immunotransfert a été utilisée pour déterminer l&#39;inhib...

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Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Les récepteurs tyrosine kinases sont exprimés de façon ectopique dans de nombreux cancers et ont été identifiés en tant que cibles thérapeutiques dans la leucémie aiguë. Ce manuscrit décrit une stratégie efficace pour l&#39;évaluation préclinique des inhibiteurs de tyrosine kinase pour le traitement de la leucémie aiguë.

Évaluation pré-clinique des inhibiteurs de tyrosine kinase pour le traitement de la leucémie aiguë

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

pre-clinical-evaluation-tyrosine-kinase-inhibitors-for-treatment

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JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Medicine

Unit 1

Signaling Networks of Kinase Receptors

SCIENTISTS IN ACTION

18.0K vues.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  Les récepteurs tyrosine kinases sont exprimés de façon ectopique dans de nombreux cancers et ont été identifiés en tant que cibles thérapeutiques dans la leucémie aiguë. Ce manuscrit décrit une stratégie efficace pour l'évaluation préclinique des inhibiteurs de tyrosine kinase pour le traitement de la leucémie aiguë. 

Vidéo: Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

The Use of Pharmacological-challenge fMRI in Pre-clinical Research: Application to the 5-HT System

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel underlying neurobiological mechanisms behind drug action and neurotransmitter-related disorders, such as depression and ADHD. Like most of the imaging methods (PET, SPECT, CT) it represents a progress in the investigation of brain disorders and the related function of neurotransmitter pathways in a non-invasive way with respect of the overall neuronal connectivity. Moreover it also provides the ideal tool for translation to clinical investigations. MRI, while still behind in molecular imaging strategies compared to PET and SPECT, has the great advantage to have a high spatial resolution and no need for the injection of a contrast-agent or radio-labeled molecules, thereby avoiding the repetitive exposure to ionizing radiations. Functional MRI (fMRI) is extensively used in research and clinical setting, where it is generally combined with a psycho-motor task. phMRI is an adaptation of fMRI enabling the investigation of a specific neurotransmitter system, such as serotonin (5-HT), under physiological or pathological conditions following activation via administration of a specific challenging drug.
The aim of the method described here is to assess brain 5-HT function in free-breathing animals. By challenging the 5-HT system while simultaneously acquiring functional MR images over time, the response of the brain to this challenge can be visualized. Several studies in animals have already demonstrated that drug-induced increases in extracellular levels of e.g. 5-HT (releasing agents, selective re-uptake blockers, etc) evoke region-specific changes in blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signals (signal due to a change of the oxygenated/deoxygenated hemoglobin levels occurring during brain activation through an increase of the blood supply to supply the oxygen and glucose to the demanding neurons) providing an index of neurotransmitter function. It has also been shown that these effects can be reversed by treatments that decrease 5-HT availability16,13,18,7. In adult rats, BOLD signal changes following acute SSRI administration have been described in several 5-HT related brain regions, i.e. cortical areas, hippocampus, hypothalamus and thalamus9,16,15. Stimulation of the 5-HT system and its response to this challenge can be thus used as a measure of its function in both animals and humans2,11.

The goal of this technique is to assess serotonin (5-HT) neurotransmitter function in the live and free-breathing animal with pharmacological magnetic resonance imaging (phMRI) and an intravenous challenge with a selective serotonin reuptake inhibitor (SSRI), fluoxetine.

L&#39;utilisation de l&#39;IRMf pharmacologique-défi en recherche pré-clinique: Application à la System 5-HT

Pharmacological MRI (phMRI) is a new and promising method to study the effects of substances on brain function that can ultimately be used to unravel ...

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Médecine

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Un modèle de la vessie orthotopique tumorale et l&#39;évaluation de Sarna traitement intravésicale

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that participate in regenerating tissue, tumor formation, or vasculogenesis, we devised a multi-colored cellular transplant model of tumor development in which cell populations originate from different fluorescently colored reporter gene mice and are transplanted, engrafted or injected in and around a developing tumor. These colored cells are then recruited and incorporated into the tumor stroma. In order to quantitatively assess bone marrow derived tumor stromal cells, we transplanted GFP expressing transgenic whole bone marrow into lethally irradiated RFP expressing mice as approved by IACUC. 0ovarian tumors that were orthotopically injected into the transplanted mice were excised 6-8 weeks post engraftment and analyzed for bone marrow marker of origin (GFP) as well as antibody markers to detect tumor associated stroma using multispectral imaging techniques. We then adapted a methodology we call MIMicc- Multispectral Interrogation of Multiplexed cellular compositions, using multispectral unmixing of fluoroprobes to quantitatively assess which labeled cell came from which starting populations (based on original reporter gene labels), and as our ability to unmix 4, 5, 6 or more spectra per slide increases, we&#39;ve added additional immunohistochemistry associated with cell lineages or differentiation to increase precision. Utilizing software to detect co-localized multiplexed-fluorescent signals, tumor stromal populations can be traced, enumerated and characterized based on marker staining.1

Complex tissue masses, from organs to tumors, are composed of various cellular elements. We elucidated the contribution of cellular phenotypes within a tissue utilizing multi-labeled fluorescent transgenic mice in combination with multiparameter immunofluorescent staining followed by spectral unmixing to decipher cell origin as well as cell characteristics based on protein expression.

Analyse quantitative multispectrale Après transplantation de tissu fluorescent pour la visualisation des origines cellulaires, types et Interactions

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Manipulation du Rat coton en études pour l&#39;évaluation pré-clinique de virus oncolytiques

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Pré-clinique Orthotopique modèle murin de cancer de la prostate humaine

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers utilize a syringe pump to directly administer volatile anesthetics into a gas stream. Unlike a traditional vaporizer, it can be used at very low flow rates, making it ideal for use on mice and rats. 
The equipment's capability to use low flow rates could result in a substantial cost savings due to the reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal scavenging filters1. A lower flow rate means less waste of anesthetic gas and likely reduces the risk of anesthetic exposure to laboratory personnel. Thus, the high levels of precision and safety associated with direct injection vaporizers, along with a reduced need for anesthetic agents, compressed gas, and charcoal filters are beneficial for research requiring small animal anesthesia. 
The goal of this protocol is to demonstrate the use of a syringe-driven direct injection vaporizer as part of a digital, low-flow anesthesia system. The direct injection vaporizer is capable of accurately delivering anesthesia at very low flow rates compared to a traditional vaporizer, making it a promising alternative for controlled gas anesthetic delivery to rodents.

Here, we present a protocol to more safely and efficiently administer anesthetic gas to mice using a digital, low flow anesthesia system utilizing a syringe-driven direct injection vaporizer.

Utilisation d&#39;un système d&#39;anesthésie numérique à faible débit pour les souris et les rats

A traditional vaporizer depends on flowing gas and atmospheric pressure for passive anesthetic vaporization. Newly developed direct injection vaporizers ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

Un modèle aigu rétinienne pour l&#39;évaluation sanguin rétinien barrière Breach et potentiels médicaments pour le traitement

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

A Pre-Clinical Porcine Model of Orthotopic Heart Transplantation

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart failure. Multiple small-animal models of heart transplantation have been used to study the acute and long-term effects of novel therapies. However, few are tested and demonstrated success in clinical trials. It is of critical importance to evaluate new therapies in a clinically relevant large-animal model for efficient and reliable translation of basic studies&#39;&#160;findings. Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and previously used to investigate novel cardioprotective strategies. This procedure focuses on acute ischemia-reperfusion injury and is a reliable method to investigate novel interventions which have been tested and validated in smaller experimental models, such as the murine model. We demonstrate its usefulness in assessing cardiac performance during the early post-transplantation period and other potential possibilities enabled by the model.

Here, we describe a pre-clinical large-animal (porcine) model of orthotopic heart transplantation that has been firmly established and utilized to investigate novel cardioprotective strategies.

Un modèle porcin préclinique de transplantation orthotopic de coeur

Fifty-years following the first successful report, cardiac transplantation remains the gold-standard treatment for eligible patients with advanced heart ...

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after circulatory death (DCD) is a solution to address this limited availability, but due to a period of prolonged warm ischemia and the risk of tissue injury, its routine use in cardiac transplantation is seldom seen. In this manuscript we provide a detailed protocol closely mimicking current clinical practices in the context of DCD with continuous monitoring of heart function, allowing for the evaluation of novel cardioprotective strategies and interventions to decrease ischemia-reperfusion injury.
In this model, the DCD protocol is initiated in anesthetized Lewis rats by stopping ventilation to induce circulatory death. When systolic blood pressure drops below 30 mmHg, the warm ischemic time is initiated. After a pre-set warm ischemic period, hearts are flushed with a normothermic cardioplegic solution, procured, and mounted onto a Langendorff ex vivo heart perfusion system. Following 10 min of initial reperfusion and stabilization, cardiac reconditioning is continuously evaluated for 60 min using intraventricular pressure monitoring. A heart injury is assessed by measuring cardiac troponin T and the infarct size is quantified by histological staining. The warm ischemic time can be modulated and tailored to develop the desired amount of structural and functional damage. This simple protocol allows for the evaluation of different cardioprotective conditioning strategies introduced at the moment of cardioplegia, initial reperfusion and/or during ex vivo perfusion. Findings obtained from this protocol can be reproduced in large models, facilitating clinical translation.

This protocol shows a simple and flexible approach for the evaluation of new conditioning agents or strategies to increase the feasibility of cardiac donation after circulatory death.

Modèle préclinique du don cardiaque après la mort circulatoire

Cardiac transplantation demand is on the rise; nevertheless, organ availability is limited due to a paucity of suitable donors. Organ donation after ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. However, the evaluation of right ventricular pressure (RVP) and pulmonary artery pressure (PAP) remains technically challenging in mice. RVP and PAP are more difficult to measure than left ventricular pressure because of the anatomical differences between the left and right heart systems. In this paper, we describe a stable right heart hemodynamic measurement method and its validation using healthy and PAH mice. This method is based on open-chest surgery and mechanical ventilation support. It is a complicated procedure compared to closed chest procedures. While a well-trained surgeon is required for this surgery, the advantage of this procedure is that it can generate both RVP and PAP parameters at the same time, so it is a preferable procedure for the evaluation of PAH models.

Here, we present a protocol to perform an invasive hemodynamic assessment of the right ventricle and pulmonary artery in mice using an open-chest surgery approach.

Évaluation hémodynamique invasive pour le système ventriculaire droit et l'hypertension artérielle pulmonaire induite par l'hypoxie chez les souris

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...