Ce travail a été financé par la Société Max Planck.

1. Préparation de Matrigel recouvertes de plaques et médias <ol><li> Préparation de Matrigel enduit de Matrigel plaques a été trouvé pour être un substrat préféré pour la fixation de la différenciation EB et favorise également l&#39;excroissance efficace des neurones à partir de celles-ci 10. <ol><li> Décongeler 10 ml de nuit sur la glace Matrigel. </li><li> Le lendemain, diluer le Matrigel comme de la gelée avec deux volumes de glace-froid DMEM/F-12 et préparer des aliquotes de 1 ml à 15 ml prérefroidi tubes coniques qui peuvent être congelés à -20 ° C. </li><li> Décider sur un format de plaque pour la différenciation neuronale. Par exemple, comme point de départ, nous vous recommandons d&#39;effectuer une première série de différenciation dans un format de 12 puits. Pré-cool quatre plaques de 12 puits à 4 ° C. Dissoudre une aliquote de Matrigel congelés en ajoutant 9 ml de pré-réfrigérés DMEM/F-12 suivis par pipetage de haut en bas jusqu&#39;à ce que tout le Matrigel prédilué a dégelé et dissous. </li><li> Puis, Transférer le contenu dans un nouveau tube de 50 ml contenant 15 ml de DMEM/F-12 sur la glace (dilution finale Matrigel: 1:75). Ensuite, ajoutez 0,5 ml de Matrigel dilué dans chaque puits de la pré-refroidis plaques de 12 puits. Envelopper les plaques avec du Parafilm et laisser reposer une nuit à TA. </li><li> Le lendemain, le transfert des plaques à 4 ° C. Plaques revêtues peuvent être stockés pendant plusieurs semaines avant de l&#39;utiliser. </li></ol></li><li> Médias </li></ol> Moyennes formation EB (~ 15 ml nécessaire pour effectuer une différenciation dans une plaque de 96 puits - voir le tableau 1 et le schéma de la figure 2): DMEM/F-12 avec 0,4% (PVA) 1x N2 1x B27 0,05% de BSA 20 ng / ml de FGF2 10 uM Y-27632 1x PenStrepGln Milieu de différenciation (~ 30 ml nécessaire pour effectuer une différenciation dans une plaque de 96 puits, suivie de la formation des neurones dans un enduit de Matrigel de 12 puits de plaque, voir le tableau 1): DMEM/F-12 1x N2 <br/&gt; 1x B27 0,05% de BSA 0,5 uM PD0325901 15 SB431542 uM 0,5 uM Dorsomorphin 1x PenStrepGln 2. Formation EB forcé <ol><li> Cultivez hPSCs sous vos préférés alimentation sans conditions. Nous utilisons MEF milieu conditionné sur Matrigel recouvertes de plaques de 6 puits 15. Cependant, d&#39;autres systèmes de culture tels que maison ou commerciale milieux définis devrait aussi fonctionner. Au moment de commencer un essai de différenciation, hPSCs doit être sous-confluentes et en pleine croissance. </li><li> Eliminer mécaniquement spontanément colonies différenciées à l&#39;aide d&#39;une pipette stérile en plastique sous un microscope stéréo. </li><li> Laver autres colonies indifférenciées en utilisant du PBS, et digérer à des cellules uniques en utilisant Accutase contenant 1X Y-27632. Sédimenter les cellules individuelles par centrifugation à 200 xg pendant 2 min, remettre en suspension dans un petit volume de milieu de formation EB et déterminer titre cellule en utilisant une hématocytomètre. </li><li> Ajouter une fraction aliquote de cellules dele moyen EB restante formation d&#39;aboutir à un titre compris entre 40.000 et 80.000 cellules par ml. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, transférer 100 ul par puits dans une plaque 96V-bas, entraînant 4000 à 8000 cellules par puits. De spin 96-puits dans une centrifugeuse plaque plaque pivotant à 400 g pendant 1 min à prélever des cellules au fond du puits, et transférer à incubateur de culture cellulaire. EBS former une nuit, comme représenté sur la figure 1. </li></ol> 3. Induction neuroectoderme <ol><li> Le lendemain (jour 0), la collecte de la plaque EB 96V sous un microscope stéréo et le transfert dans un petit volume dans un plat 3,5 cm bactérienne contenant 2 ml de milieu de différenciation. Agiter doucement le plat pendant quelques secondes pour laver l&#39;EBS. </li><li> Ajouter 100 ul de milieu de différenciation par puits d&#39;un ultra-faible attachement U-96 puits à fond plat. Sous un stéréomicroscope, le transfert EB dans de petits volumes de la vaisselle dans le 96U-puits (un EB par nousll). Placez la plaque 96U en incubateur de culture cellulaire pendant 4 jours afin de permettre la formation neuroectoderme. </li></ol> 4. Formation neurone <ol><li> Au jour 4, préparer un plat à laver comme à l&#39;étape 3.1 et plus remplacer DMEM/F-12 dans un préchauffé Matrigel revêtu de plaque de 12 puits par un milieu de différenciation (1 ml par puits). </li><li> Placage de EB <ol><li> Recueillir EB de la plaque 96U, lavez-les de graines comme ci-dessus, et soigneusement un par un dans les puits de la Matrigel enduit la plaque de 12 puits (environ 8 EB par puits): EB doit être également répartie dans les puits pour permettre excroissance non perturbé de neurones au cours des prochains jours (voir &quot;jour 5&quot; image de la figure 2). </li><li> Avant le transfert de la plaque arrière de 12 puits dans l&#39;incubateur, permettent EB à fixer sans serrer pour environ 10 min à température ambiante. Ensuite, transférez à 12 puits de plaque de culture cellulaire incubateur. Les neurones se développent à partir de l&#39;EB plaqué de manière radiale dans les 4 prochains jours, comme shosentée en figure 2 («jour 8&quot; image de droite). </li></ol></li></ol> 5. Formation neurone comme monocouches <ol><li> Comme une alternative à la procédure du point 4), au jour 4 de la procédure, de recueillir EBS dans un plat 3,5 cm bactérienne contenant 2 ml de milieu de différenciation, puis de transférer EB dans un petit volume d&#39;un plat contenant du PBS, puis dans un autre plat contenant Accutase. </li><li> Laissez digérer à des cellules uniques, centrifuger à 200 xg pendant 2 min, remettre en suspension dans un petit volume de milieu de différenciation et de déterminer titre cellule en utilisant une hématocytomètre. Réglez titre de 1-2x10 6 cellules par ml en utilisant un milieu de différenciation (sans Y-27632). </li><li> Cellules de la plaque out en préchauffé Matrigel enduit de 12 puits plaque (1 ml par puits), et le transfert de culture cellulaire incubateur. Formation neurone sous forme de monocouches a été observée entre les jours 7 à 8 (figure 3C). Il convient de noter, toutefois, que cette variante monocouche dela procédure n&#39;est pas optimisée en ce qui concerne la survie des cellules et le substrat le plus approprié. </li></ol>

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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability.">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells. 25, 929-938 (2007).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells.">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability.">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6, e18293 (2011).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La plupart des protocoles de différenciation impliquant la formation EB à partir hPSCs, y compris notre procédure déjà publié 10, sont basées sur manuel ou assisté par une enzyme de récolte des CSEh sous forme d&#39;agrégats, ce qui conduit inévitablement à l&#39;hétérogénéité des tailles EB. Ce fait conduit à la variabilité de l&#39;efficacité différentiation avec certaines lignées cellulaires, ce qui rend difficile l&#39;analyse systématique, en particulier à l&#39;échelle de débit...

hPSCs, comprenant l&#39;embryon issu cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs), sont pluripotentes sens qu&#39;ils peuvent donner lieu à diverses lignées cellulaires in vitro 1-2. De nombreux types de cellules différenciées ont été dérivées de CSEh à ce jour, en soutenant l&#39;idée que ces cellules présentent des outils précieux pour la recherche scientifique et des approches de dépistage basés sur les cellules, et sont prometteuses pour des traitements à base de cellules. Protocoles de différenciation neuronale des CSEh sont généralement complexes et de longue haleine car ils sont souvent basées sur l&#39;ensemble induisant sort premier de neurones, suivie de l&#39;isolement manuel des progéniteurs neuronaux, et la différenciation terminale ultérieure dans un type de neurone d&#39;intérêt donné 3-6. À certains égards, cette complexité n&#39;est pas surprenant et inévitable, étant donné qu&#39;un tel état-of-the-art des protocoles de différenciation dirigés ont tendance à imiter les étapes de développement du jeune homme, which est en soi extrêmement complexe. D&#39;un autre côté, il peut aussi en partie le reflet de notre manque de compréhension des processus moléculaires sous-jacents, résultant dans des protocoles de différenciation qui sont encore loin d&#39;être pleinement optimisée. En ce qui concerne la conversion de hPSCs indifférenciées en neuroectoderme, Pera et al. constaté que la suppression de BMP / SMAD1/5/8 signalisation améliore l&#39;induction neurale de hESC 7. De plus, l&#39;inactivation de SMAD2 / 3 de signalisation a été montré pour favoriser 8 Formation neuroectoderme. Par conséquent, l&#39;inactivation combinée de ces deux voies a tendance à conduire à l&#39;induction neurale plus efficace des hPSCs 4,9. Plus récemment, nous avons montré que la voie de signalisation troisième FGF / ERK, sert de répresseur forte des premières étapes de l&#39;engagement neuroectodermique dans les CSEh. En revanche, la répression simultanée de ces trois voies mènent à la quasi-homogène de conversion des CSEh dans neuroectoderme avecen seulement quatre jours 10. Par la suite, la différenciation terminale très efficace en neurones fonctionnels a été observée dans les huit jours. Les neurones obtenus sont susceptibles d&#39;être neurones sensoriels du système nerveux périphérique, ce qui peut en partie expliquer leur calcul rapide 10. Les défauts de l&#39;entretien neurone sensoriel est considéré une des causes de certaines maladies humaines telles que la dysautonomie familiale 11. Pour modéliser ces maladies sur la base de la technologie hiPSC 12, pour la caractérisation fonctionnelle supplémentaire, ainsi que des fins appliquées ne nécessitant pas un type particulier de neurones, cette procédure différenciation peut présenter une base utile. Cependant, la stratégie de différenciation nous avions utilisé la formation impliqués des corps embryonnaires (EB) à partir de touffes de 10 colonies de CSEh, et ​​cela s&#39;est traduit par un bon degré d&#39;hétérogénéité concernant la taille des EB, et semblait aussi compromettre l&#39;efficacité de formation des neurones dans certaines CElignes ll. En outre, en raison de l&#39;hétérogénéité des tailles EB, la capacité de tester systématiquement les effets des facteurs de croissance ou de petites molécules pendant et après la formation des neurones semblent être quelque peu confus. Dans ce rapport, nous avons adapté notre procédure précédente pour un support débit compatible, forcé d&#39;agrégation basée technique pour générer EB dans un environnement hautement taille manière contrôlée, comme le montre également dans d&#39;autres contextes 13. Par la suite, l&#39;EB généré en forme de V des puits de plaques 96 puits ont été transférés à U ultra-faible attachement plaques à 96 puits, pour initier la formation neuroectoderme en suspension. Quatre jours plus tard, l&#39;EB pourraient être étalées donnant naissance à des neurones définitivement différenciées à haute efficacité et l&#39;homogénéité. Sinon, le jour EB-4 ont été dissociées en cellules individuelles et étalées en tant que telle, qui a abouti à faible densité monocouches de neurones humains. Des résultats cohérents ont été obtenus jusqu&#39;à présent avec deux indépendamment delignées de CSEh rived, HuES6 et NCl3. Comme condition préalable, la formation EB succès était strictement dépendante de l&#39;utilisation d&#39;un polymère synthétique, l&#39;alcool polyvinylique (PVA), avec inhibiteur de ROCK Y-27632 connue pour favoriser la survie de 13-14 CSEh. En conséquence, l&#39;homogénéité de l&#39;EB formé en 96-V-plaques a été considérablement améliorée par rapport à la formation d&#39;EB en tant que cultures de masse basés sur des techniques de fractionnement aléatoires. Ce système offre ainsi une plate-forme nettement améliorée pour la formation neuroectoderme en culture en suspension, suivie de la formation des neurones hautement contrôlé dans des conditions d&#39;adhérence.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Matrigel HC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 354263 </td><td> Voir le texte pour plus de détails sur la manipulation </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Life Technologies </td><td> 21331-020 </td><td></td></tr><tr><td> Poly (alcool vinylique) </td><td> Sigma </td><td> 363170 </td><td> Dissoudre à 0,4% en utilisant un bain-marie DMEM/F-12 ultrasons / éviter la surchauffe / peuvent être conservés à 4 ° C pendant plusieurs semaines </td></tr><tr><td> Supplément N2 </td><td> Life Technologies </td><td> 17502-048 </td><td> 100X, stocker sous forme d&#39;aliquotes congelés </td></tr><tr><td> B27 Supplément </td><td> Life Technologies </td><td> 12587-010 </td><td> 50X, magasin comme aliquotes congelées </td></tr><tr><td> Sérum Albumine Bovine </td><td> Sigma </td><td> A1595 </td><td> 10% = 500X, magasin comme aliquotes congelées </td></tr><tr><td> L-Glutamine avec Pénicilline / Streptomycine </td><td> AAP </td><td> P11-013 </td><td> Ou équivalent </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> Peprotech </td><td> 100-18B </td><td> Dissoudre à 10 pg / ml dans 0,1% BSA / PBS = 1000X, magasin comme aliquotes congelées </td></tr><tr><td> ROCK inhibiteur Y-27632 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> Asc-129 </td><td> Dissoudre à 10 mM dans le DMSO = 1000X, magasin comme aliquotes congelées </td></tr><tr><td> PBS </td><td> AAP </td><td> H15-002 </td><td> Ou équivalent </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> AAP </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> 96-V et des plaques à fond </td><td> Nunc </td><td> 277143 </td><td></td></tr><tr><td> PD0325901 </td><td> Axon MEDCHEM </td><td> Axon 1408 </td><td> Dissoudre à 0,5 mM dans le DMSO = 1000X, magasin comme aliquotes congelées </td></tr><tr><td> SB431542 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> Asc-163 </td><td> dissoudre à 15 mM dans le DMSO = 1000X, magasin comme aliquotes congelées </td></tr><tr><td> Dorsomorphin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-200689 </td><td> dissoudre à 0,5 mM dans du DMSO = 1000X, magasin sous forme d&#39;aliquotes congelés </td></tr><tr><td> De 96 puits à fond en U plaques de fixation ultra-faibles </td><td> Corning </td><td> 7007 </td><td></td></tr><tr><td> anticorps tubuline bêta-III (souris) </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td> utiliser moins 1:1000 </td></tr><tr><td> anticorps tubuline bêta-III (lapin) </td><td> Covance </td><td> PRB-435P </td><td> utiliser à 1:2000 </td></tr><tr><td> BRN3A (POU4F1) anticorps </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8429 </td><td> utiliser à 1:500 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. &lt;/ Strong&gt; réactifs et équipements spécifiques. </td></tr></tbody></table>

rapid and efficient generation of neurons from human pluripotent stem cells in a multititre plate format

Protocoles existants pour la génération de neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) sont souvent fastidieux en ce que ce sont des procédures en plusieurs étapes impliquant l&#39;isolement et l&#39;expansion de cellules précurseurs neurales, avant la différenciation terminale. Par rapport à ces approches consommatrices de temps, nous avons récemment découvert que l&#39;inhibition combinée de trois voies de signalisation, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 et FGF / ERK, favorise l&#39;induction rapide de neuroectoderme de hPSCs, suivie par la différenciation en neurones fonctionnels immédiate. Ici, nous avons adapté notre méthode à un format multititre nouvelle plaque, afin de renforcer sa reproductibilité et de la rendre compatible avec la mi-débit des applications. Il comprend quatre jours de formation neuroectoderme dans les sphères flottantes (corps embryoïdes), suivis par quatre autres jours de différenciation en neurones dans des conditions d&#39;adhérence. La plupart des cellules obtenues avec ce protocole semble être neurones sensoriels bipolaires. En outre,la procédure est très efficace, ne nécessite pas de compétences particulières experts, et est basé sur un simple support chimiquement défini avec rapport coût-efficacité des petites molécules. Grâce à ces caractéristiques, la procédure peut servir de plate-forme utile pour exploration fonctionnelle continue ainsi que pour le criblage cellulaire s&#39;approche nécessitant des neurones sensoriels de l&#39;homme ou des neurones de n&#39;importe quel type.

Dans notre précédent rapport, en ligne avec beaucoup d&#39;autres, EB à partir hPSCs pourrait être généré simplement en réensemencement des agrégats sur le fractionnement systématique de hPSCs en bas de fixation plats 10. Cela se traduit généralement par une large distribution de tailles EB résultant (figure 1C, en haut). Un autre problème résultant de cela est que EB maintenues en suspension ont tendance à s&#39;agréger les unes aux autres, ce qui conduit à une hétérogén...

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Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Les protocoles de différenciation neuronale des cellules souches humaines pluripotentes (hPSCs) sont souvent beaucoup de temps et nécessitera d&#39;importantes compétences de culture cellulaire. Ici, nous avons adapté une procédure de différenciation petite molécule à base d&#39;un format de plaque multititre, permettant la génération simple, rapide et efficace des neurones humains d&#39;une manière contrôlée.

Génération rapide et efficace des neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans un format plaque Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

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Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfection et Nucleofecting homme cellules souches pluripotentes induites

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

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Biologie

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogrammation des cellules somatiques humaines dans cellules souches pluripotentes induites (CISP) Utilisation vecteur rétroviral avec la GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

Génération de l&#39;homme cellules souches pluripotentes induites à partir de sang périphérique en utilisant le vecteur lentiviral STEMCCA

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Le poisson zèbre rapide et efficace génotypage utilisant la PCR avec haute résolution Melt analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Génération efficace d&#39;origine humaine souches pluripotentes à partir de cellules somatiques humaines avec Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.

Efficient Sporulation of Saccharomyces cerevisiae in a 96 Multiwell Format

Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.

Sporulation efficace de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Dans un 96 Multiwell Format

During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and vision. Proteins on the RPE apical surface are tightly associated with proteins on the photoreceptor outer segment surface, making it difficult to consistently separate the RPE from the photoreceptors/retina. We developed a method to efficiently separate the retina from the RPE of human eyes to generate complete RPE/choroid and retina flatmounts for separate cellular analysis of the photoreceptors and RPE cells. An intravitreal injection of a high-osmolarity solution of D-mannitol, a sugar not transported by the RPE, induced the separation of the RPE and retina across the entire posterior chamber without causing damage to the RPE cell junctions. No RPE patches were observed attached to the retina. Phalloidin labeling of actin showed RPE shape preservation and allowed morphometric analysis of the entire epithelium. An artificial intelligence (AI)-based software was developed to accurately recognize and segment the RPE cell borders and quantify 30 different shape metrics. This dissection method is highly reproducible and can be easily extended to other animal models.

We describe a method to efficiently separate retinal pigment epithelium (RPE) from the retina in human eyes and generate whole RPE/choroid flatmounts for histological and morphometric analyses of the RPE.

Génération efficace et cohérente d’épithélium/platures choroïdes pigmentaires rétiniens à partir d’yeux humains pour l’analyse histologique

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...