This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.

1. neuronale Culture Remarque: la reprogrammation des fibroblastes en cellules souches pluripotentes, l&#39;engagement à la lignée dorsale de télencéphale, dérivation, l&#39;amplification, et la banque de progéniteurs corticaux fin (LCP) ont été décrits dans Boissart et al 4. La différenciation neuronale des cellules de LCP-like a également été effectuée selon Boissart et al 4 avec de légères modifications. D&#39;autres procédés ont été développés pour la reprogrammation directe de fibroblastes dans des cellules souches pluripotentes induites suivie de leur différenciation en neurones. Ce protocole a été retenue car elle permet la production sélective des neurones glutamatergiques pyramidaux. <ol><li> Traiter 6 puits des plaques de culture avec des lamelles de verre avec de la poly-ornithine (dilué au 1/6 dans du DPBS, concentration stock 0,01%) O / N, suivie de trois lavages dans DPBS. Puis ajouter la laminine (concentration de stock 1 mg / ml, dilué 500 fois dans du DPBS) pendant au moins 10 heures sous la hotte à flux<html> . </li><li> Plate et envoyé NSC à basse densité (50.000 cellules / cm 2) dans 6 puits des plaques de culture avec des lamelles de verre dans 3 ml de milieu de culture constitué de DMEM / F12 (500 ml), 2 flacons (5 ml chacun) de supplément N2, 2 flacons (10 ml chacun) de supplément B27, 10 ml de Pen-streptomycine (Penicillin = 10.000 unités / ml et de la streptomycine = 10.000 unités / ml), 1 ml de 2-mercaptoéthanol (Solution mère: 50 mM) et de la laminine (1 / 500), sans facteurs de croissance. Étape critique: Effectuer cette étape avec soin en ajoutant des cellules avec des mouvements rotatifs lents afin de réduire le regroupement de cellules. </li><li> Retirez le milieu de culture. Ajouter moyen de N2B27 frais contenant 2 pg / ml de solution de laminine frais pour garder le neurone fixé sur les lamelles de verre et d&#39;éviter l&#39;agglutination. Changer le milieu tous les 3 jours. Garder une partie du milieu restant (200 ul) avant d&#39;ajouter du milieu frais afin d&#39;éviter le séchage de la cellule. Sinon, procéder rapidement et de changer le volume total (3 ml). </li></ol>e_title &quot;&gt; 2. Lentiviral transduction Remarque: vecteurs lentiviraux GFP ont été aimablement fournies par le Dr Uwe Maskos laboratoire à l&#39;Institut Pasteur (Paris) et préparés selon le protocole publié 5. Expression de la GFP est entraîné par le promoteur de phosphoglycérate kinase de souris (PGK). Pour cette étude, titre viral était de 400 ng / ul (solution mère dans du PBS 1x). <ol><li> Transduction de neurones humains iPSC dérivés, à quelque étape de maturation par des particules virales en ajoutant 1 pl de la solution de réserve contenant 40 ng de la GFP vecteur lentiviral par puits de culture (plaques de 6 puits) et incuber pendant 48 heures dans un milieu de culture frais. Remarque: Pour ce protocole, la durée d&#39;incubation permet un bon étiquetage des structures de la colonne vertébrale. </li></ol> 3. immunofluorescence Remarque: Afin d&#39;améliorer l&#39;étiquetage de l&#39;ensemble morphologie du rachis, l&#39;étiquetage d&#39;immunofluorescence a été effectuée en utilisant un anticorps anti-GFP dans des conditions perméabilisées. </p&gt; <ol><li> Retirer milieu de culture et de fixer les cellules transduites sur des lamelles dans du paraformaldéhyde 4% pendant 10 min à température ambiante, puis laver 3 fois dans du PBS 1X (10 minutes chacun). </li><li> Des lamelles de immerger dans PBS additionné de 0,05% de Triton (100x) et 10% de sérum de cheval pour 1 heure à température ambiante, puis laver 3 fois en PBS 1x. </li><li> Ajouter 100 ul de 1 x PBS additionné de 4% de sérum de cheval et l&#39;anticorps primaire (1/1000) dirigé contre la GFP et dilué par un facteur de 1000 sur chaque lamelle. Incuber dans une boîte sombre O / N à 4 ° C, puis laver 3 fois avec PBS 1x. </li><li> Diluer Alexa Fluor 488 conjugué anticorps (1/200) dans du PBS supplémenté avec 0,5% de Tween 20 et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Puis laver 3 fois en PBS 1x et monter des lamelles sur des lames de verre avec un milieu de montage pour la microscopie de fluorescence. </li></ol> 4. épines dendritiques Imaging <ol><li> Effectuer imagerie confocale à travers un microscope confocal à balayage laser microscope. </li><li> Sélectionner neurones sains avec une morphologie pyramidaletrouver une arborisation dendritique complet, et de quantifier au moins 10 neurones par l&#39;état à partir d&#39;expériences distinctes. Quantifier 60 - 100 um par Dendrite. </li><li> Acquérir des images à l&#39;aide d&#39;une huile 40X NA = 1,3 objective et une ligne laser de 488 nm pour la GFP excitation, avec une puissance de crête typique au niveau de l&#39;échantillon environ 20 uW. Définir la taille du pixel autour de 80 nm à échantillonner convenablement épines dendritiques. Remarque: L&#39;appel de l&#39;analyse subséquente pour une image dans laquelle le bruit ne compromet pas la bonne segmentation des dendrites et des épines. Avec les réglages d&#39;échantillonnage et de puissance spatiales mentionnés ci-dessus, nous avons observé que un pixel temps de séjour de 3,15 ms est suffisante pour collecter suffisamment de photons pour construire une telle image. Pour les échantillons sombres, la qualité d&#39;image peut être améliorée en moyenne de 2 à 4 scans. L&#39;acquisition de plusieurs tuiles XY peut être nécessaire pour couvrir la région d&#39;intérêt, qui doit ensuite être cousus ensemble avant le traitement. </li><li> Pour goûter à la totalité du volume de neurone, acquérir un Z-stack, avecZ un espacement allant de 150 nm à 300 nm, ce qui donne 20 à 30 Z tranches. Remarque: La résolution spatiale latérale atteint avec ces paramètres est de 234 nm et la résolution axiale est de 591 nm. L&#39;échantillonnage est ici choisie suffisante, mais que la résolution axiale est plus grande que la plus petite taille des épines à imager, l&#39;analyse favorise les épines qui se prolongent latéralement à partir des dendrites. </li></ol> 5. 3D Quantification des épines dendritiques Remarque: Les sections suivantes décrivent spécifiquement l&#39;utilisation du logiciel Imaris pour analyse. Implémentations alternatives existent, y compris NeuronStudio 15 ou Metamorph 8, qui peut fournir des résultats similaires. Utilisez les paramètres clés suivants: <ol><li> Comme une étape de pré-traitement, utiliser le filtrage gaussien à travers les installations de traitement d&#39;image offertes par le logiciel. Effectuer un filtrage gaussien par le traitement d&#39;image&gt; Smoochose&gt; filtre gaussien. Régler la largeur de filtre pour être égale à la taille des pixels en XY. </li><li> Effectuer un tracé semi-automatique de dendrites, en utilisant le module filament Tracer du logiciel. <ol><li> Tout d&#39;abord, estimer le diamètre Dendrite, en utilisant l&#39;outil de la distance dans l&#39;onglet tranche du logiciel. </li><li> Dans l&#39;onglet Surpass, cliquez sur l&#39;outil de filaments. Pour une meilleure robustesse, ce protocole repose sur le suivi semi-automatique; cliquer sur la création automatique Ignorer. L&#39;interface du module montre maintenant l&#39;onglet Draw. Ici, sélectionnez AutoPath comme une méthode, Dendrite comme un type, et l&#39;entrée du diamètre de dendrites estimé. </li><li> Utilisez le mode de sélection du pointeur, tournant le curseur dans une boîte. Maj-clic-droit sur le point de départ de dendrites. Remarque: le logiciel effectue les calculs initiaux. </li><li> Déplacez le pointeur le long de la dendrites. Du point de départ (représentered comme une sphère bleue), une ligne jaune représentant le chemin de dendrites plus probable est indiquée. Maj-clic gauche sur le point de terminaison de dendrites. </li></ol></li><li> Effectuez la épines segmentation automatique. Remarque: Les épines sur la dendrite tracé se trouvent automatiquement par l&#39;interface du module. <ol><li> Dans l&#39;interface du module, cliquez sur l&#39;onglet Création. Dans la liste déroulante Reconstruire, choisissez Reconstruire Dendrite Diamètre et cochez la case de données Conserver. Puis cliquez sur Reconstruire. </li><li> Régler le seuil de sorte que le volume segmenté correspond au volume réel de dendrites. Comme un algorithme, sélectionnez Distance la plus courte de Carte Distance. Cliquez sur le bouton Suivant. </li><li> Déterminer le plus petit diamètre de la tête de la colonne vertébrale et la longueur maximale, à nouveau en utilisant l&#39;outil de la distance dans l&#39;onglet tranche du logiciel, puis de revenir à l&#39;onglet dépasser et entrer les paramètres. Fou ce protocole, les valeurs autour de 200 - 300 nm pour le diamètre minimal et 4 um pour la longueur maximale sont de bons points de départ. Ne cochez pas la case Autoriser Direction épines. Cliquez sur le bouton Suivant. </li><li> Réglez le Seuil Points de semences afin que les points bleus représentant épines localisent aux chefs de la colonne vertébrale réels. Cliquez sur le bouton Suivant. Note: Le calcul de base est fait maintenant et peut être long. </li></ol></li><li> Classer les épines en allant à l&#39;onglet Outils de l&#39;interface du module. Cliquez sur Classer épines. Dans l&#39;interface utilisateur invité, assurez-vous qu&#39;il ya quatre catégories définies par leur morphologie comme suit: Stubby: longueur &lt;1 pm; Champignon: Longueur (colonne vertébrale)&gt; 3 et la largeur maximum (de la tête)&gt; largeur moyenne (cou) x 2; Long et mince: Largeur moyenne (tête) ≥ Largeur moyenne (cou); Filopodia comme: Longueur ≤ 4 pm (sans tête). Remarque: La moInterface Dule génère quatre nouveaux objets à incandescence contenant les résultats de la classification. </li><li> Exporter des données statistiques: sur l&#39;un de ces quatre interfaces d&#39;objets, cliquez sur l&#39;onglet Statistiques. Cliquez sur l&#39;exportation toutes les statistiques to File. Remarque: D&#39;autres valeurs statistiques peuvent être exportés pour dendrites (. Par exemple, longueur, surface, diamètre moyen, la profondeur de la branche, la ramification angle, volume, etc.), Et pour les épines (par exemple, la rectitude, zone de fixation, la longueur et le volume des distincte parties de la colonne vertébrale, diamètre de la colonne vertébrale, les densités, etc.) </li></ol>

<ol>
	<li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHANK3+mutations+identified+in+autism+led+to+modification+of+dendritic+spine+morphology+via+an+actin-dependent+mechanism.">SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism.</a> Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).</li><li>Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-synaptic+dendritic+spines+in+neocortex.">Non-synaptic dendritic spines in neocortex.</a> Neuroscience. 145, 464-469 (2007).</li><li>Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-based+comparison+of+human+dendritic+spine+structure+using+complete+three-dimensional+reconstructions.">Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions.</a> Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).</li><li>Boissart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+of+cortical+neurons+of+the+superficial+layers+amenable+to+psychiatric+disease+modeling+and+high-throughput+drug+screening.">Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening.</a> Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).</li><li>Avale, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+beta+2*+nicotinic+receptors+and+dopamine+pathways+in+the+control+of+spontaneous+locomotion.">Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion.</a> Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+synaptic+adhesion+with+dendritic+spine+remodeling+by+AF6+and+kalirin-7.">Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7.</a> Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).</li><li>Srivastava, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afadin+is+required+for+maintenance+of+dendritic+structure+and+excitatory+tone.">Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).</li><li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dendritic+spine+morphology+in+cultured+CNS+neurons.">Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).</li><li>Brennand, K. J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychiatric+disorders+through+reprogramming.">Modeling psychiatric disorders through reprogramming.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).</li><li>Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).</li><li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells:+a+game+changer+for+future+medicine.">iPS cells: a game changer for future medicine.</a> EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).</li><li>Stein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquantitative+framework+to+evaluate+modeling+of+cortical+development+by+neural+stem+cells.">Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells.</a> Neuron. 83, 69-86 (2014).</li><li>Sivapatham, R., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell+for+disease+modeling.">Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+dysgenesis+in+Rett+Syndrome.">Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three+Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La quantification des caractéristiques morphologiques de neurones pyramidaux appuyé sur le logiciel. L&#39;interface filament traceur a été utilisé pour la segmentation des neurones et des épines, et le module de XT a été utilisé pour leur analyse. Pour analyser l&#39;exactitude de notre technique, nous avons d&#39;abord comparé les paramètres mesurés morphologiques (longueur, surface et volume total de la colonne vertébrale le cas échéant), avec ceux publiés en utilisant rat...

Épines dendritiques des neurones corticaux pyramidales sont de petites protubérances minces et qui sont distribués le long des dendrites basales et apicales de ces sous-types de neurones dans des rongeurs, des primates, et de cerveau humain. Ils sont les sites de la plupart des synapses excitateurs et afficher les fonctions clés de l&#39;apprentissage et les processus cognitifs. Les structures détaillées des épines dendritiques humaines ont été techniquement étudié par microscopie électronique 2. Cependant, une telle approche est de temps et représente lourde charge de travail. Plus récemment, un à trois dimensions (3D) de reconstruction de la morphologie des épines dendritiques a été rapporté dans le cortex du cerveau humain en utilisant un logiciel spécifique combiné à large analyse de la colonne vertébrale manuel 3. La protéine de fluorescence verte (GFP) couplé à la technologie immunofluorescence représente un outil précis pour l&#39;identification de la colonne vertébrale et la mesure de la forme de microscopie de fluorescence. Cette approche peut être facilement appliquée à des neurones en culture. However, aucune donnée n&#39;a été signalé sur l&#39;analyse de la colonne vertébrale la maturation et la morphologie sur les neurones humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). L&#39;objectif de cette étude était de décrire un protocole, qui permet l&#39;imagerie de la colonne vertébrale dendritique de neurones humains cultivés in vitro. L&#39;étiquetage de la GFP, microscopie confocale et analyse 3D avec le module filament Tracer de logiciels Imaris ont été utilisés dans le présent protocole. Étapes de culture qui sont nécessaires pour obtenir des neurones glutamatergiques corticaux de couches II à IV à partir de cellules souches neurales (NSC) sont également brièvement décrit ici. L&#39;ensemble du protocole pour la production NSC humaine a déjà été publié ailleurs 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse laminin</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement w/o vit A (50X)</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Med SFM</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Steptomycin</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>A-6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit&#160;</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid</td>
			<td>Sigma Aldrich Chimie</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich Chimie</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibroblasts</td>
			<td>Coriell Cell Line Biorepository</td>
			<td>GM 4603 and GM 1869</td>
			<td>Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss (Germany)</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich</td>
			<td>6.4.0 version</td>
			<td>Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Software</td>
			<td>Huygens software, SVI, Netherlands</td>
			<td>Pro version</td>
			<td>Optional (for deconvolution testing)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional quantification of dendritic spines from pyramidal neurons derived from human induced pluripotent stem cells

Épines dendritiques sont des petites saillies qui correspondent aux compartiments post-synaptiques excitateurs de synapses du système nerveux central. Ils sont répartis le long des dendrites. Leur morphologie est largement tributaire de l&#39;activité neuronale, et ils sont dynamiques. Épines dendritiques expriment des récepteurs glutamatergiques (NMDA et AMPA récepteurs) sur leur surface et au niveau de la densité post-synaptique. Chaque colonne permet le neurone de contrôler son activité étatique et local indépendamment. Morphologies de la colonne vertébrale ont été largement étudiées dans les cellules pyramidales du cortex glutamatergiques du cerveau, en utilisant deux approches in vivo et des cultures de neurones obtenus à partir de tissus de rongeurs. Neuropathologiques conditions peuvent être associées à l&#39;induction de l&#39;altération de la colonne vertébrale et maturation, comme représenté sur les rongeurs neurones en culture et l&#39;analyse quantitative unidimensionnelle 1. La présente étude décrit un protocole pour l&#39;analyse quantitative des morphologies 3D de la colonne vertébrale en utilisant cortic humaineal neurones dérivés de cellules souches neuronales corticales (progéniteurs tardifs). Ces cellules ont été initialement obtenues à partir de cellules souches pluripotentes induites. Ce protocole permet l&#39;analyse des morphologies de la colonne vertébrale pendant les périodes de culture différents, et avec possibilité de comparaison entre des cellules souches pluripotentes induites obtenues à partir d&#39;individus témoins avec ceux obtenus à partir de patients atteints de maladies psychiatriques.

<html> La présente étude décrit un protocole normalisé pour la colonne vertébrale quantification des dendrites culture de neurones pyramidaux dérivés de iPSC. Ce protocole permet l&#39;analyse de la colonne vertébrale maturation sur les neurones humains et sa possible par rapport à la maturation des épines dans des cultures neuronales de rongeurs standard ainsi que in vivo dans des modèles animaux. La figure 1A représente un schéma des différentes étap...

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Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Épines dendritiques des neurones pyramidaux sont les sites de la plupart des synapses excitatrices de cortex cérébral de mammifère. Cette méthode décrit une analyse quantitative 3D de la morphologie de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux du cortex glutamatergiques humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites.

Quantification tridimensionnelle d&#39;épines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

three-dimensional-quantification-dendritic-spines-from-pyramidal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K vues.  Institut Pasteur.  Épines dendritiques des neurones pyramidaux sont les sites de la plupart des synapses excitatrices de cortex cérébral de mammifère. Cette méthode décrit une analyse quantitative 3D de la morphologie de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux du cortex glutamatergiques humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites. 

Vidéo: Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

Génération de l&#39;intégration sans anthropiques cellules souches pluripotentes utilisant des kératinocytes cheveux dérivés

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Recherche

Biologie du développement

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Dérivation libre Feeder-de mélanocytes de pluripotentes humaines Cellules souches

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Génération de Induced cellules souches pluripotentes à partir de mélanome humain Lymphocytes tumorales infiltrant

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Génération d&#39;Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Différenciation des chondrocytes provenant des cellules souches pluripotentes induites par le sang périphérique dérivé du sang

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying the human brain. One emerging technology to address this issue is the use of three dimensional (3D) neural cell cultures, termed &#39;organoids&#39; or &#39;spheroids&#39;, for long term preservation of intercellular interactions including extracellular adhesion molecules. However, these culture systems are time consuming and not systematically generated. Here, we detail a method to rapidly and consistently produce 3D cocultures of neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells. First, pre-differentiated astrocytes and neuronal progenitors are dissociated and counted. Next, cells are combined in sphere-forming dishes with a Rho-Kinase inhibitor and at specific ratios to produce spheres of reproducible size. After several weeks of culture as floating spheres, cocultures (&#39;asteroids&#39;) are finally sectioned for immunostaining or plated upon multielectrode arrays to measure synaptic density and strength. In general, it is expected that this protocol will yield 3D neural spheres that display mature cell-type restricted markers, form functional synapses, and exhibit spontaneous synaptic network burst activity. Together, this system permits drug screening and investigations into mechanisms of disease in a more suitable model compared to monolayer cultures.

In this protocol, we aim to describe a reproducible method for combining dissociated human pluripotent stem cell derived neurons and astrocytes together into 3D sphere cocultures, maintaining these spheres in free floating conditions, and subsequently measuring synaptic circuit activity of the spheres with immunoanalysis and multielectrode array recordings.

Modélisation de Microcircuit synaptique avec 3D Cocultures d’Astrocytes et les neurones des cellules souches pluripotentes humaines

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Dans Vitro génération du Somite dérivés de Human induit Pluripotent Stem cellules

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...