Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation Grant # 1025627 IOS et par le National Institutes of Health en vertu subvention no 1R21NS078582-01 à JAW

Ce protocole utilise deux configurations (Figure 1) pour l&#39;acquisition de quatre affichages différents recueillies des mouches soumises à une infection bactérienne. Ces sorties comprennent: 1) le sommeil / sillage comportement; résultats de survie 2), 3) la charge bactérienne chez la mouche, et 4) la mesure en temps réel de l&#39;activité du rapporteur NFkB in vivo. En combinaison avec les outils génétiques qui sont disponibles chez la drosophile, ces mesures donnent un aperçu mécanistique sur le lien moléculaire entre la fonction immunitaire et le comportement. 1. Activité locomotrice mesure et hôtels de mouches <ol><li> Le montage utilisé pour mesurer l&#39;activité locomotrice et hôtels de mouches, qui comprend le système de surveillance de l&#39;activité chez la drosophile (DAM2, Trikinetics), incubateurs, chambre noire, et la préparation des animaux de laboratoire et les tubes d&#39;activité, a été décrit précédemment 6. La même approche est utilisée ici, avec quelques modifications mineures. <ol class="lalpha"><li&gt; L&#39;éclairage de l&#39;incubateur est commandé par le même incubateur. Par conséquent, il est important de synchroniser le réglage de l&#39;heure entre l&#39;ordinateur et incubateurs. </li><li> Activité tubes sont nettoyés pour une réutilisation en faisant bouillir sur une plaque chauffante dans de l&#39;eau déminéralisée. Une petite quantité de détergent est ajouté pour la première ébullition, les tubes sont bien rincées et cuites deux fois plus. Si le fil est utilisé pour boucher le tube, les tubes d&#39;activité utilisées (contenant de la nourriture, de la cire, des mouches et fils) peuvent être nettoyés sans démontage préalable du fil. </li></ol></li><li> Avant de lancer une expérience, cultures lieu contenant fin nymphe mise en scène des mouches dans des incubateurs pendant trois à quatre jours pour s&#39;adapter à l&#39;éclairage expérimental et d&#39;autres conditions environnementales. Lumière: des conditions sombres ou constante ont été couramment utilisés pour mesurer le comportement du sommeil. Dans cet exemple, les mouches sont acclimatés à lumière constante pour éliminer l&#39;influence de l&#39;horloge circadienne sur la réponse immunitaire et le comportement 2,7,8. Comme il est décrit à la figure 1A </strong&gt;, charge 1-4 jours d&#39;âge mouches dans l&#39;activité Trikinetics DAM2 moniteurs comme décrit 6, et record pour un minimum de trois jours avant l&#39;infection. </li></ol> 2. Infect mouches avec une souche pathogène de bactéries <ol><li> Le protocole décrit ici est spécifique à S. marcescens, qui sont faciles à cultiver et à entretenir. Les protocoles de stockage à long terme et les conditions de culture pour d&#39;autres espèces bactériennes peuvent varier. S. marcescens sont stockés dans le glycérol 15-50% à -80 ° C. Pour préparer stockage à long terme, mélangez 2 volumes de culture bactérienne pendant la nuit (DO 600 = 0,5 - 1,0) à 1 volume de glycérol à 50% autoclave en 1,5 ml microtubes. Cela se traduira par une concentration de glycérol final de 17%. Conserver les tubes à -80 ° C. Pour préparer une courte durée d&#39;utilisation de source de bactéries, gratter le stock congelé avec une pointe de pipette stérile 200 ul et d&#39;effectuer une série de trois cours sur une plaque de gélose LB. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 &amp; dpar exemple, C pour obtenir des colonies isolées. Conservez la plaque à 4 ° C. Un jour avant l&#39;infection prévue, choisissez une seule colonie de la plaque de gélose LB avec une pointe de pipette stérile 200 pi et plonger la pointe dans un tube de culture contenant 5 ml de milieu LB. Cultiver des bactéries pendant la nuit, ou jusqu&#39;à 16 heures à l&#39;intérieur d&#39;un agitateur incubateur à 37 ° C et 250 rpm jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne la phase de croissance exponentielle. Mesurer la concentration d&#39;un spectrophotomètre à une DO 600. La concentration dans cette phase varie de 0,5 à 1. Si la concentration est trop élevée, repiquer les bactéries et croître pendant encore plusieurs heures pour obtenir une concentration optimale. Effectuez la procédure à proximité d&#39;une source de flamme. Certaines souches bactériennes sont conçus pour la résistance aux antibiotiques et sont cultivées et sélectionnées pour antibiotique approprié ajouté au milieu. S. marcescens (ATCC # 8100) ne sont pas résistants aux antibiotiques et sont donc cultivées dans un milieu stérile sans antibiotique. Pour vérifier une technique stérile, faire une maquette culture sans bactéries en tant que témoin. La solution pour infecter les mouches contient des bactéries (diluée à DO600 = 0,1) et de colorant alimentaire 1% (bleu brillant FCF) dans du PBS. Préparer une solution de contrôle d&#39;injection en ajoutant une quantité équivalente de milieu LB utilisé en solution infection et 1% de colorant alimentaire bleu dans du PBS. Conserver les solutions sur la glace. </li><li> Préparer aiguilles de verre pour injecter les mouches. Tirez capillaires en verre (od = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) pour une pointe fine à l&#39;aide d&#39;un extracteur micropipette (Narishige). Sous une loupe binoculaire, utilisez une pince fine à rompre la pointe de l&#39;aiguille de sorte que l&#39;ouverture est assez grande pour remplir de fluide d&#39;injection en appliquant une aspiration avec une seringue, mais assez petit pour minimiser les dommages à la volée pendant le processus d&#39;injection. Après avoir brisé la pointe, la taille de la pointe devrait être autour de 40-50 um. L&#39;aiguille de verre est fixée à une seringue en plastique 3 cc avec une longueur de tube. L&#39;écoulement du fluide d&#39;injection est commandée manuellement en appliquant une pression positive ou suction avec la seringue. Éviter de contaminer le tube en caoutchouc avec un fluide d&#39;injection, comme le dispositif de seringue est utilisée pour le contrôle de l&#39;infection et les injections. </li><li> Anesthésier les mouches en les plaçant sur ​​un tapis de CO 2. CO 2 est passé à travers un récipient fermé d&#39;eau pour humidifier le tampon et pour réduire l&#39;électricité statique, ce qui peut compliquer la manipulation de vol sur la plaquette. Injecter mouches par piquer l&#39;aiguille de verre dans la région au-dessus du scutellum du thorax dorsal. Le passage du milieu d&#39;injection dans la mouche est vérifiée par le colorant alimentaire - mouches deviennent bleus comme les spreads de colorants alimentaires à travers le système. La dose de bactéries qui reçoivent les mouches peut être quantifiée comme décrit dans la section 3 ci-dessous. Certains modèles expérimentaux comprennent un groupe témoin qui reçoit une blessure par injection aseptique mouches avec du colorant alimentaire PBS et sans bactéries. </li></ol> 3. Déterminer la charge bactérienne Une approche pour evaluating la réponse immunitaire contre l&#39;infection bactérienne est une infection à déterminer la charge bactérienne après. D. melanogaster est un excellent modèle pour déterminer ce paramètre, car la volée entière peut être homogénéisé afin d&#39;estimer le nombre total de bactéries à l&#39;intérieur d&#39;un individu. La raison d&#39;être de ce protocole est que lorsqu&#39;elle est cultivée sur un milieu solide tel que du bouillon de Luria (LB) agar sur une boîte de Pétri (plaque LB), une seule bactérie forme une colonie visible à distinguer. Par conséquent, en homogénéisant les mouches infectées en milieu liquide LB, générer des dilutions en série de l&#39;homogénat, et d&#39;étalement de l&#39;homogénat dilué sur des plaques LB, le nombre de cellules bactériennes qui infectent une volée peut être déterminée. Un groupe de contrôle de vol d&#39;une injection de PBS et de coloration des aliments sans pour autant les bactéries doivent être utilisées pour vérifier que l&#39;infection n&#39;a pas été contaminé par d&#39;autres espèces bactériennes. Il devrait y avoir aucune colonie sur la gélose LB dans cet état. <ol><li> Autoclaver tous les matériaux qui seront utilisés pour cetteprocédure avant d&#39;effectuer l&#39;étape d&#39;homogénéisation réelle. Cette regroupe plus de 200 embouts de pipette ul coupés avec des ciseaux, des médias, LB et pilons utilisés pour l&#39;homogénéisation. Préparer les plaques en versant autoclavé milieu LB / agar dans des boîtes de 10 cm de Petri stériles au moins 1 jour avant l&#39;homogénéisation des mouches. </li><li> Anesthésier et de recueillir les mouches dans 1,5 ml microtubes et tubes de magasins sur la glace. </li><li> Effectuez l&#39;homogénéisation près d&#39;une flamme pour éviter la contamination. Une homogénéisation de contrôle contenant les mouches sans infection est particulièrement recommandé lors de l&#39;utilisation d&#39;une souche bactérienne telles que S. marcescens, qui ne sont pas résistantes aux antibiotiques. Homogénéiser un minimum de 2 groupes de 10 mouches par chaque état expérimental. Le nombre de mouches utilisés par homogénat est déterminée par l&#39;expérimentateur. Certains groupes ont utilisé une mouche par homogénat, ce qui est utile pour évaluer la variation de la charge bactérienne entre les mouches individuelles 8, tandis que d&#39;autres ont utilisé de 3 à 10 mouches par homogénatà comparer entre génotype ou de la condition expérimentale 9-12. <ol class="lalpha"><li> Ajouter 400 ul de milieu LB à chaque microtube contenant les mouches et homogénéiser à l&#39;aide d&#39;un petit moteur et un pilon (Kontes). </li><li> Utiliser des embouts de pipette stériles coupées, serial dilution de 1:10 homogénat en ajoutant 20 ul LB homogénéisé / milieu bactérien à tube de 1,5 ul contenant 180 ul de milieu LB. Couper des pointes de pipette empêche le blocage des débris voler et veille à ce que le volume approprié est en cours de transfert. </li><li> Facteur de dilution est déterminé de manière empirique et dépend du génotype de la mouche, la souche bactérienne utilisée, et les conditions expérimentales. Pour les mouches de type sauvage infectées par S. marcescens, utiliser des dilutions de 1:10 2 1:10 3 ou pour les mouches homogénéisés immédiatement après l&#39;infection, et des dilutions de 1:10 ou 1:10 4 5 pour les mouches homogénéisé 24 h après l&#39;infection. </li><li> Ajouter 100 ul LB / milieu bactérien du microtubes rocentrifuge contenant la dilution finale et la propagation de la moyenne sur une plaque LB utilisant des billes de verre (VWR) pour assurer une distribution uniforme. </li><li> Jeter des boules de verre dans une solution EtOH à 100%. Placez les plaques de LB dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> En option, utilisez un système d&#39;imagerie à la lumière visible pour obtenir une image des plaques LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Compter le nombre de colonies soit sur la plaque elle-même ou de l&#39;image de la plaque en utilisant l&#39;outil de comptage sur logiciel Photoshop (Adobe Photoshop CS3). </li><li> Calculer le nombre d&#39;unités formant colonie par la mouche selon la formule suivante: [n / (N * D * v)] * V, où n = nombre de colonies cultivées sur la plaque LB, N = le nombre de vol mis en commun dans une microtube, D = facteur de dilution et v = volume de solution étalée sur chaque plaque; V = volume initial de l&#39;homogénat. </li></ol></li></ol> 4. Évaluer sommeil et la durée de survie après l&#39;infection <ol><li> Pourmouches qui ne sont pas exploitées pour mesurer la charge bactérienne, continuer à surveiller le comportement pendant 7-10 jours. Durée de survie est influencée par le génotype des mouches, les conditions environnementales et les espèces bactériennes utilisées pour l&#39;infection. </li><li> Après environ 10 jours, résilier l&#39;expérience, télécharger et traiter les données comportementales telles que décrites précédemment 6. Insomniac2 logiciels sur mesure, qui est basé à Matlab, est utilisé pour analyser les paramètres du sommeil. Il est important d&#39;éliminer les mouches mortes de l&#39;analyse comportementale. Normalement, ce qui limite les analyses à l&#39;intérieur du premier jour après l&#39;infection, selon le type d&#39;infection et le génotype mouche. La mort dans l&#39;essai est indiqué par le temps tous les chefs d&#39;activité ont atteint zéro. Pour faciliter l&#39;analyse de la survie, Drosonex, un logiciel personnalisé écrit en Microsoft Visual C + + 6.0, est utilisé pour traiter les fichiers de données brutes du système de DAM Trikinetics. Les rapports de logiciels sous forme de fichiers Excel, la durée de survie de chaque volée (en heures), compile activité datun ensemble de moniteurs dans une feuille de calcul, et signale l&#39;oiseau survivant pour cent dans le temps fixé par l&#39;utilisateur. Les fichiers Excel sont conçus pour s&#39;intégrer dans d&#39;autres logiciels de statistiques pour une analyse ultérieure. </li></ol> 5. Mesure de l&#39;activité NFKB cours de l&#39;infection en utilisant un dosage rapporteur de la luciférase Transgénique KB-luc les mouches utilisées dans ce test ont été générés précédemment comme décrit dans Kuo et al., 2010 2. En bref, le journaliste KB-luc contient 8 répétitions d&#39;une séquence NFkB contraignant qui ont été insérés dans un promoteur en amont d&#39;un cadre de lecture ouvert luciférase. <ol><li> Ajustez les mouches des conditions d&#39;éclairage expérimentales telles que décrites à la section 1.2. Dans cet exemple, 1-4 jours d&#39;âge KB-luc les mouches sont logés dans des flacons contenant une solution de saccharose à 5%, 2% agar milieu alimentaire et mis en lumière constante (LL) pendant 2 jours pour atteindre le même âge que d&#39;autres mouches lors de l&#39;infection. </li><li> Préparer une microplaque de 96 puits pour les mouches. Chaque puits contient 2 couches de milieu alimentaire (Figure 2), la couche supérieure contient luciférine, le substrat de la luciférase. Ajouter 300 ul d&#39;une solution de saccharose à 5%, solution de gélose à 2% dans chaque puits et laisser se solidifier. Ensuite, ajoutez une couche de 50 ul haut à chaque puits contenant du sucrose 5%, 1% de gélose, et 2 mM de luciférine (Gold Biotechnology, Inc). Luciférine concentrations utilisées pour l&#39;activité du rapporteur de mesure chez la drosophile ont varié dans la littérature, et ont été aussi basses que 100 uM 13. La concentration requise peut être déterminée empiriquement. Entre les couches de distribution des aliments, couvrir la plaque avec un chiffon à maille fine pour faciliter le séchage tout en préservant la stérilité. La plaque devrait être autorisé à sécher, jusqu&#39;à une heure, afin d&#39;empêcher les mouches de se coincer dans les gouttelettes de condensation. Parce que luciférine est sensible à la lumière, éviter d&#39;exposer les plaques à la lumière plus que nécessaire. </li><li> Appliquer un film adhésif transparent (Top-Seal-A; Perkin Elmer) pour une plaque de 96 puits de microtitration et perforer à l&#39;aide d&#39;une aiguille fine à une quantité de 2 trous par puits. Ces trous permettent non seulement un échange d&#39;air dans chaque puits, mais aussi de fournir un moyen d&#39;anesthésier les mouches sur une base individuelle. Utiliser une lame bien aiguisée et d&#39;une règle, d&#39;introduire une coupure entre chaque colonne. Ce sera un moyen facile de charger / décharger les mouches par groupes de 8 à la fois. Pour charger les mouches dans la plaque de microtitration, retirer les flacons de l&#39;incubateur et les mouches anesthésier sur un pad CO 2. Une charge d&#39;oiseau par une à chaque puits colonne par colonne. Si un avion se coincer par inadvertance sur le joint adhésif, laisser la mouche seulement car ils sont souvent en mesure de se libérer sans intervention. Retour à la plaque de microtitration dans l&#39;incubateur pendant 8-24 h LL pour s&#39;adapter à ce nouvel environnement et à consommer le substrat luciférine. </li><li> Bactéries Culture, S. marcescens, et préparer une solution d&#39;infection tel que décrit ci-dessus. </li><li> Anaesthetize til vole à l&#39;aide d&#39;une pointe de la micropipette attachée à une faible pression de CO 2 lignes. Placez la pointe de la micropipette directement au-dessus des trous de ventilation effectués pour chaque puits. Prenez garde à s&#39;assurer que la pression de CO 2 est suffisamment élevée pour anesthésier la volée, mais suffisamment faible pour éviter les blessures à la mouche. Par groupes de huit, individuellement transférer chaque volée à un pad CO 2, et infecter tel que décrit ci-dessus. Après l&#39;infection, retournez chacune à la mouche à son origine bien refermé et la microplaque. </li><li> Luminescence mesure (TopCount NXT-luminescence et compteur à scintillation; Perkin-Elmer). Le compteur de luminescence TopCount contient une cassette d&#39;empilement de plaques, ce qui permet des lectures programmées et automatisées en permanence par incréments souhaités pour toute longueur de temps (habituellement jusqu&#39;à cinq jours). Cette fonction n&#39;est pas disponible sur tous les instruments, et la collecte de données pour les expériences réalisées avec d&#39;autres instruments peuvent donc être moins fréquents. Le compteur de luminescence est logé dans un room avec une température contrôlée et horaire d&#39;éclairage. Lors du chargement des plaques dans la cassette d&#39;empilement, empiler les plaques contenant les mouches claires entre les plaques vierges pour veiller à ce que les mouches recevoir la lumière. Programme du luminomètre selon les spécifications du fabricant de recueillir des lectures toutes les heures pendant un minimum de 24 heures. Dans cet exemple, les détecteurs sont programmés pour lire chaque puits pendant 10 sec et à exprimer le résultat en points (unités arbitraires) par seconde. Cette valeur est une moyenne sur 3 lectures par puits. Exporter les fichiers de données vers un tableur et d&#39;effectuer une analyse standard, la représentation graphique des résultats de luminescence. </li></ol>

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B., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+analysis+of+behavioral+and+molecular+cycles.">Signal analysis of behavioral and molecular cycles.</a> BMC Neurosci. 3, 1 (2002).</li><li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+anorexia+in+resistance+and+tolerance+to+infections+in+Drosophila.">The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila.</a> PLoS Biol. 7, e1000150 (2009).</li><li>Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+photoreceptive+circadian+clocks+throughout+Drosophila.">Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila.</a> Science. 278, 1632-1635 (1997).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster.">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27, 628-639 (2004).</li><li>Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+method+to+study+Drosophila+sleep.">A video method to study Drosophila sleep.</a> Sleep. 31, 1587-1598 (2008).</li><li>Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+in+sleep+and+other+pathophysiological+sequelae+of+influenza+virus+infection+in+naive+and+immunized+mice.">Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice.</a> J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).</li><li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state.">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li><li>Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila.">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31, 465-472 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Ce protocole décrit une approche pour étudier la façon dont le comportement, en particulier dormir, est liée à des paramètres de la réponse immunitaire. Ces paramètres comprennent la charge bactérienne, les résultats de survie et l&#39;activité NFKB, mesurée par un rapporteur luciférase in vivo. Ensemble, ces paramètres fournissent des informations sur la façon dont une mouche peut combattre une infection. Charge bactérienne et les résultats de survie sont des paramètres de la réponse immunit...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du produit </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Incubateurs </td><td> Percival Scientific, Inc </td><td> I30BLLC8 I36VLC8 </td><td> Tout incubateur capable de faire tourner la lumière programmée / horaires de température est appropriée. </td></tr><tr><td> Drosophila activitiy Moniteurs </td><td> Trikinetics Inc, Waltham, MA </td><td> DAM2 </td><td> Comme il est décrit ailleurs 6, ce système nécessite une interface informatique, des logiciels, et autres accessoires. </td></tr><tr><td> Pyrex Tubes </td><td> Trikinetics Inc, Waltham, MA </td><td> PGT-5x65 </td><td></td></tr><tr><td> Scintillation pour microplaques et compteur de luminescence </td><td>Perkin Elmer </td><td> TopCount NXT Détecteur 12 </td><td> Tout lecteur de microplaque capable de détecter la luminescence peut être utilisé pour ce type de dosage journaliste. TopCount contient plusieurs détecteurs et un empileur automatique, elle est capable d&#39;être programmé pour lire en continu à partir de plusieurs plaques. </td></tr><tr><td> FluorChem 8900 </td><td> Alpha Innotech </td><td></td><td> Imagerie des cultures bactériennes est facultative; n&#39;importe quel système d&#39;imagerie numérique avec une capacité de lumière visible est suffisante. </td></tr><tr><td> Micropipette Puller </td><td> Tritech Research, Inc </td><td> Narishige PC-10 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Provisions </td></tr><tr><td> Borosilicate Glass capillaires </td><td> Mondiale précision Instrument Inc </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 3 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305482 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguilles pour seringues </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305196 </td><td> 18 G - couper la pointe de l&#39;aiguille pour éviter d&#39;endommager la tuyauterie. </td></tr><tr><td> Tubulure en silicone, id (0,030 &quot;) od (0,065&quot;) Épaisseur du mur (0,018 &quot;) </td><td> VWR </td><td> 60985-706 </td><td> Utilisé pour fixer les aiguilles capillaires en verre à une seringue </td></tr><tr><td> Robinet 3 voies </td><td> Société américaine Pharmaseal </td><td> K75 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pilon Moteur sans fil </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749540-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pilon </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> Les billes de verre de 3 mm </td><td> VWR </td><td> 26396-630 </td><td></td></tr><tr><td> Microplaques Microlite 1 + </td><td> Thermo Scientific </td><td> 7571 </td><td> Select plaques de 96 puits qui sont appropriés pour la luminescence - ils doivent être opaques. </td></tr><tr><td> TopSeal-A :96-Microplaques ainsi </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005185 </td><td> Microplaques Press-On Film d&#39;étanchéité adhésif </td></tr><tr><td> D-luciférine, sel de potassium </td><td> Or Biotechnology, Inc </td><td> LUCNA </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Logiciel </td></tr><tr><td> Insomniac2 </td><td> Disponible sur demande auprès des auteurs </td><td> coutume, écrit par Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) </td><td> Logiciel Matlab base qui a été utilisée en routine pour l&#39;analyse du sommeil 2,6,11 </td></tr><tr><td> Drosonex </td><td> Disponible sur demande auprès des auteurs </td><td> coutume, écrit par Thomas Coradetti (Software trottoir) </td><td> Un PC MSVC6 programme utilisé pour l&#39;analyse de survie à partir des fichiers de données brutes collectées dans leTrikinetics système </td></tr><tr><td> Photoshop CS3 </td><td> Adobe </td><td></td><td> Utile pour obtenir des numéros de ufc / plaque à partir d&#39;images numériques (en option) </td></tr></tbody></table>

quantitative measurement of the immune response and sleep in drosophila

Une interaction complexe entre la réponse immunitaire et comportement de l&#39;hôte a été décrit dans un large éventail d&#39;espèces. L&#39;excès de sommeil, en particulier, est connu pour se produire en réponse à l&#39;infection chez les mammifères 1 et a récemment été décrit chez Drosophila melanogaster 2. Il est généralement admis que le sommeil est bénéfique à l&#39;hôte lors d&#39;une infection et qu&#39;il est important pour le maintien d&#39;un système immunitaire robuste 3,4. Cependant, les preuves expérimentales qui soutient cette hypothèse est limité 4, et la fonction du sommeil en excès au cours d&#39;une réponse immunitaire reste incertaine. Nous avons utilisé une approche multidisciplinaire pour s&#39;attaquer à ce problème complexe, et ont mené des études dans le système modèle génétique simple, la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster. Nous utilisons un test standard pour mesurer le comportement locomoteur et de sommeil chez les mouches, et de montrer comment ce test est utilisé pour mesurer le comportement des mouches infected avec une souche pathogène de bactéries. Ce test est également utile pour contrôler la durée de survie chez les mouches individuels au cours d&#39;une infection. D&#39;autres mesures de la fonction immunitaire incluent la capacité de mouches pour effacer une infection et l&#39;activation de NFkB, un facteur de transcription clé qui est au cœur de la réponse immunitaire innée chez la drosophile. Résultats à la fois la survie et la clairance bactérienne au cours de l&#39;infection ainsi que des indicateurs de résistance et de tolérance à l&#39;infection. Résistance réfère à la capacité des mouches pour effacer une infection, tandis que la tolérance est définie comme la capacité de l&#39;hôte à limiter les dommages causés par une infection et ainsi survivre en dépit des niveaux élevés d&#39;agents pathogènes au sein du système 5. Surveillance en temps réel de l&#39;activité de NFkB cours de l&#39;infection permet de mieux comprendre un mécanisme moléculaire de survie lors de l&#39;infection. L&#39;utilisation de la drosophile dans ces essais simples facilite les analyses génétiques et moléculaires de sommeilet la réponse immunitaire et la manière dont ces deux systèmes complexes sont mutuellement influencés.

<ol><li> L&#39;infection favorise le sommeil. Dans cet exemple, Canton-S (CS) des mouches de type sauvage et les mouches mutantes dépourvues d&#39;un gène NFkB, relish (Rel E20) 14, ont été chargés dans deux DAM2 moniteurs d&#39;activité (n = 32 pour chaque génotype) et infectées comme décrit ci-dessus. Les mouches ont été maintenus dans une lumière constante pour éliminer l&#39;influence de l&#39;horloge circadienne sur le comportement et l&#39;infection 2,7,8. Les mutants ont été <sup...

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Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Pour comprendre le lien entre la réponse immunitaire et le comportement, nous décrivons une méthode pour mesurer le comportement locomoteur dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Lors d&#39;une infection bactérienne ainsi que la capacité des mouches à monter une réponse immunitaire par la survie de surveillance, la charge bactérienne, et en temps réel l&#39;activité d&#39;un régulateur clé de l&#39;immunité innée, NFkB.

Mesure quantitative de la réponse immunitaire et le sommeil en<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

quantitative-measurement-immune-response-sleep

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

15.3K vues.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. Pour comprendre le lien entre la réponse immunitaire et le comportement, nous décrivons une méthode pour mesurer le comportement locomoteur dans Drosophila Lors d'une infection bactérienne ainsi que la capacité des mouches à monter une réponse immunitaire par la survie de surveillance, la charge bactérienne, et en temps réel l'activité d'un régulateur clé de l'immunité innée, NFkB.

Vidéo: Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development of vaccines and therapeutics1,2,3. Here, we describe a method for the detailed phenotypic and functional analyses of cellular immune responses, specifically intracellular cytokine production by CD4+ and CD8+ T cells as well as the individual memory subsets. We obtained precise quantitative and qualitative measures for the production of interferon gamma (INF-) and interleukin (IL) -2 in both CD4+ and CD8+ T cells from the rhesus macaque PBMC stimulated with PMA plus ionomycin (PMA+I). The cytokine profiles were different in the different subsets of memory cells. Furthermore, this protocol provided us the sensitivity to demonstrate even minor fractions of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell subsets within the PBMC samples from rhesus macaques immunized with an HIV envelope peptide cocktail vaccine developed in our laboratory. The multicolor flow cytometry technique is a powerful tool to precisely identify different populations of T cells 4,5 with cytokine-producing capability6 following non-specific or antigen-specific stimulation 5,7.

We demonstrate the utility of multicolor flow cytometry for detailed phenotypic and functional characterization of total as well as memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in rhesus macaques, the ideal model for HIV/AIDS vaccine studies.

Analyses Multicolor cytométrie de flux de réponse immunitaire cellulaire dans les macaques rhésus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Recherche

Immunologie et infection

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Une introduction à guêpes parasites<em&gt; Drosophila</em&gt; Et la réponse immunitaire antiparasitaire

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Quantification de la réponse du Rafale respiratoire comme indicateur d&#39;Innate Immune Health chez le poisson zèbre

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

En utilisant l&#39;ARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

L&#39;utilisation de l&#39;oropharynx Intratrachéal PAMP administration et lavage broncho-alvéolaire pour évaluer l&#39;hôte une réaction immunitaire chez la souris

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Analyse in vitro de la réponse immunitaire cellulaire Myd88 médiation au virus du Nil occidental souche mutante Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imagerie non invasive de la réponse immunitaire innée dans un modèle de poisson zèbre larves de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Analyse qualitative et Quantitative de la Synapse immunitaire dans le système humain à l’aide d’imagerie de cytométrie en flux

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

Two-photon Imaging intravitale des leucocytes au cours de la réponse immunitaire dans le foie de souris traitées Lipopolysaccharide

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...