Cet essai in vivo de phagocytose permet aux chercheurs de réaliser des dépistages génétiques et des études d’association à l’échelle du génome afin d’identifier de nouveaux gènes qui régulent la phagocytose dans les cellules sanguines adultes. Cette expérience est quantitative, facile à réaliser et peut être appliquée au dépistage des animaux vivants pour les facteurs d’hôte qui influencent la reconnaissance, l’absorption et le dégagement des pathogènes. Après avoir tiré des capillaires en verre à parois minces à l’aide d’un tire-aiguille, utilisez un micromètre pour tenir l’aiguille au microscope et utilisez la pince à épiler en acier inoxydable à point fin numéro cinq pour briser la pointe à un diamètre de pointe de 100 micromètres.
Pour mesurer le volume de liquide qui sera injecté dans chaque mouche, chargez une aiguille capillaire avec une coloration stérile de 5 % des aliments dans PBS et expulsez le liquide sur une goutte d’huile minérale sur un micromètre de stade de 0,01 millimètre. Distribuez 10 microlitres de 1,6 milligramme par millilitre de particules sur un petit carré de parafilm, et tirez le liquide dans l’aiguille. Monter l’aiguille dans la buse injecteur, et tapisser les mouches anesthésiées le long de leur zone désignée sur la plaquette de vol, côté ventral vers le haut, avec les têtes orientées vers l’avant de la garniture.
Placez les flacons dans les zones correspondantes sur le banc, et injectez les mouches dans le coin supérieur de l’abdomen avec cinq pompes de 100 millisecondes de liquide pour livrer environ 10 nanolitres de particules au total. Transférez chaque mouche dans le flacon approprié au fur et à mesure qu’il est injecté, en notant l’heure sur le flacon. Ensuite, chargez une nouvelle aiguille avec la solution 0.4%Trypan Blue, et réglez l’injecteur pneumatique à la porte, pour permettre un flux constant d’air pour pousser le liquide hors de l’aiguille.
30 minutes après l’injection initiale, injectez chaque abdomen volant avec Trypan Blue jusqu’à ce que les abdomens soient pleins et distendus. Montez les mouches sur des glissières au microscope avec du ruban électrique, côté ventral vers le bas, poussant les ailes sur le côté de la mouche pour les fixer à la bande. Ensuite, poussez doucement la tête dans la bande pour vous assurer que la mouche ne bouge pas.
Immédiatement après que toutes les mouches ont été fixées, imagez les insectes, un à la fois, à un grossissement 25 ou 32 fois sur un microscope à fluorescence inversé attaché à un appareil photo numérique et un ordinateur, en se concentrant sur le récipient dorsale de chaque mouche en utilisant le logiciel pour l’appareil photo numérique. Ensuite, enregistrez le temps d’exposition et le grossissement entre les expériences. Pour quantifier la fluorescence, ouvrez un programme d’analyse d’imagerie approprié et ouvrez une image.
Pour mesurer l’intensité de fluorescence du vaisseau dorsal, dessinez un polygone autour du vaisseau dorsal et sélectionnez Mesure pour enregistrer l’intensité de fluorescence à l’intérieur du polygone. Pour déterminer l’intensité de fluorescence de fond, copiez le premier polygone et déplacez-le vers une zone adjacente au navire dorsal de chaque mouche. Ensuite, sélectionnez Mesurer et enregistrez l’intensité de fluorescence de la zone de fond.
Pour normaliser la fluorescence dorsale du vaisseau par fluorescence de fond, après avoir mesuré les intensités de fluorescence du reste des mouches, divisez la fluorescence dorsale du vaisseau par fluorescence de fond et calculez l’intensité moyenne normalisée de fluorescence des vaisseaux dorsal de toutes les mouches dans une seule souche. Après avoir été monté côté ventral vers le bas sur un morceau de ruban électrique, les deux premiers segments de l’abdomen, où le vaisseau dorsal est situé, sont clairement visibles. Les principales sources d’erreur expérimentale surviennent aux étapes d’injection et d’imagerie de la procédure.
L’utilisation de la même aiguille pour injecter plusieurs mouches peut l’obstruer avec du tissu volant ou des particules. Les mouches qui ne reçoivent pas suffisamment de fluorescence Trypan Blue brillamment dans tout leur abdomen, ce qui peut réduire le rapport du vaisseau dorsal à la fluorescence de fond, diminuant ainsi le véritable rapport d’intensité de fluorescence de l’animal. Les mouches doivent être photographiées lorsqu’elles sont immobilisées par le dioxyde de carbone, car les mouches qui se déplacent activement produisent des images floues qui ne peuvent pas être quantifiées.
Une lignée mutante de la collection Zuker de mouches traitées au méthane éthylique est incapable de phagocytose gram-négatif et gram-positif bactéries et affiche presque aucune fluorescence des vaisseaux dorsal dans l’essai in vivo phagocytosis, jumelé à l’arrière-plan isogénique Zuker souche et une autre souche commune de contrôle de laboratoire. Gardez une trace de l’heure et de l’ordre dans lequel les mouches sont injectées pour s’assurer que les mouches sont à des stades comparables de reconnaissance et d’absorption d’agents pathogènes lorsqu’elles sont photographiées. Les mécanismes moléculaires sous-jacents aux défauts phagocytiques peuvent être déterminés en étudiant les hémocytes simples avec microscopie confoccale ou après le tri cellulaire activé par fluorescence ou par isolement magnétique des hémocytes adultes.
