Nous tenons à remercier Marc Leonard de Carleton Immersive Media Studio pour une assistance technique experte dans la production et le montage vidéo et le Dr Martin Bertrand de Carleton Immersive Media Laboratory régénération Studio / Neural à l&#39;aide du modèle visuel. Les auteurs tiennent à remercier le conseil d&#39;expert du Dr Marilyn Keaney et tout son personnel dévoué de l&#39;Université de protection des animaux d&#39;Ottawa et les Services vétérinaires. Ce travail a été financé par l&#39;Institut canadien de recherche en santé du Canada (IRSC, MOP 62826) pour SALB, l&#39;Institut du vieillissement des IRSC et l&#39;Initiative stratégique de formation en recherche en santé / Programme de formation des IRSC en Lipidomique neurodégénératives (96121 TGF) à SALB et SF, Fondation canadienne pour l&#39;innovation à SF, Ontario Innovation Trust à SF, et Autodesk recherche à SF. ACM reçoit une Banting et Best IRSC bourse de doctorat. NV reçoit une bourse de recherche post-professionnelle de l&#39;Institut du vieillissement des IRSC et de formation dans Lipidomique neurodégénératives.

1. Réactifs Préparation <ol><li> Pour un lavage vaginal stérile, autoclave eau bidistillée (ddH 2 O) et conserver dans un contenant hermétique à la température ambiante jusqu&#39;au moment de servir. </li><li> Pour l&#39;évaluation cytologique, ajouter 0,1 g de poudre de cristal violet à 100 ml de ddH 2 O. Mélangez bien. Cristal violet tache (0,1%) peut être conservé dans un récipient hermétique à température ambiante jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol> 2. Collecte des cellules vaginales (lavage vaginal) <ol><li> Monter une ampoule de latex sur la fin d&#39;une pointe stérile 200 ul et d&#39;établir environ 100 ul d&#39;eau stérile ddH 2 O en utilisant les graduations sur le bout de ligne directrice volume. </li><li> Soulevez la souris hors de sa cage et la placer sur la trémie cage (couvercle) avec son arrière-train / arrière vers vous. </li><li> Saisir fermement la queue et élever l&#39;extrémité arrière. La souris sera désormais seulement ses pattes avant saisie de la trémie. A ce stade, la souris peut uriner. Si c&#39;est le cas, Attendez jusqu&#39;à l&#39;arrêt de la miction. Faut-il urine gauche à l&#39;entrée du canal vaginal, vous pouvez rincer l&#39;ouverture avec un excès de O 2 en utilisant ddH une pointe distincte (c&#39;est à dire pas le bout de votre prélèvement de l&#39;échantillon). </li><li> Placer l&#39;extrémité de la ddH 2 O-remplie pointe à l&#39;ouverture du canal vaginal en prenant soin de ne pas pénétrer dans l&#39;orifice vaginal comme (et du col) peut induire une stimulation pseudogestation chez le rat 1,2. Des rapports récents suggèrent souris sont moins sensibles à cet effet néanmoins des précautions doivent être prises pour minimiser le degré d&#39;envahissement dans les analyses répétées 3. </li><li> Enfoncer doucement l&#39;ampoule pour expulser quart-moitié du volume d&#39;eau (~ 25-50 pi) à l&#39;ouverture de canal vaginal. Le liquide spontanément aspirer dans le canal sans pointe d&#39;insertion. Relâcher lentement la pression exercée sur l&#39;ampoule. Le liquide se replier dans la pointe. Évitez de libération de pression trop rapidement pour prévenir l&#39;aspiration de liquidedans l&#39;ampoule. Un conseil filtrée peut être utile à cet effet. </li><li> Répétez les étapes précédentes fois 4-5, en utilisant le même embout, ampoule, et fluide pour obtenir un nombre suffisant de cellules dans un seul échantillon. </li><li> Placez le fluide sur lame de verre, et de permettre le frottis sécher complètement à température ambiante. Une fois sec, ces frottis oestrus peut être teinté immédiatement ou stockées et colorées à une date ultérieure. </li></ol> 3. La coloration cytologique l&#39;aide de Crystal Violet * 4 <ol><li> Placer la lame à sec dans un bocal Coplin (ou un autre récipient coloration comparable) contenant le cristal violet coloration pendant 1 min. </li><li> Enlever à un deuxième pot Coplin contenant ddH 2 O. Laver la lame avec ddH 2 O pendant 1 min. Répéter. </li><li> Retirer l&#39;excédent ddH 2 O à partir des bords de la lame avec un tissu d&#39;essuie-glace légers, en évitant le contact avec le frottis coloré. </li><li> Pipeter environ 15 ul de glycérol sur le dessus du frottis et le couvercleglisser. Alternativement, d&#39;autres réactifs histologiques de montage peut être utilisé pour obtenir un plus permanent, non diffusant tache. </li></ol> * La méthode de coloration décrite ici est la procédure la plus simple qui peut être effectuée dans n&#39;importe quel laboratoire. D&#39;autres méthodes peuvent fournir des détails supplémentaires. Par exemple, en utilisant une coloration de Papanicolaou, la maturité des cellules épithéliales nucléées peuvent être distingués avec des cellules colorées turquoise moins matures et plus cellules matures rose ou orange-colorés. Ces différences peuvent être utilisés pour organiser proestrus tôt ou tard 4. 4. Cytologie vaginale <ol><li> Examiner le frottis au microscope optique pour déterminer les types cellulaires présents. L&#39;examen microscopique doit être effectué immédiatement après la coloration comme le cristal violet va diffuser à partir des cellules au cours du temps lors de l&#39;utilisation du glycérol pour recouvrement. Microphotographies doivent être prises au moment de l&#39;analyse pour documenter la cytologie. </li><li> Commençons par examiner le entire frottis à un faible grossissement. Sélectionnez une zone représentative et passer à un plus fort grossissement. Vous verrez cornified cellules épithéliales squameuses, leucocytes et / ou nucléées cellules épithéliales (résultats représentatifs, figure 1A-C). Le rapport présente des cellules vous permettra de déterminer le stade oestrus de votre souris au moment du prélèvement des échantillons (résultats représentatifs, figure 1D-G) et son statut hormonal immédiat (discussion, figure 2). </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Cytologie: Trois types de cellules primaires peuvent être détectés dans des échantillons de frottis vaginaux: (1) nucléés cellules épithéliales (Figure 1A), (2) cornified cellules épithéliales squameuses (figure 1B), et (3) des leucocytes (figure 1C). Nucléées cellules épithéliales ont un cytoplasme légèrement teinté, plus sombre teinté membrane plasmique, et un noyau ovale ( <strong&gt; Figure 1A). Cornified cellules épithéliales squameuses sont uniformément colorées, plus de forme polygonale que leurs prédécesseurs nucléées épithéliales, et n&#39;ont pas de noyau (figure 1B). Leucocytes polynucléaires peuvent être distinguées des cellules épithéliales par leur forme irrégulière, sombre et teinté noyaux polymorphes, et de petite taille (figure 1C, flèches noires). En cas de contamination d&#39;urine être présents dans le frottis, cristaux d&#39;acide urique sont facilement détectés par leurs structures cristallines différentes à tous les types de cellules attendus (figure 3). Si cela se produit, et la détection obscure de type cellulaire prédominant, le frottis doit être jeté et ne pas utiliser pour des fins de mise en scène. Mise en scène: Le rapport relatif des types cellulaires observées dans les frottis peut être utilisée pour identifier le stade du cycle oestral de votre souris sur le jour du prélèvement de l&#39;échantillon (figure 1D-G). Pendant proestrus, les cellules sont presque exclusivementdes grappes de ronde, bien formée nucléées cellules épithéliales (figure 1D, cellule représentant a indiqué par la flèche blanche). Au cours de l&#39;oestrus, les cellules sont principalement cornified cellules épithéliales squameuses, présents dans les amas denses (figure 1E, cellule représentant a indiqué par flèche). Pendant metestrus, petits leucocytes colorés en foncé prédominent (figure 1F, cellule représentant a indiqué par la flèche noire). Cornified cellules épithéliales squameuses peuvent être observés, souvent en fragments, (figure 1F, cellule représentant a indiqué par flèche noire). Pendant diestrus, rares cornées cellules épithéliales squameuses peuvent encore être présentes (figure 1G, cellule représentant a indiqué par flèche noire), mais les leucocytes continuent de prédominer (figure 1G, cellule représentant a indiqué par la flèche noire). Metestrus peut être distingué de dioestrus par l&#39;apparition de cellules épithéliales nucléées dans dioestrus ( <stron<html> g&gt; Figure 1G, cellule représentant a indiqué par la flèche blanche). <img src="/files/ftp_upload/4389/4389fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. L&#39;évaluation cytologique des frottis vaginaux peuvent être utilisés pour identifier stade oestrus Trois principaux types cellulaires sont détectées dans des échantillons de frottis vaginaux:. (A) nucléées, les cellules épithéliales (B) cornées squameuses cellules épithéliales, et (C) des leucocytes. Le rapport de ces types de cellules présents dans le frottis peut être utilisée pour identifier les souris (D) proestrus, (E) l&#39;oestrus, (F) metestrus, ou (G) tel que décrit dans dioestrus résultats représentatifs. Têtes de flèches noires en E, F et G à représentatives point de cornées cellules épithéliales squameuses. Les flèches noires en C, F et du point G à leykocytes représentatives. Les flèches blanches dans D et G représentant culminant nucléation des cellules épithéliales. . Jpg &quot;alt =&quot; Figure 2 &quot;/&gt; Figure 2. Cytologie sur frottis vaginal reflète les événements endocriniens sous-jacents. Détails sont également fournis dans le rapport. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4389/4389fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/4389/4389fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Cristaux d&#39;acide urique peuvent être présentes ci-dessous coloration au cristal violet d&#39;urine contaminés par des échantillons. (A) Les cristaux sont transparents et peuvent être de tailles différentes (flèches et de la région en boîte agrandies en (B)). Pas de cellules sont présentes dans ce domaine. Devrait urique contamination cristal d&#39;acide dans les champs utilisés pour la coloration cytologique être présent, il peut être difficile d&#39;identifier avec précision les types cellulaires présents et le frottis doit être jeté. Barres d&#39;échelle = 50 um.

<ol>
	<li>Adler, N. T., Zoloth, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copulatory+behavior+can+inhibit+pregnancy+in+female+rats.">Copulatory behavior can inhibit pregnancy in female rats.</a> Science. 168, 1480-1482 (1970).</li><li>Adler, N. T., Resko, J. A., Goy, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+copulatory+behavior+on+hormonal+change+in+the+female+rat+prior+to+implantation.">The effect of copulatory behavior on hormonal change in the female rat prior to implantation.</a> Physiology. 5, 1003-1007 (1970).</li><li>Yang, J. J., Larsen, C. M., Grattan, D. R., Erskine, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating-induced+neuroendocrine+responses+during+pseudopregnancy+in+the+female+mouse.">Mating-induced neuroendocrine responses during pseudopregnancy in the female mouse.</a> Journal of. 21, 30-39 (2009).</li><li>Hong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+mouse+estrus+cycle+in+response+to+BRCA1+inactivation+suggest+a+potential+link+between+risk+factors+for+familial+and+sporadic+ovarian+cancer.">Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and sporadic ovarian cancer.</a> Cancer research. 70, 221-228 (2010).</li><li>Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+menstrual+cycle:+basic+biology.">The menstrual cycle: basic biology.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1135, 10-18 (2008).</li><li>Walmer, D. K., Wrona, M. A., Hughes, C. L., Nelson, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactoferrin+expression+in+the+mouse+reproductive+tract+during+the+natural+estrous+cycle:+correlation+with+circulating+estradiol+and+progesterone.">Lactoferrin expression in the mouse reproductive tract during the natural estrous cycle: correlation with circulating estradiol and progesterone.</a> Endocrinology. 131, 1458-1466 (1992).</li><li>Parkening, T. A., Collins, T. J., Smith, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+and+pituitary+concentrations+of+LH,+FSH,+and+prolactin+in+aging+C57BL/6+mice+at+various+times+of+the+estrous+cycle.">Plasma and pituitary concentrations of LH, FSH, and prolactin in aging C57BL/6 mice at various times of the estrous cycle.</a> Neurobiology of aging. 3, 31-35 (1982).</li><li>Sarkar, D. K., Chiappa, S. A., Fink, G., Sherwood, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gonadotropin-releasing+hormone+surge+in+pro-oestrous+rats.">Gonadotropin-releasing hormone surge in pro-oestrous rats.</a> Nature. 264, 461-463 (1976).</li><li>Rajendren, G., Gibson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+confocal+microscopic+study+of+synaptic+inputs+to+gonadotropin-releasing+hormone+cells+in+mouse+brain:+regional+differences+and+enhancement+by+estrogen.">A confocal microscopic study of synaptic inputs to gonadotropin-releasing hormone cells in mouse brain: regional differences and enhancement by estrogen.</a> Neuroendocrinology. 73, 84-90 (2001).</li><li>Kumar, T. R., Wang, Y., Lu, N., Matzuk, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicle+stimulating+hormone+is+required+for+ovarian+follicle+maturation+but+not+male+fertility.">Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility.</a> Nature. 15, 201-204 (1997).</li><li>Montgomery, V., Loutradis, D., Tulchinsky, D., Kiessling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH-induced+ovulation+in+intact+and+hypophysectomized+mice.">FSH-induced ovulation in intact and hypophysectomized mice.</a> Journal of reproduction and fertility. 84, 1-6 (1988).</li><li>Mihm, M., Gangooly, S., Muttukrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+menstrual+cycle+in+women.">The normal menstrual cycle in women.</a> Animal reproduction science. , 124-229 (2011).</li><li>Appelgren, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+demonstration+of+drug+interference+with+progesterone+synthesis.">Histochemical demonstration of drug interference with progesterone synthesis.</a> Journal of reproduction and. 19, 185-186 (1969).</li><li>Sander, V. A., Facorro, G. B., Piehl, L., de Celis Rubin, E., Motta, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+DHEA+and+metformin+on+corpus+luteum+in+mice.">Effect of DHEA and metformin on corpus luteum in mice.</a> Reproduction. 138, 571-579 (2009).</li><li>Stocco, C., Telleria, C., Gibori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+control+of+corpus+luteum+formation,+function,+and+regression.">The molecular control of corpus luteum formation, function, and regression.</a> Endocrine reviews. 28, 117-149 (2007).</li><li>Rudolph, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+overt+menstruation+in+intact+mice.">Induction of overt menstruation in intact mice.</a> PLoS One. 7, e32922 (2012).</li><li>Yano, J., Lilly, E., Barousse, M., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell-derived+S100+calcium-binding+proteins+as+key+mediators+in+the+hallmark+acute+neutrophil+response+during+Candida+vaginitis.">Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis.</a> Infection and immunity. 78, 5126-5137 (2010).</li><li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+anoestrus+in+mice+caged+in+groups.">Occurrence of anoestrus in mice caged in groups.</a> The Journal of endocrinology. 18, 102-107 (1959).</li><li>Lamond, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stimulation+derived+from+other+animals+of+the+same+species+on+oestrous+cycles+in+mice.">Effect of stimulation derived from other animals of the same species on oestrous cycles in mice.</a> The Journal of endocrinology. 18, 343-349 (1959).</li><li>Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+of+estrous+cyclicity+in+aging+C57BL/6J+mice:+I.+Cycle+frequency,+length+and+vaginal+cytology.">A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology.</a> Biology of reproduction. 27, 327-339 (1982).</li><li>Felicio, L. S., Nelson, J. F., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+studies+of+estrous+cyclicity+in+aging+C57BL/6J+mice:+II.+Cessation+of+cyclicity+and+the+duration+of+persistent+vaginal+cornification.">Longitudinal studies of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: II. Cessation of cyclicity and the duration of persistent vaginal cornification.</a> Biology of reproduction. 31, 446-453 (1984).</li><li>Van Der Lee, S., Boot, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+pseudopregnancy+in+mice.+II.">Spontaneous pseudopregnancy in mice. II.</a> Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 5, 213-215 (1956).</li><li>Van Der Lee, S., Boot, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+pseudopregnancy+in+mice.">Spontaneous pseudopregnancy in mice.</a> Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 4, 442-444 (1955).</li><li>Armaiz-Pena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrous+cycle+modulates+ovarian+carcinoma+growth.">Estrous cycle modulates ovarian carcinoma growth.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 15, 2971-2978 (2009).</li><li>Jemiolo, B., Harvey, S., Novotny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+the+Whitten+effect+in+female+mice+by+synthetic+analogs+of+male+urinary+constituents.">Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4576-4579 (1986).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d&#39;intérêts. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en stricte conformité avec les directives et règlements établis par l&#39;Université d&#39;Ottawa Comité des soins des animaux et le Conseil canadien de protection des animaux.

Ces changements dans la typologie cellules sont indicatifs d&#39;événements endocriniens sous-jacents. La phase de proestrus du cycle oestral correspond à la phase folliculaire humain du cycle menstruel et 5 est défini par une augmentation pré-ovulatoire en circulation β-17-estradiol 6, ainsi que d&#39;une petite poussée en prolactine 7 (Figure 2, Proestrus, panneau de gauche). L&#39;augmentation de la 17-β-estradiol stimule indirectement gonadolibérine hormone de neurones dans l&#39;hypothalamus et le septum qui, à leur tour, activent les cellules sensibles dans l&#39;hypophyse antérieure pour libérer l&#39;hormone lutéinisante et hormone folliculo-stimulante dans la circulation 8,9 (figure 2 , Proestrus, panneau de gauche). Dans les frottis vaginaux prélevés sur des animaux dans proestrus, les cellules sont presque exclusivement des ovales nucléées cellules épithéliales (figure 1D, figure 2, Proestrus, panneau de droite). Le pic de folliculo-stimulante hormune ovulation et les niveaux des signaux d&#39;entrée en oestrus 10,11. Au cours de l&#39;oestrus, 17-β-estradiol et de prolactine baisse des niveaux de pointe 6,7 (Figure 2, oestrus, panneau de gauche). Frottis vaginaux sont caractérisées par une détection quasi exclusif de cornées irrégulières cellules épithéliales squameuses souvent en touffes (figure 1E, figure 2, oestrus, panneau de droite). Entrée en metestrus coïncide avec une hausse continue des taux d&#39;hormones progestérone 6 et correspond au début de la phase lutéale humaine 12 (figure 2, metestrus, panneau de gauche). Comme les niveaux de progestérone commence à augmenter et il ya une petite abattée en 17-β-estradiol en réponse à l&#39;activation du corps jaune 6,13,14 (Figure 2, metestrus, panneau de gauche). Les types cellulaires présents dans les frottis vaginaux au cours de cette étape sont fragmentés, cornées cellules épithéliales et les leucocytes sombres petites tachés (Figure 1F, figure 2, metestrus, panneau de droite). Enfin, l&#39;entrée en diestrus chez la souris se produit et les taux circulants de progestérone pic 6, correspondant à la phase lutéale tardive de l&#39;homme 12. Régression du corps jaune entraîne une baisse brutale de la progestérone 15,16 (figure 2, Diestrus, panneau de gauche). Leucocytes prédominent dans les frottis au cours diestrus. La fréquence des cornées cellules épithéliales est réduite et nucléées cellules épithéliales commencent à être détectée juste avant la transition à proestrus (figure 1G, figure 2, Diestrus, panneau de droite). En résumé, ce protocole simple, la routine peut être utilisée pour estimer les fluctuations hormonales quotidiennes et d&#39;établir stade oestrus chez les souris expérimentales, sans modifier le statut reproducteur si les précautions suivantes sont prises. L&#39;échantillonnage doit être effectué au plus une fois par jour en utilisant le protocole non invasif described ici par rapport à la pénétration répétée du canal vaginal, aspiration, et une agitation. Ceci peut provoquer une irritation vaginale, résultant en une réponse inflammatoire résultant 17 dans les leucocytes et les autres types de cellules d&#39;être présents dans les frottis qui peuvent confondre évaluation cytologique. En outre, même dans les colonies logées les femmes, il est normal de voir diestrus longues et des stades différents d&#39;oestrus chez la souris que l&#39;induction et de 18 anestrous et cette identification est utile dans l&#39;interprétation de l&#39;impact hormonal de la reproduction, le sexe et l&#39;étude des maladies. La variabilité dans la longueur du cycle est également mis en place avec l&#39;âge et par les différences de logements dans les colonies (individu ou un groupe-logement) des femelles 7,19-21. Femelles hébergées chez la femelle-seulement les colonies peuvent cesser de vélo et entrer dans un état ​​de longue diestrus 18,22,23 bien que le vélo peut être rétablie par l&#39;exposition à des cages prétraitées avec de l&#39;urine mâle à obtenir le cyclisme 24,25. Ainsi, pour établir individualongueurs de cycle l pour une souris donnée, il est recommandé que les évaluations non invasives décrites ici sont effectuées chaque jour, avec soin, jusqu&#39;à ce que deux cycles complets sont respectées.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue # </td></tr><tr><td> Stériles 200 embouts de pipette ul </td><td> Diamed </td><td> E340901 </td></tr><tr><td> Poire latex (1 ml) </td><td> Pêcheur </td><td> 03-488-21 </td></tr><tr><td> Lames de microscope </td><td> Pêcheur </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Cristal Violet tache (25 g) </td><td> Pêcheur </td><td> C581-25 </td></tr><tr><td> Essuie-glaces tissus légers </td><td> VWR </td><td> 82003-820 </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Pêcheur </td><td> BP229-1 </td></tr><tr><td> Couverture en verre de microscope (22x30) </td><td> Pêcheur </td><td> 12-544A </td></tr></tbody></table>

performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification

Un moyen rapide d&#39;évaluer le statut reproducteur chez les rongeurs n&#39;est pas seulement utile dans l&#39;étude des troubles de la reproduction, mais est également nécessaire pour la production de nouveaux modèles de souris de la maladie et des enquêtes sur la régulation hormonale de la dégénérescence des tissus (ou régénération) après l&#39;épreuve pathologique. Le murin de reproduction (ou oestrus) cycle est divisé en 4 étapes: pro-œstrus, oestrus, metestrus et diœstrus. Fluctuations définies dans les taux circulants des stéroïdes ovariens 17-β-estradiol et de progestérone, les gonadotrophines lutéinisante et folliculo hormones stimulantes, et la transition hormone prolactine lutéotrope signal à travers ces étapes de la reproduction. Les changements dans la typologie de cellules dans le canal vaginal murin tenir compte de ces événements endocriniens sous-jacents. Évaluation journalière de la proportion relative des cellules épithéliales nucléées, cornées cellules épithéliales squameuses, et les leucocytes présents dans les frottis vaginaux peuvent être utilisées pour identifier oestral murinstades. Le degré d&#39;invasivité, cependant, employées dans la collecte de ces échantillons peuvent modifier le statut de la reproduction et provoquer une réponse inflammatoire qui peut confondre l&#39;évaluation cytologique du frottis. Ici, nous décrivons un simple, non invasive protocole qui peut être utilisé pour déterminer le stade du cycle oestral d&#39;une souris femelle sans altérer son cycle de reproduction. Nous détaillons comment faire la différence entre les quatre étapes du cycle œstral par la collecte et l&#39;analyse de la typologie cellulaire prédominant dans les frottis vaginaux et nous montrons comment ces changements peuvent être interprétés en ce qui concerne le statut endocrinien.

Watch this Scientific Journal Video about Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification at JoVE.com

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

Ici, nous décrivons comment identifier le stade de la reproduction murin (proestrus, oestrus, metestrus ou diestrus) par simple, non invasive collecte et l&#39;évaluation cytologique des échantillons frottis vaginaux. En outre, nous décrivons comment la cytologie vaginale reflète les taux circulants hormonaux qui sous-tendent la transition dans le cycle de reproduction murin.

De procéder au lavage vaginal, coloration au cristal violet et l&#39;évaluation cytologique vaginal pour Souris cycle œstral Staging identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

performing-vaginal-lavage-crystal-violet-staining-vaginal-cytological

Research

JoVE Journal

Biology

110.1K vues.  Neural Regeneration Laboratory and Ottawa Institute of Systems Biology. Ici, nous décrivons comment identifier le stade de la reproduction murin (proestrus, oestrus, metestrus ou diestrus) par simple, non invasive collecte et l'évaluation cytologique des échantillons frottis vaginaux. En outre, nous décrivons comment la cytologie vaginale reflète les taux circulants hormonaux qui sous-tendent la transition dans le cycle de reproduction murin.

Vidéo: Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

Une réversible, méthode non-invasive pour les mesures de résistance des voies aériennes et d&#39;échantillonnage du liquide de lavage broncho-alvéolaire chez des souris

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Recherche

Biologie

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

L&#39;imagerie in vivo et des traitements thérapeutiques dans un modèle de souris orthotopique de cancer des ovaires

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluation de développement des glandes mammaires et fonction dans des modèles murins

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

De cellules vivantes analyse du cycle de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tissus en utilisant le Attune acoustique Cytometer Concentrer et Vybrant DyeCycle ADN Violet Stain

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. The advantages of pyrosequencing for microbiology applications include rapid and reliable high-throughput screening and accurate identification of microbes and microbial genome mutations. Pyrosequencing involves sequencing of DNA by synthesizing the complementary strand a single base at a time, while determining the specific nucleotide being incorporated during the synthesis reaction. The reaction occurs on immobilized single stranded template DNA where the four deoxyribonucleotides (dNTP) are added sequentially and the unincorporated dNTPs are enzymatically degraded before addition of the next dNTP to the synthesis reaction. Detection of the specific base incorporated into the template is monitored by generation of chemiluminescent signals. The order of dNTPs that produce the chemiluminescent signals determines the DNA sequence of the template. The real-time sequencing capability of pyrosequencing technology enables rapid microbial identification in a single assay. In addition, the pyrosequencing instrument, can analyze the full genetic diversity of anti-microbial drug resistance, including typing of SNPs, point mutations, insertions, and deletions, as well as quantification of multiple gene copies that may occur in some anti-microbial resistance patterns.

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains, and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. In this video, the procedure for microbial amplicon generation, amplicon pyrosequencing, and DNA sequence analysis will be demonstrated.

Pyrosequencing pour l&#39;identification microbienne et Caractérisation

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

Cytologique Analyse de la spermatogenèse: Préparatifs en direct et fixes de<em&gt; Drosophila</em&gt; Testicules

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary changes. In particular, the adult stage is a rich source of morphological traits for interspecific comparison, including wing pigmentation comparison. To study developmental differences among species, detailed observation and appropriate staging are required for precise comparison. Here we describe protocols for staging of pupal periods and quantification of wing pigmentation in a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera. First, we describe the method for detailed morphological observation and definition of pupal stages based on morphologies. This method includes a technique for removing the puparium, which is the outer chitinous case of the pupa, to enable detailed observation of pupal morphologies. Second, we describe the method for measuring the duration of defined pupal stages. Finally, we describe the method for quantification of wing pigmentation based on image analysis using digital images and ImageJ software. With these methods, we can establish a solid basis for comparing developmental processes of adult traits during pupal stages.

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Protocols for staging pupal periods and measurement of wing pigmentation of Drosophila guttifera are described. Staging and quantification of pigmentation provide a solid basis for studying developmental mechanisms of adult traits and enable interspecific comparison of trait development.

Méthodes pour la mise en scène des périodes nymphale et mesure de Pigmentation de l’aile de Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

TRANS-intérieur cellulaire massive Injection de cellules souches embryonnaires conduit à des taux plus élevés de chimérisme

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

Quantification de l’abondance de lipides et évaluation de la Distribution des lipides du Nil rouge et huile rouge O coloration de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, uncoupling of metabolism to generate heat, and secretion of adipokines to regulate whole-body homeostasis and immune responses. Emerging research is identifying important regional differences in the developmental, molecular, and functional profiles of adipocytes located in discrete depots throughout the body. Different properties of the depots are medically relevant since metabolic diseases often demonstrate depot-specific effects. This protocol will provide investigators with a detailed anatomic atlas and dissection guide for the reproducible and accurate identification and excision of diverse mouse adipose tissues. Standardized dissection of discrete adipose depots will allow detailed comparisons of their molecular and metabolic characteristics and contributions to local and systemic pathologic states under various nutritional and environmental conditions.

Adipocytes exist in discrete depots and have diverse roles within their unique microenvironments. As regional differences in adipocyte character and function are uncovered, standardized identification and isolation of depots is crucial for advancement of the field. Herein, we present a detailed protocol for the excision of various mouse adipose depots.

Identification et dissection des dépôts d'adipose de souris diverses

Adipose tissues are complex organs with a wide array of functions, including storage and mobilization of energy in response to local and global needs, ...