Ce travail a été soutenu par R01 AI32556 (NIAID, Institut national de santé). Ce travail a également été soutenu en partie par la Louisiane Vaccine Center et sud de la Louisiane Institut de recherche sur les maladies infectieuses commandité par le Conseil ontarien des affaires collégiales en Louisiane.

1. L&#39;inoculation vaginale avec Candida albicans <ol><li> Trois jours avant l&#39;inoculation, tout en limitant l&#39;animal afin d&#39;exposer l&#39;abdomen, injecter 100 ml d&#39;huile de sésame contient de 0.1 à 0.5 mg de β-estradiol par voie sous cutanée dans l&#39;abdomen inférieur. Avancer l&#39;aiguille d&#39;environ 5 à 10 mm latéral à la peau pour limiter les fuites au site d&#39;injection. L&#39;administration sous-cutanée d&#39;œstrogènes dans le bas-ventre est optimale dans ce modèle en raison de la proximité de l&#39;appareil génital. Les doses efficaces peuvent varier selon les souches de souris, les âges ou les dérivés de l&#39;œstrogène. Dans des études précédentes utilisant l&#39;ABC-J (H-2 κ), C3H/HeN (H-2 κ), C57BL / 6 (H-2 b), Balb / c (H-2 d), DBA / 2 (H- 2 d), SJL (H-2 s) des souris à 6-8 semaines d&#39;âge, 0,1 mg/100 ul a été trouvé efficace en témoigne l&#39;épaississement de la paroi vaginale, diminution du mucus vaginal etaugmenté mue des cellules épithéliales. Souris-dessus traitée avec de l&#39;oestrogène à cette concentration d&#39;exposition cohérents colonisation vaginale par Candida. Pour l&#39;inoculation des souris d&#39;autres souches et l&#39;âge, une étude pilote est recommandé pour garantir l&#39;efficacité de l&#39;œstrogène dans les conditions modifiées et d&#39;augmenter la dose d&#39;œstrogène si nécessaire. La solution d&#39;œstrogènes doit être préparé à chaque fois le jour de l&#39;injection. Pour assurer une solubilité complète de l&#39;oestrogène dans l&#39;huile de sésame, bien mélanger la solution en utilisant un mélangeur à vortex et de la chaleur par intermittence à 37 ° C. Répéter l&#39;injection hebdomadaire pendant toute la période d&#39;étude. </li><li> Pour préparer l&#39;inoculum, ajouter une anse de C. albicans blastoconidia partir d&#39;une préparation subculture récents sur Sabouraud-dextrose agar (SDA) dans 10 ml de bouillon de peptone-phytone complété avec 0,1% de glucose. Incuber le bouillon de culture à la phase stationnaire pendant 18 h à 25 ° C dans un bain d&#39;eau agité. </li><li> Après l&#39;incubation, de recueillir èmebouillon de culture électronique dans un tube de 15 ml conique et centrifuger à 800 xg pendant 5 min. Laver le culot à deux reprises avec du PBS stérile. </li><li> Énumérer blastoconidia viable sur un hémocytomètre par bleu trypan exclusion. Ajuster la concentration cellulaire à 2,5 x 10 6 / ml (ou à une concentration de l&#39;inoculum désiré) dans du PBS stérile. </li><li> Pour stabiliser la souris, maintenez la base de la queue avec deux doigts et soulevez les hanches vers le haut afin que l&#39;ouverture vaginale est tourné vers vous (Figure 1A). Elle est idéale si la souris est placé sur une surface plane râpé (sommet de cage par exemple) afin que les souris peuvent fournir une résistance contre les restrictions de la queue. </li><li> Pipeter 20 pl (ou un volume souhaité de ne pas dépasser 20 pi) de la suspension inoculum en insérant la pointe de la pipette d&#39;environ 5 mm de profondeur dans la lumière vaginale (figure 1B). Terminez cette étape aussi rapidement et doucement que possible pour minimiser la détresse chez la souris. </li></ol> 2. Lavages vaginaux <ol><li> Après l&#39;euthanasie (ou l&#39;anesthésie), hanciens de la souris vers le bas par la base de la queue avec deux doigts pour que l&#39;ouverture vaginale est exposée. </li><li> Lavage de la lumière vaginale en introduisant 100 ul de PBS stérile avec l&#39;aspiration répétée et agitation avec une pointe de pipette. La pointe de la pipette peut devenir obstrués par les cellules. Si cela se produit, passer les cellules obstruction et continuer avec le reste lavaging PBS dans le vagin. Recueillir le liquide de lavage dans un tube à centrifuger. </li><li> Alternativement, lavages vaginaux peuvent être effectuées sur des souris anesthésiées à l&#39;anesthésie par inhalation d&#39;isoflurane. Pour cela, exposer des souris à l&#39;isoflurane vaporisé jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient pleinement mis sous sédation (~ 30 sec.). Tenez la souris vers le bas par la base de la queue et doucement la lumière lavage vaginal avec 50 ul de PBS stérile. Veillez à éviter l&#39;agitation sévère avec un embout de pipette pour minimiser les traumatismes du vagin pendant cette procédure. Souris Sedated devrait remettre de l&#39;anesthésie dans les 30 secondes d&#39;exposition à l&#39;air ambiant. L&#39;isofluranepeut être vaporisé en utilisant un vaporisateur d&#39;isoflurane et O 2 (de préférence) ou un système de chute standard chambre fermée anesthésie sans le système de vaporisateur (nécessite une surveillance étroite de l&#39;animal tout en sédation pour éviter la détresse respiratoire). Lavages vaginaux sur les souris anesthésiées devrait être la méthode de choix pour les échantillons de lavage longitudinale sur les mêmes souris. Lavaging consécutives ne pas influencer l&#39;évaluation de la charge fongique dans le temps 41. </li><li> Pour les préparations humides de montage, le transfert 10 pl de la liquide de lavage sur une lame de verre et observer à un grossissement de 400-1000x par microscopie optique. En outre, les fractions cellulaires du liquide de lavage peut être teinté d&#39;examiner des cellules et des morphologies nucléaires. Pour les préparations de frottis, le transfert de 10 ul du liquide de lavage sur une lame de verre et écartez doucement à l&#39;aide de la paroi extérieure d&#39;une extrémité de la pipette. Préserver les échantillons de frottis avec fixateur CYTOPREP et tacher par la technique de Papanicolaou standard (test de Pap). Observez à un grossissement de 400 par microscopie optique. </li></ol> 3. Quantification de la charge fongique vaginale <ol><li> Dans une 96 puits à fond rond plaque, transférer le liquide de lavage dans un puits de la rangée du haut et 180 ul de PBS stérile dans le puits 5 à la suite de cette colonne (bas de la plaque). </li><li> Faire 1:10 dilutions successives de liquide de lavage vaginal en transférant les 20 ul du fluide pour le bien dans la colonne suivante. Mélanger soigneusement par aspiration répétée avant chaque transfert. Des dilutions en série d&#39;un maximum de 12 échantillons de lavage (une ligne complète horizontale) peut être réalisée simultanément à l&#39;aide d&#39;une pipette 12 canaux. </li><li> A partir de la dilution la plus faible, le transfert 10 ul de l&#39;échantillon sur Sabouraud-dextrose agar (SDA). Placage de jusqu&#39;à 36 échantillons peuvent être effectuées sur une plaque à l&#39;aide SDA préparé en boîtes de Pétri carrées avec une grille et d&#39;une pipette multicanaux écartement réglable. </li><li> Énumérer unités formant colonie (UFC) après incubation à 34 ° C fou 48 h. </li></ol> 4. L&#39;extraction des tissus vaginaux <ol><li> Suite à la procédure de lavage vaginal, poser la souris euthanasiées sur son dos et de saturer la région de l&#39;aine à l&#39;éthanol 70%. En utilisant une paire de pinces, soulever l&#39;orifice urinaire vers le haut afin que l&#39;ouverture vaginale est exposée. </li><li> Insérer une paire de pinces courbées dans la lumière vaginale et de localiser le col. Tout en conservant une prise ferme avec la pince, extrait de l&#39;utérus à travers la cavité vaginale (figure 2A-C). </li><li> D&#39;accise dans le vagin à la base de l&#39;ouverture du vagin, puis retirez le col du vagin avec des ciseaux chirurgicaux. Gardez à l&#39;esprit que le tissu vaginal est involué (intérieur de l&#39;épithélium du vagin côté est exposé vers l&#39;extérieur). Le tissu peut être soit latéralement inversée pour maintenir l&#39;orientation de l&#39;original du vagin ou ouvert dans une feuille en faisant une incision latérale. Excisées tissus vaginaux peuvent être utilisées pour 1) le collage des lymphocytes suite à l&#39;extractionla digestion nase (~ 1 × 10 4 / souris) 40, 2) l&#39;isolement des cellules épithéliales dispase après digestion (~ 5 × 10 4 / souris) 28, 3) les préparations congelées ou en paraffine pour des analyses histologiques 25. </li></ol> 5. Lombaire excision des ganglions lymphatiques <ol><li> Suite à la procédure de lavage vaginal, poser la souris euthanasiées sur le dos et saturer l&#39;abdomen avec 70% d&#39;éthanol. Faire une incision latérale à partir du bas-ventre à la poitrine et d&#39;exposer les organes internes. En utilisant une paire de pince à deux mains, de déplacer les intestins vers le haut afin que les vaisseaux sanguins deviennent visibles centrale. </li><li> Localisez la veine cave inférieure et l&#39;aorte abdominale. Normalement, une paire de ganglions lymphatiques lombaires peuvent être identifiés à côté de l&#39;aorte abdominale, située à environ mi-chemin entre l&#39;origine des artères iliaques communes rénale et 39. Ces ganglions lymphatiques peuvent être distinguées visuellement des tissus adipeux par la texture élastiqueet sont plus légers et plus opaques de couleur par rapport au tissu adipeux (figure 3). Ces ganglions lymphatiques sont sensiblement plus grandes chez les animaux infectés par rapport aux animaux non inoculés. </li><li> Accise les ganglions lymphatiques en plaçant microforceps sous le nœud, puis tirez doucement jusqu&#39;à se séparer de tissus environnants. </li></ol> 6. Isolement des cellules lymphoïdes dans une seule cellule suspensions <ol><li> Transfert des ganglions lymphatiques sur un grillage stérile (environ 3 x 3 cm 2 en taille) placé à l&#39;intérieur une boîte de Pétri stérile en verre contenant environ 10 ml de solution de Hanks saline équilibrée (HBSS) (figure 4). </li><li> Avec la boîte de Pétri légèrement incliné, appuyez sur les ganglions lymphatiques contre l&#39;écran avec une tête de piston de la seringue. Assurez-vous de briser tous les ganglions lymphatiques afin que le contenu cellulaire des ganglions passer par l&#39;écran alors que les composantes non cellulaires des nœuds (ie, les membranes, le stroma, la graisse) restent à l&#39;écran. </li><li> En utilisant le piston et la seringue même, aspirer tIl HBSS cellules contenant. Laver l&#39;écran avec ~ HBSS 5 ml et recueillir le liquide restant dans un tube de 15 ml conique. </li><li> Centrifuger à 800 xg pendant 10 min. Aspirer les dépôts gras dans le haut du liquide avec une pipette avant de jeter le liquide. Laver le culot cellulaire à trois reprises avec HBSS. Reprendre le culot dans 1 ml de HBSS et énumérer les cellules viables par l&#39;exclusion bleu trypan. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs: Les fractions cellulaires du liquide de lavage vaginal de&gt; 4-jours des souris inoculées sont généralement constitués de Candida, les cellules épithéliales et des infiltrats cellulaires (figure 5). Par humides montage microscopique, Candida peut être identifié visuellement par la présence d&#39;hyphes ainsi que la levure (figure 5A). Étaler la préparation du liquide de lavage vaginal peut être coloré par la technique de Papanicolaou pour examiner les cellules épithéliales et les leucocytes infiltrant, dont les principales cellules neutrophiles sont identifiés par le tri-nuclelobes ar (figure 5B). Très peu de neutrophiles, le cas échéant, sont détectés chez les souris inoculées (figure 5C) 41. Un exemple de charge fongique vaginale est montré dans la figure 6. Le liquide de lavage vaginal prélevés à des moments spécifiques sont cultivées pour l&#39;énumération UFC (figure 6A). Colonisation vaginale / infection à Candida persiste pendant des semaines dans des œstrogènes chez les souris traitées inoculé (figure 6B), tandis que le Candida ne parvient pas à établir la colonisation vaginale chez les non-oestrogène-traitée souris inoculées (figure 6C). L&#39;œstrogène chez les souris traitées non inoculés restent négatives pour le Candida dans le temps (données non présentées). En outre, les lavages vaginaux peuvent être effectuées soit une seule fois sur des souris séparées à chaque point du temps ou longitudinalement dans les mêmes souris sous anesthésie. Les ganglions lymphatiques lombaires sont les nœuds lymphatiques drainant primaires du tractus génital et le site le plus pertinent pour évaluer des réponses immunitaires à un défi vaginale. Note que ces ganglions peuvent devenir élargie chez les souris inoculées pendant qu&#39;ils apparaissent normalement assez faible chez les souris inoculées. Leucocytes recouvrements cellulaires varient généralement de 8 x 10 5 / souris inoculées à 5 × 10 6 souris / inoculé. En plus de ganglions lymphatiques lombaires, les ganglions lymphatiques inguinaux, poplité et mésentériques peuvent également être utilisés. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig1.jpg" /> Figure 1. Inoculation vaginale à Candida. A) Une souris retenue pour l&#39;inoculation. La souris est placée sur un insert cage métallique et détenus par la base de la queue, légèrement vers le haut pour soulever les jambes et d&#39;exposer l&#39;orifice vaginal. La hanche de la souris peut être stabilisée avec la même main, car il tente de résister à la contrainte de la queue. B) l&#39;introduction de l&#39;inoculum dans la lumière vaginale. Une extrémité de la pipette est doucement introduit à environ 5 mm de profondeur dans la lumière vaginale. L&#39;inoculum de suspension est ensuite déposée. Figure 2. Extraction de tissu vaginal. AB) Extraction de l&#39;utérus. Le col est situé à la pince incurvée et exposés à l&#39;extérieur par la cavité vaginale. Une fois sorti de la cavité vaginale, le col est encore tiré vers l&#39;extérieur pour exposer entièrement le vagin. C) Extraction du vagin. Le vagin est excisé de la vulve avec des ciseaux. Une fois détaché, retirez le col du vagin. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig3.jpg" /> Figure 3. Identification des ganglions lymphatiques lombaires. L&#39;emplacement des ganglions lymphatiques lombaires entre les organes environnants / vaisseaux sanguins dans les environs du bassin est indiquée. Une aorte, abdominaux. B, de la vessie. C, artère iliaque commune. I, intestins. L, le foie. R, rectum. S, de la rate. U, utérus. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig4.jpg" /> Figure 4. Les ganglions lymphatiques lombaires placé sur un grillage. Les ganglions lymphatiques sont regroupés sur l&#39;écran placé dans une boîte de Pétri avec HBSS. Les ganglions lymphatiques sont pressés contre la grille avec un piston de la seringue pour obtenir des cellules lymphoïdes dans une seule cellule suspensions. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig5.jpg" /> Figure 5. Fractions cellulaires du liquide de lavage vaginal de souris inoculées. Une préparation) Mouiller montage et B) frottis vaginaux des échantillons recueillis lavage 4 jours post-inoculation et C) chez des souris inoculées. Les images sont montré à 1000 × (A) ou 400 × (B, C) grossissement. L&#39;insert en B montre la morphologie nucléaire des neutrophiles vaginale à 1000 ×. Levure Candida (Y) et des hyphes (H), les cellules épithéliales (CE) et neutrohils (N) sont indiqués. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/3382/3382fig6.jpg" /> Figure 6. Détecterion de charge fongique vaginale. A) Les colonies de C. albicans représentant cultivé sur une plaque SDA. Neat échantillons de lavage (N) à partir de six différents souris inoculées (rangée du haut) ont été dilués en série et de culture pour le dénombrement des UFC. B) Quantification de la charge fongique vaginale d&#39;œstrogène-traitées et C) la non-oestrogènes chez les souris traitées. UFC/100 ul du liquide de lavage des souris inoculées ont été évalués sur des points de temps indiquée.

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+dendritic+cells+in+immunoregulation+during+experimental+vaginal+candidiasis.">A role for dendritic cells in immunoregulation during experimental vaginal candidiasis.</a> Infect. Immun. 74, 3213-3213 (2006).</li><li>McGrory, T., Garber, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+intravaginal+infection+with+Trichomonas+vaginalis+and+role+of+Lactobacillus+acidophilus+in+sustaining+infection.">Mouse intravaginal infection with Trichomonas vaginalis and role of Lactobacillus acidophilus in sustaining infection.</a> Infect. Immun. 60, 2375-2379 (1992).</li><li>Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+mucosal+Candida+infection.">Animal models of mucosal Candida infection.</a> FEMS. Microbiol. Lett. 283 (2), 129-129 (2008).</li><li>Nomanbhoy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaginal+and+oral+epithelial+cell+anti-Candida+activity.">Vaginal and oral epithelial cell anti-Candida activity.</a> Inf. Immun. 70, 7081-7081 (2002).</li><li>Pietrella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beta-glucan-conjugate+vaccine+and+anti-beta-glucan+antibodies+are+effective+against+murine+vaginal+candidiasis+as+assessed+by+a+novel+in+vivo+imaging+technique.">A beta-glucan-conjugate vaccine and anti-beta-glucan antibodies are effective against murine vaginal candidiasis as assessed by a novel in vivo imaging technique.</a> Vaccine. 28 (7), 1717-1717 (2010).</li><li>Redondo-Lopez, V., Cook, R. N., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+Lactobacilli+in+the+control+and+maintenance+of+the+vaginal+bacterial+microflora.">Emerging role of Lactobacilli in the control and maintenance of the vaginal bacterial microflora.</a> Rev Infect Dis. 12 (5), 856-856 (1990).</li><li>Saavedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+production+of+chemokines+during+experimental+vaginal+candidiasis.">Local production of chemokines during experimental vaginal candidiasis.</a> Inf. Immun. 67, 5820-5820 (1999).</li><li>Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+epidemiology+of+vulvovaginal+candidiasis.">Pathogenesis and epidemiology of vulvovaginal candidiasis.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 544, 547-547 (1988).</li><li>Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+and+treatment+of+recurrent+vulvovaginal+candidiasis.">Pathogenesis and treatment of recurrent vulvovaginal candidiasis.</a> Clin. Infect. Dis. 14, S148-S153 (1992).</li><li>Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vulvovaginal+candidiasis:+Epidemiologic,+diagnostic,+and+therapeutic+considerations.">Vulvovaginal candidiasis: Epidemiologic, diagnostic, and therapeutic considerations.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 178 (2), 203-203 (1998).</li><li>Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+humoral+immune+responses+against+primary+and+repeat+Neisseria+gonorrhoeae+genital+tract+infections+of+17&#946;-estradiol-treated+mice.">Local and humoral immune responses against primary and repeat Neisseria gonorrhoeae genital tract infections of 17&#946;-estradiol-treated mice.</a> Vaccine. 26, 5741-5741 (2008).</li><li>Taylor, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+virulence+of+Candida+albicans+isolates+causing+mucosal+infections+in+people+infected+with+the+human+immunodeficiency+virus.">In vivo virulence of Candida albicans isolates causing mucosal infections in people infected with the human immunodeficiency virus.</a> J. Infect. Dis. 182, 955-955 (2000).</li><li>Taylor, B. N., Saavedra, M., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Th1/Th2+cytokine+production+during+experimental+vaginal+candidiasis.">Local Th1/Th2 cytokine production during experimental vaginal candidiasis.</a> Med. Mycol. 38, 419-419 (2000).</li><li>Tirabassi, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mucosal+vaccination+approach+for+herpes+simplex+virus+type+2.">A mucosal vaccination approach for herpes simplex virus type 2.</a> Vaccine. 29 (5), 1090-1090 (2011).</li><li>Broeck, W. V. a. n. d. e. n., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+descriptive+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: descriptive and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J. Immunol. Methods. 312 (1-2), 12-12 (2006).</li><li>Wormley, F. L., Chaiban, J., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecule+and+lymphocyte+activation+marker+expression+during+experimental+vaginal+candidiasis.">Cell adhesion molecule and lymphocyte activation marker expression during experimental vaginal candidiasis.</a> J. Immunol. Methods. 69, 5072-5072 (2001).</li><li>Yano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell-derived+S100+calcium-binding+proteins+as+key+mediators+in+the+hallmark+acute+neutrophil+response+during+Candida+vaginitis.">Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis.</a> Infect. Immun. 78 (12), 5126-5126 (2010).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Un modèle expérimental chez la souris de Candida vaginite a été établi et historiquement utilisé pour les dernières décennies pour étudier la réponse d&#39;hôte des muqueuses à Candida ainsi que pour les tests traitements antifongiques 3,4,11,13,16,17,19,21,24, 25,37. Les protocoles présentés ici intègrent des méthodes efficaces et moins de main-d&#39;œuvre, et semblent être l&#39;un des systèmes modèle le plus optimisé de Candida vaginite décrites à ce jour. ...

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Femme souris CBA / J </td><td> Charles River Laboratories </td><td> 01C38 </td><td> 5-6 semaines d&#39;âge </td></tr><tr><td> Candida albicans (3153A) </td><td> Collection nationale des champignons pathogènes, au Royaume-Uni </td><td> NCPF3153 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;huile de sésame </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3547 </td><td> N&#39;a pas besoin d&#39;être pré-stérilisés avant leur utilisation </td></tr><tr><td> Β-estradiol 17-valérate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E1631 </td><td> 0.1-0.5mg dans l&#39;huile de sésame </td></tr><tr><td> Phytone peptonée </td><td> Becton Dickinson </td><td> 211906 </td><td> Supplément avec 0,1% de glucose </td></tr><tr><td> Solution de bleu trypan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td></td></tr><tr><td> Sabouraud Dextrose Agar </td><td> Becton DickInson </td><td> 211584 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase de type IV </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5138 </td><td> 0,25% </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Invitrogen </td><td> 17105-041 </td><td> 1,7 U / ml </td></tr><tr><td> L&#39;installation de grillages </td><td> TWP </td><td> 060X060S0065W36T </td><td> N ° 60 mesh, inox </td></tr><tr><td> Hanks solution saline équilibrée </td><td> Invitrogen </td><td> 24020-117 </td><td></td></tr><tr><td> CYTOPREP fixateur </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-570-10 </td><td> Préserve lames de frottis </td></tr><tr><td> Papanicolaou EA-65 </td><td> EMD Chemicals </td><td> 7054X-85 </td><td></td></tr><tr><td> Papanicolaou OG-6 </td><td> EMD Chemicals </td><td> 7052X-85 </td><td></td></tr><tr><td> Alun hématoxyline de Harris </td><td> EMD Chemicals </td><td> 638A-85 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;isoflurane </td><td> Baxter Healthcare </td><td> NDC 10019-773-60 </td><td> Utilisé avec vaporisateur isoflurane ou dans un système de goutte fermée anesthésie chambre </td></tr></table>

protocols for vaginal inoculation and sample collection in the experimental mouse model of candida vaginitis

Vulvo-vaginale candidose (VVC), causée par les espèces de Candida, est une infection fongique des voies génitales inférieures femelles qui affecte environ 75% des femmes en bonne santé pendant leurs années reproductives 18,32-34. Les facteurs prédisposants comprennent l&#39;utilisation des antibiotiques, le diabète non contrôlé et la perturbation des niveaux d&#39;hormones de reproduction en raison de la grossesse, contraceptifs oraux ou traitements hormonaux substitutifs 33,34. VVC récurrente (RVVC), définie comme trois épisodes ou plus par an, affecte un 5 séparée à 8% des femmes sans facteurs prédisposants 33. Un modèle expérimental chez la souris de VVC a été établi et utilisé pour étudier la pathogenèse et la réponse de l&#39;hôte des muqueuses à Candida 3,4,11,16,17,19,21,25,37. Ce modèle a également été employée pour tester le potentiel de traitements antifongiques in vivo 13,24. Le modèle exige que les animaux soient maintenus dans un état de pseudoestrus pour optiMAL Candida colonisation / infection 6,14,23. Dans ces conditions, les animaux inoculés aura détectable vaginale charge fongique pendant des semaines ou des mois. Des études antérieures montrent un parallèle extrêmement élevée entre le modèle animal et l&#39;infection humaine par rapport à des propriétés immunologiques et physiologiques 3,16,21. Les différences, cependant, incluent un manque de Candida flore vaginale normale et un pH neutre vaginale chez la souris. Ici, nous démontrons une série de méthodes clés dans le modèle de la souris vaginite qui incluent l&#39;inoculation vaginale, la collecte rapide des échantillons vaginaux, évaluation de la charge fongique vaginale, et des préparations de tissus cellulaires pour l&#39;extraction / isolement. Il est suivi par des résultats représentatifs pour constituants de liquide de lavage vaginal, charge fongique, et le drainage des ganglions lymphatiques rendements des leucocytes. Avec l&#39;utilisation d&#39;anesthésiques, des échantillons de lavage peuvent être collectées à plusieurs moments sur les mêmes souris pour l&#39;évaluation longitudinale deinfection / colonisation. Par ailleurs, ce modèle ne nécessite pas des agents immunosuppresseurs pour déclencher l&#39;infection, permettant des études immunologiques dans des conditions d&#39;accueil définie. Enfin, le modèle et chaque technique présenté ici pourrait donner lieu à l&#39;utilisation des méthodologies d&#39;examiner d&#39;autres maladies infectieuses du tractus génital inférieur féminine (bactériennes, parasitaires, virales) et défenses de l&#39;hôte respectifs locales ou systémiques.

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Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Techniques clés à utiliser dans l&#39;évaluation des<em&gt; Candida</emVaginite&gt; dans un modèle animal expérimental sont décrits. Les méthodes permettant la collecte rapide des échantillons vaginaux et des lymphocytes de ganglions lymphatiques lombaires. Ces techniques pourraient donner lieu à des souris modèles de d&#39;autres maladies dans le tractus génital féminin inférieur.

Protocoles pour l&#39;inoculation vaginale et prélèvement d&#39;échantillons dans le modèle expérimental chez la souris des Candida Vaginite

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

protocols-for-vaginal-inoculation-sample-collection-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

32.7K vues.  Louisiana State University Health Sciences Center. Techniques clés à utiliser dans l'évaluation des Candida dans un modèle animal expérimental sont décrits. Les méthodes permettant la collecte rapide des échantillons vaginaux et des lymphocytes de ganglions lymphatiques lombaires. Ces techniques pourraient donner lieu à des souris modèles de d'autres maladies dans le tractus génital féminin inférieur.

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Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Métastases expérimentales et CTL Modèle adoptifs souris Transfert immunothérapie

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

Recherche

Immunologie et infection

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

Préparation de la souris Immunogène hypophysaires pour l&#39;induction de hypophysite auto-immune expérimentale

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modèle murin du Groupe B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vaginal Colonisation

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Visualisation des effets des expectorations sur le développement du biofilm Utilisation d&#39;un modèle Chambered lamelle couvre-objet

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of their morbidity. The liver immunopathology caused by HIV-1 remains elusive. Small xenograft animal models with human hepatocytes and human immune system can recapitulate the human biology of the disease&#39;s pathogenesis. Herein, a protocol is described to establish a dual humanized mouse model through human hepatocytes and CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) transplantation, to study liver immunopathology as observed in HIV-infected patients. To achieve dual reconstitution, male TK-NOG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) mice are intraperitoneally injected with ganciclovir (GCV) doses to eliminate mouse transgenic liver cells, and with treosulfan for nonmyeloablative conditioning, both of which facilitate human hepatocyte (HEP) engraftment and human immune system (HIS) development. Human albumin (ALB) levels are evaluated for liver engraftment, and the presence of human immune cells in blood detected by flow cytometry confirms the establishment of human immune system. The model developed using the protocol described here resembles multiple components of liver damage from HIV-1 infection. Its establishment could prove to be essential for studies of hepatitis virus co-infection and for the evaluation of antiviral and antiretroviral drugs.

This protocol provides a reliable method to establish humanized mice with both human immune system and liver cells. Dual reconstituted immunodeficient mice achieved via intrasplenic injection of human hepatocytes and CD34+ hematopoietic stem cells are susceptible to human immunodeficiency virus-1 infection and recapitulate liver damage as observed in HIV-infected patients.

Création du modèle de souris TK-NOG humanisé double pour la pathogénie du foie associée au VIH

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight loss, depreciation of the animals&#39; leather and also can act as a vector of several pathogens. Due to the exorbitant costs to control these parasites, damage to the environment caused by the inappropriate use of chemical acaricides, and the increased resistance against traditional parasiticides, alternative control of ticks, by the use of entomopathogenic fungi, for example, has been considered an interesting approach. Nevertheless, few studies have demonstrated how the tick&#39;s immune system acts to fight these entomopathogens. Therefore, this protocol demonstrates two methods used for entomopathogen inoculation into engorged females and two techniques used for hemolymph collection and hemocytes harvesting. Inoculation of pathogens at the leg insertion in the tick female&#39;s body allows evaluation of females biologic parameters unlike the inoculation between the scutum and capitulum, which frequently damages Gen&#233;&#39;s organ. Dorsal hemolymph collection yielded a higher volume recovery than collection through the legs. Some limitations of tick hemolymph collection and processing include i) high rates of hemocytes&#39; disruption, ii) hemolymph contamination with disrupted midgut, and iii) low hemolymph volume recovery. When hemolymph is collected through the leg cutting, the hemolymph takes time to accumulate at the leg opening, favoring the clotting process. In addition, fewer hemocytes are obtained in the collection through the leg compared to the dorsal collection, even though the first method is considered easier to be performed. Understanding the immune response in ticks mediated by entomopathogenic agents helps to unveil their pathogenesis and develop new targets for tick control. The inoculation processes described here require very low technological resources and can be used not only to expose ticks to pathogenic microorganisms. Similarly, the collection of tick hemolymph may represent the first step for many physiological studies.

Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies

Analysis of tick hemolymph represents an important source of information on how some pathogens cause disease and how ticks immunologically respond to this infection. The present study demonstrates how to inoculate fungal propagules and collect hemolymph from Rhipicephalus microplus engorged females.

Divulgation de la collection d’hémolymphe et inoculation des blastospores de Métarhizium dans les tiques de Rhipicephalus MICROPLUS vers les études de pathologie des invertébrés

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites and Rhipicephalus microplus has great importance in veterinary medicine because it causes anemia, weight ...

Mouse Footpad Inoculation Model to Study Viral-Induced Neuroinflammatory Responses

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus infection in mice. As alphaherpesviruses are main invaders of the peripheral nervous system (PNS), this model is suitable to characterize the kinetics of viral replication, its spread from the PNS to CNS, and associated neuroinflammatory responses. The footpad inoculation model allows virus particles to spread from a primary infection site in the footpad epidermis to sensory and sympathetic nerve fibers that innervate the epidermis, sweat glands, and dermis. The infection spreads via the sciatic nerve to the dorsal root ganglia (DRG) and ultimately through the spinal cord to the brain. Here, a mouse footpad is inoculated with pseudorabies virus (PRV), an alphaherpesvirus closely related to herpes simplex virus (HSV) and varicella-zoster virus (VZV). This model demonstrates that PRV infection induces severe inflammation, characterized by neutrophil infiltration in the footpad and DRG. High concentrations of inflammatory cytokines are subsequently detected in homogenized tissues by ELISA. In addition, a strong correlation is observed between PRV gene and protein expression (via qPCR and IF staining) in DRG and the production of pro-inflammatory cytokines. Therefore, the footpad inoculation model provides a better understanding of the processes underlying alphaherpesvirus-induced neuropathies and may lead to the development of innovative therapeutic strategies. In addition, the model can guide research on peripheral neuropathies, such as multiple sclerosis and associated viral-induced damage to the PNS. Ultimately, it can serve as a cost-effective in vivo tool for drug development.

The footpad inoculation model is a valuable tool for characterizing viral-induced neuroinflammatory responses in vivo. In particular, it provides a clear assessment of viral kinetics and associated immunopathological processes initiated in the peripheral nervous system.

Modèle d’inoculation de tapis de souris pour étudier les réponses neuroinflammatoires virales induites

This protocol describes a footpad inoculation model used to study the initiation and development of neuroinflammatory responses during alphaherpesvirus ...

Experimental Autoimmune Uveitis: An Intraocular Inflammatory Mouse Model

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular inflammatory disease model recapitulate the clinical phenotype of posterior uveitis affecting humans. EAU has been used reliably to study the efficacy of novel inflammatory therapeutics, their mode of action and to further investigate the mechanisms that underpin disease progression of intraocular disorders. Here, we provide a detailed protocol on EAU induction in the C57BL/6J mouse - the most widely used model organism with susceptibility to this disease. Clinical assessment of disease severity and progression will be demonstrated using fundoscopy, histological examination and fluorescein angiography. The induction procedure involves subcutaneous&#160;injection of an emulsion containing a peptide (IRBP1-20) from the ocular protein interphotoreceptor retinoid binding protein (also known as retinol binding protein 3), Complete Freund&#39;s Adjuvant (CFA) and supplemented with killed Mycobacterium tuberculosis. Injection of this viscous emulsion on the back of the neck is followed by a single intraperitoneal injection of Bordetella pertussis toxin. At the onset of symptoms (day 12-14) and under general anesthesia, fundoscopic images are taken to assess disease progression through clinical examination. These data can be directly compared with those at later timepoints and peak disease (day 20-22) with differences analyzed. At the same time, this protocol allows the investigator to assess potential differences in vessel permeability and damage using fluorescein angiography. EAU can be induced in other mouse strains - both wildtype or genetically modified - and combined with novel therapies offering flexibility for studying drug efficacy and/or disease mechanisms.

In this report we present a protocol that allows the investigator to generate a mouse model of intraocular uveitis. More commonly referred to as experimental autoimmune uveitis (EAU), this established model captures many aspects of human disease. Herein, we will describe how to induce and monitor disease progression using several readouts.

Uvéite auto-immune expérimentale : un modèle murin inflammatoire intraoculaire

Experimental Autoimmune Uveitis (EAU) is driven by immune cells responding to self-antigens. Many features of this non-infectious, intraocular ...

A Mouse Model of Chronic Liver Fibrosis for the Study of Biliary Atresia

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to the complex etiology and unknown pathogenesis, there are still no effective drug treatments. At present, the classic BA mouse model induced by rhesus rotavirus (RRV) is the most commonly used model for studying the pathogenesis of BA. This model is characterized by growth retardation, jaundice of the skin and mucosa, clay stools, and dark yellow urine. The histopathology shows severe liver inflammation and obstruction of the intrahepatic and extrahepatic bile ducts, which are similar to the symptoms of human BA. However, the livers of end-stage mice in this model lack fibrosis and cannot fully simulate the characteristics of liver fibrosis in clinical BA. The presented study developed a novel BA mouse model of chronic liver fibrosis by injecting 5-10 &#181;g of anti-Ly6G antibody four times, with gaps of 2 days after each injection. The results showed that some of the mice successfully formed chronic BA with typical fibrosis after the time lapse, meaning these mice represent a suitable animal model for the virus-induced liver fibrosis mechanistic study of BA and a platform for developing future BA treatments.

We established a mouse model of chronic liver fibrosis, which provides a suitable animal model for the virus-induced liver fibrosis mechanistic study of biliary atresia (BA) and a platform for future BA treatments.

Un modèle murin de fibrose hépatique chronique pour l’étude de l’atrésie biliaire

Biliary atresia (BA) is a fatal disease involving obstructive jaundice, and it is the most common indication for liver transplantation in children. Due to ...

Procedure for Swine Burn Wounding, Burn Wound Imaging, Wound Inoculation, and Biopsy Collection

To begin the procedure inside the properly arranged surgery room, place the anesthetized pig in the sternal recumbency position, and ensure all the connected lines and tubes are secured. Remove any residual hairs from the shaved area designated for wounding using hair removal cream. After sterilizing the wound sites, mark the area using a sterile burn template and a surgical skin marker.Set the burner by adjusting the set point on the control unit to 150 degrees celsius. The low set point to 145 degrees Celsius and the high set point to 155 degrees Celsius. Using a heated stainless steel blocks connected to the burn device, create a full thickness burn wound by placing the blocks on the skin for 60 seconds.Take a digital photo of the whole back of the pig, including a placard with the pig's identification time point and date. Then separately take images for each wound along with a ruler and a placard displaying the pig ID, wound ID and time point. To assess the wound microvascular perfusion in real time using laser speckle imaging or LSI, image all the wounds in a single recording using a LASCA blood perfusion imager.To measure trans epidermal water loss or TEWL, place a clean probe cover over the TEWL probe tip, which will be in contact with the wound tissue. Measure each wound five times, first in the center, followed by each corner. Then export all the readings to a spreadsheet.Perform a harmonic ultrasound or HUSD mapping by scanning the wound with an ultrasound probe from the midline or vertebral column, starting from normal skin and moving towards the lateral side of the pig over the wounds until the normal skin is again reached. Follow the scanning pattern for each wound in both B mode and tissue elastography mode. Change the annotation after each wound is imaged in both B mode and elasto mode, which is two recordings per wound.Once all the imaging is complete, cover the burn wounds individually with transparent film dressings or the test dressing. Then place a larger transparent film dressing over the entire wound area. Apply a second layer of roll gauze loosely around the entire trunk of the pig to absorb any fluid exuding from the wounds.Cover the gauze loosely with a layer of flexible elastic bandage. Cover the elastic bandage with a final layer of four inch elastic tape. After discontinuing the anesthetic gas upon completion of the bandaging, allow the pig to remain on oxygen for at least five minutes.To inoculate the burn wounds on day three post burn, disperse the inoculum across the surface of the exposed wounds using a pipette, and spread it evenly using a disposable spreader. To collect the tissue biopsies for analysis following imaging, infiltrate the area around the wound with 0.5%bupivacaine. Using a disposable scalpel with a size 10 blade, cut a 3-4 millimeter wide strip from one edge of the wound to the other, keeping small margins of normal skin on both sides.Cut a 6 millimeter punch biopsy from the wound either from the wound bed or wound edge. Achieve hemostasis after the samples are collected by gently pressing the wound with a sterile gauze. Cover the wound with a non-adherent dressing and bandage it as demonstrated previously.Analysis of the biopsy sample by hematoxylin and Eosin staining showed distortion and necrosis of all the histological skin layers. The established biofilm was further validated at day seven post inoculation by colony forming unit. Scan the electron microscopy imaging, and immunofluorescence staining.The burn wounds showed a thick biogenic membrane on the wound surface by day seven post inoculation, confirming the infection and establishment of biofilm. The wound area started to shrink by day 14, but incomplete healing to about 25%of the original wound size was observed by day 56 indicating wound chronicity. Wound chronicity and impaired wound healing were further confirmed by the TEWL showing high trans epidermal water loss at all measured time points.This was also confirmed by the suppression of the tight junctional proteins, ZO-1 and 2, and the impaired restoration of skin barrier function.