Ce travail a été soutenu par les Instituts Nationaux de Santé (NIH) DA030396 subvention. Merci aux membres du laboratoire Drenan de discussion utile et critique du manuscrit. Un merci spécial à Mi Ran Kim pour l&#39;assistance technique et Jonathan Thomas Ting pour obtenir des conseils en ce qui concerne les tranches de cerveau de souris adultes.

1. Préparation des solutions pour la préparation de tranches de cerveau et d&#39;électrophysiologie <ol><li> Solutions pour la préparation de coupes de cerveau ont été décrites précédemment 3, 4. Préparer la N-méthyl D-glucamine (NMDG)-en fonction de coupe et de récupération de la composition suivante (en mM): 93 N-méthyl D-glucamine, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, HEPES 20, 25 glucose, 5 Na + ascorbate, 2 thiourée, 3 Na + pyruvate, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0,5 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajuster à 300-310 mOsm avec NMDG. Ajuster le pH à 7.3 à 7.4 avec HCl 10 N. <ol class="lalpha"><li> Dissoudre MgSO 4 • 7H 2 O et CaCl 2 • 2H 2 O dans de l&#39;eau millipore pour faire 2 solutions mères de chaque M. </li><li> Peser d&#39;autres composants dans l&#39;ordre indiqué et ajouter une fiole jaugée partiellement rempli d&#39;eau Millipore en remuant pour dissoudre. Une fois que tout est ajouté, remplissezfiole jaugée avec de l&#39;eau Millipore. </li><li> Mesurer le pH et l&#39;ajuster avec 10 HCl. </li><li> Mesurer l&#39;osmolarité et ajuster avec NMDG si nécessaire. </li></ol></li><li> Préparer HEPES maintien du liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) ayant la composition suivante (en mM): NaCl 92, KCl 2,5, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20, 25 HEPES, 5 glucose Na + ascorbate, 2, 3 Na thiourée pyruvate +, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajuster à 300-310 mOsm avec du saccharose. Ajuster le pH à 7.3 à 7.4 avec HCl 1 N ou NaOH. <ol class="lalpha"><li> Peser les composants dans l&#39;ordre indiqué et ajouter une fiole jaugée partiellement rempli d&#39;eau Millipore en remuant pour dissoudre. Une fois que tout est ajoutée, remplir fiole jaugée avec de l&#39;eau Millipore. </li><li> Mesurer le pH et ajuster avec NaOH ou HCl, si nécessaire. </li><li> Mesurer et ajuster l&#39;osmolarité de saccharose, si nécessaire. </li></ol></li><li> Préparer la solution étalon de aCSF enregistrement de la composition suivante (en mM): 124 NaCl, KCl 2,5, 1,2 NaH 2 PO 4, 24 NaHCO 3, 12,5 glucose, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajuster à 300-310 mOsm avec du saccharose. Ajuster le pH à 7.3 à 7.4 avec HCl 1 N ou NaOH. </li></ol> 2. Préparation des tranches de cerveau aiguë <ol><li> Coupe de tranches de cerveau et de récupération sont effectuées comme décrit précédemment 3, 4. Plats bulle de cristal rempli de deux NMDG solution de récupération de l&#39;oxygène à 95% / 5% de CO 2 de gaz (carbogène), un plat sur ​​la glace, l&#39;autre à 33 ° C. </li><li> Une bulle de cristal plat rempli d&#39;HEPES maintien aCSF avec carbogène à température ambiante. </li><li> Anesthésier la souris adulte (âgée de 2 à 12 mois) avec du pentobarbital Na + (200 mg / kg, ip). Passez à la procédure lorsque l&#39;animal n&#39;a pas de réponse à un orteil-pincement. </li><li> Si nécessaire, couper la queue d&#39;un échantillon de tissu pour plus tard génotypagetion de l&#39;animal. </li><li> Ouvrez la cage thoracique, exposer le cœur, et serrer l&#39;aorte descendante. Lacérer l&#39;oreillette droite. </li><li> Transcardiaque perfuser animal avec 5-10 ml de 0-4 ° C NMDG-récupération de la solution. </li><li> Décapiter, détacher le cerveau et le placer dans 4 ° C NMDG-récupération de la solution pendant 1 min. </li><li> Sur une plaque de métal refroidi à la glace, couper le cerveau dans l&#39;orientation désirée (coronale, parasagittale, horizontal, etc) pour y inclure la zone d&#39;intérêt. </li><li> Fixez le bloc de cerveau avec de la colle à la surface de la platine à sec d&#39;une trancheuse vibrant (DSK-Zero 1; Dosaka), immerger le bloc du cerveau chez 4 ° C NMDG-récupération de la solution, et en continu la solution à bulles avec carbogène. </li><li> Couper les tranches de la zone du cerveau d&#39;intérêt. L&#39;épaisseur des tranches est de 200-400 um, en fonction de la zone du cerveau spécifique d&#39;intérêt, âge de l&#39;animal, et expérience à réaliser. </li><li> Immédiatement après la coupe, incuber les tranches souhaitées dans carbogenated, 33 ° C NMDG recouvrement des solutipendant exactement 12 min, puis transfert à carbogenated, HEPES température ambiante détenant solution pour une période initiale de 60 min. Après cette incubation 60 min, les tranches peuvent être utilisées pour l&#39;enregistrement. Tranches sont maintenus en solution HEPES maintien tout au long de la journée jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient utilisés pour l&#39;enregistrement. </li></ol> 3. Enregistrement de patch-clamp de neurones dans des tranches de cerveau <ol><li> Tirez une micropipette de raccordement standard avec un programmable Flaming-Brown extracteur (Sutter P-97 ou équivalent extracteur vertical). Pipettes qui sont optimales pour la formation de joint giga-ohms ont généralement une résistance de 4-6 MQ </li><li> Transfert d&#39;une tranche de la chambre d&#39;enregistrement (RC-27L, Instruments Warner) sur la platine d&#39;un microscope droit (Nikon PN-1). Continue superfuse (1,5 - 2,0 ml / min), la tranche avec carbogenated, enregistrement standard aCSF chauffée et maintenue à 32 ° C. En variante, des tranches peut être maintenu à la température ambiante. </li><li> Localisez et centre de la zone du cerveau d&#39;intérêt en utilisantun objectif 10X air (Nikon Plan Fluor 10X; NA 0,3; WD: 16 mm). </li><li> Visualisez les neurones individuels en utilisant un 40X proche infrarouge (IR) Objectif immersion dans l&#39;eau (APO Nikon 40XW; NA: 0,80; Roues motrices: 3,5 mm) relié à contraste d&#39;interférence différentiel IR (DIC) et un système optique à haute vitesse proche infrarouge dispositif couplé chargé caméra vidéo (CCD) (Hamamatsu C-7500). Sous IR-DIC observation, les neurones sains présentent une surface lisse, la membrane plasmique gris clair. </li><li> Remplir une micropipette avec une solution d&#39;enregistrement intracellulaire approprié. Pour la plupart des applications, nous utilisons la solution suivante (en mM): 135 gluconate de potassium, 5 EGTA, 0,5 CaCl2, MgCl2 2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, GTP et 0,1 (pH ajusté à 7,25 avec du Tris base, l&#39;osmolarité ajustée à 290 mOsm avec du saccharose). Établir un enregistrement de cellule entière d&#39;un neurone visualisées. </li></ol> 4. Application locale de médicaments à neurones de tranches <ol><li> Tirez une micropipette de raccordement standard de serrage comme décrit ci-dessus. Utilisationun extracteur pipette comme une Sutter P-97 qui produit deux «sœurs» identiques conseils de la même pièce de verre est avantageuse lorsque plusieurs solutions médicamenteuses doivent être utilisés sur la même cellule. Tailles de buses qui ont une résistance d&#39;environ 5 MW s&#39;ils ont été remplis avec la solution intracellulaire décrit ci-dessus sont optimales. </li><li> Remblai de la micropipette avec une solution de médicament dilué dans carbogenated, aCSF enregistrement standard. Pointer le bout vers le bas et secouez la micropipette remplie de médicaments pour éliminer les bulles d&#39;air piégées dans la colonne de solution. </li><li> Monter la micropipette remplie de médicament dans un support de pipette reliée à un tube de système d&#39;éjection de pression approprié, tel qu&#39;un Picospritzer III (General Valve Co.). Le porte-pipette doit être monté sur un micromanipulateur avec la même résolution que les manipulateurs couramment utilisé pour l&#39;enregistrement de patch-clamp (par exemple, Sutter MP-285). En outre, le manipulateur doit permettre un mouvement dans et hors diagonale de la tranche. Hommegressivement éjecter pression 3 à 4 fois dans la micropipette afin de faire monter la pression suffisant derrière la colonne de fluide. </li><li> Utilisation des commandes micromanipulateur, abaisser la pipette médicament dans la tranche tout en visualisant la pointe sous IR-DIC optique. Idéalement, on devrait identifier visuellement et au centre d&#39;un neurone à être enregistrés à partir, suivi par le positionnement de la pipette de drogue près de la cellule avant d&#39;abaisser la micropipette enregistrement dans la tranche. Le positionnement de la pipette de médicaments peuvent provoquer un déplacement du tissu dans le voisinage de la cellule enregistrée qui pourrait perturber l&#39;enregistrement si le médicament pipette est déplacée en position après l&#39;établissement d&#39;un joint d&#39;étanchéité gigaohm. </li><li> Utilisation de la vidéo IR, positionner la micropipette médicament à la surface supérieure de la tranche de tissu. Exécutez une pression d&#39;éjection et le moniteur 1) au voisinage de la pointe pour le mouvement des débris liés à l&#39;éjection, et 2) la pointe de la micropipette pour tous les signes que la buse est bouché ou bloqué. Si la pointe est bloqué / bouché, rétracter le pipette et le remplacer par un nouveau. </li><li> Approcher la cellule enregistrée en diagonale à partir de la partie supérieure de la tranche de telle sorte que lorsqu&#39;il est en position finale, l&#39;extrémité de la pipette est remplie de médicament 1) dans le même plan focal (ou légèrement inférieur) que la cellule enregistrée et l&#39;extrémité de l&#39;électrode d&#39;enregistrement , et 2) 10 à 40 um de la cellule enregistrée. Si la pointe de pipette remplie de médicament est enregistrée au-dessus de la cellule, la force de la pression d&#39;éjection pourrait perturber le joint gigaohm. </li><li> Enregistrer la réponse cellulaire désiré tout en maintenant la cellule en mode voltage imposé ou en mode pince de courant. Nous avons l&#39;habitude d&#39;enregistrer l&#39;acétylcholine et / ou à la nicotine a suscité des courants cellulaires tout en maintenant les neurones en mode voltage imposé. Bien que la pression d&#39;éjection peut être déclenchée manuellement lorsque vous utilisez un Picospritzer III, pour des résultats plus reproductibles, il est recommandé de déclencher l&#39;éjection sous pression à l&#39;aide du système d&#39;acquisition (Axon Digidata 1440 et pClamp 10,3) avec une impulsion TTL numérique. </li></ol> 5. ContrôleMicropipette la Drug-remplie avec un traducteur piézoélectrique <ol><li> Si possible, monter le support de pipette remplie de médicament à un traducteur piézo-électrique à une seule dimension (par exemple Piezojena PA-100 ou Burleigh PZM-150) qui est capable d&#39;accepter une entrée de tension analogique (encore une fois, à partir du système d&#39;acquisition), qui est ensuite monté sur le micromanipulateur de haute précision (Sutter MP-285). Un traducteur piézo-électrique est utile parce que le mouvement de la pipette remplie de drogue dans et hors de la tranche, y compris le calendrier et la vitesse d&#39;entrée / sortie, peuvent être plus facilement contrôlées et reproduites par une expérience à l&#39;. Lorsque l&#39;on étudie les nAChR, les effets de fuite de désensibilisation nicotine de la pipette remplie de médicament, ils doivent toujours se produire, sont réduits au minimum lorsque la pipette est déplacée uniquement à proximité de la cellule avec un traducteur piézo-électrique pour le moment de l&#39;éjection de pression. </li><li> L&#39;aide du potentiomètre à commande manuelle sur l&#39;amplificateur de commande de tension piézo-électrique, composez la tensionà sa valeur maximale. </li><li> À l&#39;aide du micromanipulateur, la position de la pipette remplie de médicament dans la tranche où la pipette est éjectée de son contenu sur la cellule enregistrée, et rétracter par la pipette manuelle réduire la tension de zéro sur l&#39;amplificateur de commande de tension piézo-électrique. </li><li> En utilisant un signal de sortie analogique à partir du système d&#39;acquisition d&#39;enregistrement, déplacer la pipette remplie de médicament dans la tranche sur une période de 250 ms 300 ms à partir de la pression d&#39;éjection avant TTL impulsion se produit. Rétracter la pipette sur une période de 250 ms, à partir 50 ms après l&#39;impulsion TTL extrémités. </li></ol>

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La méthode présentée dans cet article est généralement utile pour étudier ligand-gated fonction des canaux ioniques dans les préparations de tranches de cerveau. Cependant, il ya un certain nombre de facteurs qui vont affecter de manière significative la qualité et la reproductibilité des données expérimentales qui résultent de l&#39;utilisation de cette méthode. Par exemple, les courants évoqués sont très sensibles au diamètre de la pointe de la pipette remplie de médicament. Petits conseils provoque...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nom du réactif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Société</strong</td&gt;<td<strongNuméro de catalogue&gt;</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; N-méthyl D-glucamine</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; M2004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KCl</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3911</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaH<sub&gt; 2</sub&gt; PO<sub&gt; 4</sub</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S9638</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaHCO<sub&gt; 3</sub</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S6014</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; H3375</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucose</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G5767</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Ascorbate</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A4034</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thiourée</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; T8656</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Pyruvate</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2256</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MgSO<sub&gt; 4</sub&gt; • 7H<sub&gt; 2</sub&gt; O</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 230391</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CaCl<sub&gt; 2</sub&gt; • 2H<sub&gt; 2</sub&gt; 0</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 223506</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaCl</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S9625</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Pentobarbital</td&gt;<td&gt; Produits pharmaceutiques Vortech</td&gt;<td&gt; 76351315</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gluconate de potassium</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G4500</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mg-ATP</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A9187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GTP</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G8877</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DSK-Zero 1 vibrant trancheur</td&gt;<td&gt; Ted Pella, Inc</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-97 Flaming / Brown micropipette extracteur</td&gt;<td&gt; Sutter</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Chambre RC-27 Enregistrement</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TC-344B régulateur de chauffage perfusion</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td&gt; 640101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdChauffe-eau Solution&gt; SH-27B</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td&gt; 640102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nikon PN-1</td&gt;<td&gt; Nikon</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; C-7500 Caméra vidéo CCD</td&gt;<td&gt; Hamamatsu</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picospritzer III</td&gt;<td&gt; Général Valve Co.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MP-285 Micromanipulateur</td&gt;<td&gt; Sutter</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PA-100 Traducteur piézoélectrique</td&gt;<td&gt; Piezosystem jena, Inc</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12V40 piézo amplificateur</td&gt;<td&gt; Piezosystem jena, Inc</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axopatch 200B</td&gt;<td&gt; Molecular Devices Corp</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Digidata 1440A</td&gt;<td&gt; Molecular Devices Corp</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices

L&#39;usage du tabac entraîne de nombreux problèmes de santé, dont le cancer, les maladies cardiaques, l&#39;emphysème, et d&#39;AVC. La dépendance à la cigarette est un trouble neuropsychiatrique répandue qui découle des actions biophysiques et cellulaires de la nicotine sur les récepteurs nicotiniques de l&#39;acétylcholine (nAChR) dans le système nerveux central. Comprendre les sous-types de nAChR différentes qui existent dans les zones cérébrales concernées dépendance à la nicotine est une priorité majeure. Les expériences qui recourent à des techniques d&#39;électrophysiologie comme patch clamp de cellules entières ou de deux électrodes de potentiel imposé enregistrements sont utiles pour la caractérisation pharmacologique de nAChR d&#39;intérêt. NAChR cellules exprimant mammifères, tels que les cellules de culture tissulaire ou ovocytes de Xenopus laevis, sont physiquement isolés et sont donc faciles à étudier en utilisant les outils de la pharmacologie moderne. Beaucoup de progrès ont été réalisés en utilisant ces techniques, en particulier lorsque le récepteur cible était déjà connu unee ectopique expression a été facilement atteint. Souvent, cependant, il est nécessaire d&#39;étudier nAChR dans leur environnement naturel: dans les neurones dans des tranches de cerveau aiguë récoltés à partir des souris de laboratoire ou des rats. Par exemple, des souris exprimant &quot;hypersensible&quot; sous-unités nAChR tels que les souris L9&#39;A α4 α6 1 et les souris L9 2&#39;S, permettre une identification sans ambiguïté de neurones sur la base de leur expression fonctionnelle de la sous-unité de nAChR spécifique. Bien que la cellule entière enregistrements de patch-clamp de neurones dans des tranches de cerveau est fait de façon routinière par l&#39;électrophysiologiste qualifiée, il est difficile d&#39;appliquer localement des médicaments tels que l&#39;acétylcholine ou la nicotine à la cellule enregistrée dans une tranche de cerveau. La dilution de la drogue dans l&#39;superfusat (demande de bain) n&#39;est pas rapidement réversible et tube en U systèmes ne sont pas facilement adapté pour fonctionner avec des tranches de cerveau. Dans cet article, nous décrivons une méthode pour appliquer rapidement nAChR activant les médicaments pour les neurones enregistrés chez les adultes mOuse tranches de cerveau. Standard de cellules entières enregistrements sont faits à partir de neurones en tranches, et une seconde micropipette remplie d&#39;un médicament d&#39;intérêt est manoeuvré en position près de la cellule enregistrée. Une injection d&#39;air sous pression ou de l&#39;azote inerte à l&#39;intérieur de la pipette remplie de médicament entraîne une petite quantité de solution de médicament devant être éjectée à partir de la pipette sur la cellule enregistrée. En utilisant cette méthode, nAChR médiées par les courants peuvent être résolus avec une précision milliseconde. Temps d&#39;application de drogue peut facilement être modifiée, et la pipette remplie de médicament peut être retiré et remplacé par une nouvelle pipette, permettant courbes concentration-réponse doit être créé pour un seul neurone. Bien que décrite dans le contexte de nAChR neurobiologie, cette technique devrait être utile pour étudier de nombreux types de canaux ioniques ligand-dépendants ou des récepteurs de neurones à partir de tranches de cerveau.

Dans nos expériences, nous avons l&#39;habitude d&#39;enregistrer à partir de la dopamine (DA) de production de neurones de l&#39;aire tegmentale ventrale (ATV) et la substantia nigra pars compacta (SNC). Dans voltage-clamp mode, application de pression de l&#39;acétylcholine ou la nicotine à ces cellules entraîne habituellement de façon rapide, courant vers l&#39;intérieur cation qui atteint pic entre 100-200 ms (figure 1A-B). Décroissance du courant est largement dictée par la diffusion du m?...

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Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

Dans cet article, nous décrivons une méthode utile pour étudier ligand-gated fonction des canaux ioniques dans les neurones du cerveau tranches isolés de manière aiguë. Ce procédé implique l&#39;utilisation d&#39;une micropipette remplie de médicament pour application locale de médicaments à des neurones enregistrés à l&#39;aide des techniques classiques de patch-clamp.

Application locale de médicaments pour l&#39;étude des fonctions récepteur de l&#39;acétylcholine nicotinique dans des tranches de cerveau de souris

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

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Unit 1

Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Cholinergic Agonists and Antagonists Agents

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18.9K vues.  Purdue University. Dans cet article, nous décrivons une méthode utile pour étudier ligand-gated fonction des canaux ioniques dans les neurones du cerveau tranches isolés de manière aiguë. Ce procédé implique l'utilisation d'une micropipette remplie de médicament pour application locale de médicaments à des neurones enregistrés à l'aide des techniques classiques de patch-clamp.

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Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation des neurones à partir de tranches de cerveau de rongeurs pour étudier la transmission synaptique et de l&#39;image terminaisons présynaptiques

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Recherche

Neurosciences

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Les réponses de calcium dans les neurones d&#39;imagerie GFP-marqués de hypothalamiques tranches de cerveau de souris

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imagerie fibres sérotoninergiques dans la moelle épinière de souris Utilisation du CLARITY / Technique CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2. Consequently, investigation of structural details of the interaction between 5-HT2A and mGlu2 affecting schizophrenia-related behaviors represents a powerful translational tool. As previously shown, the head-twitch response (HTR) in mice is elicited by hallucinogenic drugs and this behavioral response is absent in 5-HT2A knockout (KO) mice3,4. Additionally, by conditionally expressing the 5-HT2A receptor only in cortex, it was demonstrated that 5-HT2A receptor-dependent signaling pathways on cortical pyramidal neurons are sufficient to elicit head-twitch behavior in response to hallucinogenic drugs3. Finally, it has been shown that the head-twitch behavioral response induced by the hallucinogens DOI and lysergic acid diethylamide (LSD) is significantly decreased in mGlu2-KO mice5. These findings suggest that mGlu2 is at least in part necessary for the 5-HT2A receptor-dependent psychosis-like behavioral effects induced by LSD-like drugs. However, this does not provide evidence as to whether the 5-HT2A-mGlu2 receptor complex is necessary for this behavioral phenotype. To address this question, herpes simplex virus (HSV) constructs to express either mGlu2 or mGlu2&#916;TM4N (mGlu2/mGlu3 chimeric construct that does not form the 5-HT2A-mGlu2 receptor complex) in the frontal cortex of mGlu2-KO mice were used to examine whether this GPCR heteromeric complex is needed for the behavioral effects induced by LSD-like drugs6.

This article describes how to inject viral vectors into the mouse frontal cortex to test behavioral assays that require GPCR heteromeric formation.

HSV-Mediated Expression du transgène de chimériques Constructs pour étudier la fonction Behavioral des GPCR hétéromères chez la souris

The heteromeric receptor complex between 5-HT2A and mGlu2 has been implicated in some of the behavioral phenotypes in mouse models of psychosis1,2.  ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

Application de la pincée de patch automatisée guidée par image pour l&#39;étude des neurones dans les tranches de cerveau

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug application during electrophysiological recording is the puff technique, which can be used to study the effect of pharmacological reagents on neuronal activities in brain slices. The greatest advantage of puff application is that the drug concentration around the recording site increases rapidly, thus preventing desensitization of membrane receptors. Successful use of puff application involves careful attention to the following elements: the concentration of the drug, the parameters of the puff micropipette, the distance between the tip of a puff micropipette and the neuron recorded, and the duration and pressure driving the puff (pounds per square inch, psi). This article describes a step-by-step procedure for recording whole-cell currents induced by puffing gamma-aminobutyric acid (GABA) onto a neuron of a prefrontal cortical slice. Notably, the same procedure can be applied with minor modifications to other brain areas such as the hippocampus and the striatum, and to different preparations, such as cell cultures.

We describe the puff technique, by which pharmacological reagents can be administered during whole-cell patch-clamp recording, and highlight various aspects of the features that are crucial for its success.

Cellule entière courants induits par l’Application de la bouffée de GABA dans des tranches de cerveau

Pharmacological administration is commonly used when conducting whole-cell patch-clamp recording in brain slices. One of the best methods of drug ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, very few have been widely accepted. Here, we propose&#160;a new procedure&#160;adapted from the well-known ex vivo brain slice technique, which offers a closer in vivo-like scenario than in vitro preparations, for investigating the early events triggering cell degeneration, as observed in Alzheimer&#39;s disease (AD). This variation consists of simple and easily reproducible steps, which enable preservation of the anatomical cytoarchitecture of the selected brain region and its local functionality in a physiological milieu. Different anatomical areas can be obtained from the same brain, providing the opportunity to perform multiple experiments with the treatments in question in a site-, dose-, and time-dependent manner. Potential limitations&#160;which could affect the outcomes related to this methodology are related to the conservation of the tissue, i.e., the maintenance of its anatomical integrity during the slicing and incubation steps and the section thickness, which can influence the biochemical and immunohistochemical analysis. This approach can be employed for different purposes, such as exploring molecular mechanisms involved in physiological or pathological conditions, drug screening, or dose-response assays. Finally, this protocol could also reduce the number of animals employed in behavioral studies. The application reported here has been recently described and tested for the first time on ex vivo rat brain slices containing the basal forebrain (BF), which is one of the cerebral regions primarily affected in AD. Specifically, it has been demonstrated that the administration of a toxic peptide derived from the C-terminus of acetylcholinesterase (AChE) could prompt an AD-like profile, triggering, along the antero-posterior axis of the BF, a differential expression of proteins altered in AD, such as the alpha7 nicotinic receptor (&#945;7-nAChR), phosphorylated Tau (p-Tau), and amyloid beta (A&#946;).

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

We present a method which can&#160;provide further insights into the early events underlying neurodegeneration and based on the established ex-vivo brain technique, combining the advantages of in vivo and in vitro experiments. Moreover, it represents a unique opportunity for direct comparison of treated and untreated group in the same anatomical plane.

Une autre approche pour étudier les événements primaires dans la neurodégénérescence utilisant des coupes de cerveau de Rat Ex Vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with subcellular location within cells where this function is carried out. To study the subcellular location of nicotinic ACh receptors (nAChRs) in native brain tissue, an optical method was developed for precise release of nicotine at discrete locations near neuronal membranes during electrophysiological recordings. Patch-clamped neurons in brain slices are filled with dye to visualize their morphology during 2-photon laser scanning microscopy, and nicotine uncaging is executed with a light flash by focusing a 405 nm laser beam near one or more cellular membranes. Cellular current deflections are measured, and a high-resolution three-dimensional (3D) image of the recorded neuron is made to allow reconciliation of nAChR responses with cellular morphology. This method allows for detailed analysis of nAChR functional distribution in complex tissue preparations, promising to enhance the understanding of cholinergic neurotransmission.

This article presents a method for studying nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in mouse brain slices by nicotine uncaging. When coupled with simultaneous patch clamp recording and 2-photon laser scanning microscopy, nicotine uncaging connects nicotinic receptor function with cellular morphology, providing a deeper understanding of cholinergic neurobiology.

Sonder la fonction des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine dans les coupes de cerveau de souris par photolyse éclair au Laser de la Nicotine Photoactivatable

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Implantation chronique d’ensemble-corticale Electrocorticographic tableau dans l’ouistiti commun

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Évaluation de l'induction à long terme de dépression dans les tranches de cérévelateur adultes

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...