Lorsqu’une fonction protéique particulière est modifiée par manipulation génétique, la coordination de l’échec irritant et de l’affaiblissement de fonctionnement moteur est considérée comme une condition nécessaire à la relation causale entre l’ILD et l’apprentissage moteur. Ici, nous démontrons l’utilisation de protocoles multiples pour évaluer ltd qui peuvent être induits par des mécanismes compensatoires chez les animaux manipulés par les gènes. Avant de récolter le cerveau, réfrigérer et oxygéner deux beakers de 50 millilitres d’ACSF sur la glace.
Lorsque la température de la solution atteint moins de quatre degrés Celsius, ajouter 50 microlitres d’une tétrodotoxine millimolaire à l’un des beakers glacés. Pour récolter le cerveau, tenez la tête et utilisez des ciseaux ophtalmologiques pour couper la peau superficielle le long de la ligne médiane. Rétractez manuellement la peau pour exposer largement la surface du crâne et utilisez les ciseaux pour couper le long du crâne horizontalement du trou spinocerebellar majeur à juste au-dessus des yeux et des oreilles avant de couper le crâne le long d’une ligne au-dessus des deux yeux.
Utilisez un scalpel pour couper le cerveau au milieu du cerveau et isoler la partie caudale du cerveau, y compris le cervelet, du crâne. Immerger l’échantillon dans le bécher glacé de l’ACSF et ajuster le tube à bulles de sorte qu’il ne remue pas le bloc cérébral dans le bécher. Après au moins sept minutes, utiliser une spatule pour ramasser le bloc cérébral et utiliser un morceau de papier filtre pour absorber tout excès d’ACSF.
Monter le côté ventral tissu vers le bas sur un morceau de deux par deux centimètres d’agar avec un adhésif médical approprié. Utilisez une lame pour découper l’hémisphère droit du tissu cérébral aussi parallèle que possible au plan dendritique des cellules de Purkinje. Couper et enlever l’autre côté de l’hémisphère et couper le cerveau entre le colliculi supérieur et inférieur.
Couper la moelle épinière et coller le côté droit du cervelet paré avec le bloc d’agar sur le plateau de spécimens pré-réfrigérés. Ensuite, en inclinant le plateau de spécimens, versez l’ACSF sur l’échantillon pour fixer le tissu et pour laver tout excès de colle. Pour trancher l’échantillon de cerveau, orientez le spécimen de telle sorte que le côté dorsal du cervelet soit à l’avant et versez assez de l’ACSF de coupe froide de glace complété avec la tetrodotoxine pour immerger complètement le cervelet.
Placez un tube à gaz dans la solution de coupe et lancez le bouillonnement avec un mélange oxygène-dioxyde de carbone. À l’aide de pinces fines et de loupes, retirer la mater arachnoïdide et exciser le pédontcle cerebellar. Après avoir enlevé le tronc cérébral et le bloc d’agar, faites pivoter le plateau à 180 degrés de sorte que la surface dorsale du cervelet fait face à la lame de rasoir du vibratome et ajustez le premier endroit de coupe.
Réglez l’amplitude vibratoire à 5,5 et la fréquence à 85 Hertz, la vitesse à trois à quatre, et l’épaisseur de la tranche à 300 micromètres. Au fur et à mesure que les tranches de cerebellar sont obtenues, utilisez un filet de nylon pour transférer les sections dans un incubateur acrylique dans un bain d’eau de 26 degrés Celsius et immerger complètement les échantillons dans l’ACSF fraîchement oxygéné pendant au moins une heure. Pour le rapport de pince de correction de cellules entières, dissoudre une picrotoxine micromolaire dans ACSF par ultasonication pendant trois minutes avant de perfuser une chambre d’enregistrement de 30 degrés Celsius avec la solution de toxine à un taux d’écoulement de deux millilitres par minute.
Après quelques minutes, transférer une tranche de cerebellar dans la chambre d’enregistrement et fixer le tissu avec un poids platine et des fils de nylon. Remplissez ensuite une électrode stimulante d’ACSF frais. Pour stimuler les fibres parallèles, placez l’électrode stimulante à la surface de la couche moléculaire à environ 50 micromètres de la couche cellulaire de Purkinje.
Pour la stimulation des fibres grimpantes, placez l’électrode stimulante au bas de la couche cellulaire de Purkinje et utilisez un microchargeur pour remplir une électrode d’enregistrement de huit microlitres de solution interne filtrée au potassium ou au césium de 0,45 micromètre. Appliquez une faible pression positive sur l’électrode d’enregistrement avant d’immerger l’électrode dans l’ACSF. La résistance aux électrodes doit être de deux à quatre mégaohms et le potentiel de jonction liquide doit être corrigé.
Approchez le corps sain de cellules brillantes d’une cellule Purkinje avec l’électrode d’enregistrement et poussez légèrement la surface de la cellule de Purkinje. Ensuite, arrêtez d’appliquer la pression positive et appliquez une pression négative jusqu’à formation d’un joint gigaohm. Ensuite, utilisez une pression négative pour établir une configuration cellulaire entière, en maintenant le potentiel de la membrane à moins 70 millivolts et en appliquant un moins deux millivolt 100 millisecondes impulsions à 0,1 hertz, surveillance continue de la résistance aux entrées, résistance en série, et la capacité d’entrée.
Pour l’induction à long terme de dépression, stimulez la couche moléculaire avec une impulsion de 0.1 milliseconde et appliquez un stimulus double d’impulsion pour identifier les courants post-synaptiques excitatoires parallèles de fibre. Une facilitation appariée d’impulsion et une augmentation graduelle de l’amplitude par rapport à l’augmentation de l’intensité de stimulation devraient être observées. Pour enregistrer la réponse au test, appliquez une seule impulsion hertzique de 0,1 et ajustez l’intensité du stimulus de sorte que l’amplitude évoquée soit d’environ 200 picoamps.
Stimuler les fibres grimpantes au bas de la couche cellulaire Purkinje et d’identifier les courants post-synaptiques excitatifs de fibre parallèles obtenus par l’activation de la fibre grimpante, appliquer un stimulus double impulsion. Une dépression pulsée appariée doit être observée d’une manière tout ou aucune en corrélation avec l’augmentation de l’intensité de la stimulation. Dans cette expérience représentative, une conjonction d’une stimulation parallèle de fibre et d’une stimulation de fibre d’escalade dans les conditions actuelles de pince ont été employées pour la préparation de tranche.
La forme de la pointe complexe obtenue par la stimulation conjonctive était semblable à celle obtenue par la stimulation de fibre grimpant seule avec le premier spikelet raide suivi de deux à trois pointes. Un pic complexe de forme similaire a été observé quand une stimulation parallèle de fibre a été suivie 50 millisecondes plus tard par un deuxième parallèle conjonctif et une stimulation de fibre d’escalade. Dans cet essai dans des conditions de pince de tension utilisant une solution interne césium-basée, une stimulation parallèle de fibre a été suivie 50 millisecondes plus tard par une application concomitante d’une deuxième stimulation parallèle de fibre et de la dépolarisation somatique.
Un courant intérieur a été obtenu lors de la dépolarisation somatique de moins 70 à zéro millivolts et le courant de queue a également été évoqué après la repolarisation. Enfin, cinq stimulus parallèles de fibre à 100 hertz ont été donnés simultanément avec la dépolarisation somatique dans des conditions de pince de tension. Encore une fois, une génération répétitive de courants intérieurs a été obtenue pendant la dépolarisation et le courant de queue a été induit après la repolarisation.
Pour évaluer la relation entre le cerebellar LTD et l’apprentissage moteur chez les animaux manipulés par les gènes, de multiples protocoles devraient être utilisés pour induire l’LTD dans des conditions physiologiques confortables. Si cerebellar LTD est visualisé chez les animaux manipulés par gène après l’apprentissage moteur, la relation causale entre eux peut être examinée plus directement.
