Cette technique tire parti de la microscopie à balayage laser multi-photons en conjonction avec la photolyse laser-flash d’une molécule de nicotine photoactivatable. Permettant l’activation précise des récepteurs cholinergiques nicotiniques. Cette technique permet un contrôle spatiotemporal fin sur l’application agoniste nicotinique de récepteur, fournissant un outil puissant pour l’étude des modèles fonctionnels d’expression de récepteur et de la transmission synaptique ou de volume cholinergique.
Avant de commencer la procédure, utilisez un tire-pipette programmable pour tirer une micropipette en verre d’un diamètre d’ouverture de 20 à 40 micromètres. Filtrer environ un millilitre de solution d’enregistrement à l’aide d’un filtre de 0,22 micron. Et résuspendez suffisamment de nicotine photoactivatable lyophilisée dans la solution d’enregistrement filtrée pour donner une concentration finale de deux millimaux.
Remplissez la micropipette d’application locale tirée avec 50 microlitres du médicament photoactivatable, et fixez la pipette dans un support de pipette monté sur un micromanipulateur. Connectez le support pipette par une longueur appropriée de tube à un système d’éjection de pression capable d’une application soutenue à basse pression. Et utilisez le micromanipulateur pour manœuvrer la pipette d’application locale dans la solution d’enregistrement extracellulaire.
Placez la pointe de pipette légèrement au-dessus d’un échantillon de tissu cérébral de souris, approximativement 50 micromètres de la cellule d’intérêt. Et appliquez brièvement un à deux livres par pouce carré de pression sur la pipette. Il devrait y avoir un déplacement minimal ou nul de la cellule d’intérêt.
Après avoir atteint une pince stable patch à cellules entières, allumer la faible application sur le dispositif d’éjection de pression, et saturer le tissu entourant la cellule avec de la nicotine photoactivatable pendant une à deux minutes. L’application locale introduit une complexité supplémentaire à l’expérience. Mais il épargne composé et permet des concentrations plus élevées de PA-Nic à utiliser.
Pour l’application du bain de la nicotine photoactivatable, dissoudre d’abord assez du médicament lyophilisé dans un volume de solution d’enregistrement approprié pour la recirculation continue à une concentration finale de 100 micromolaires. Et charger le mélange résultant dans un système de perfusion. Commencez ensuite la recirculation de la solution photoactivable de nicotine à un taux de 1,5 à 2 millimètres par minute, en utilisant des tubes d’un diamètre intérieur minimal et d’une longueur globale minimale pour minimiser le volume de recirculation requis.
Pendant la recirculation, bouillonner continuellement la solution avec du carbogen, et maintenir la température du bain à 32 degrés Celsius dans des conditions de faible lumière. L’application de bain bénéficie de la simplicité et de l’uniformité de la perméation pa-nic du tissu. Mais il utilise nécessairement des concentrations inférieures de micromolaire PA-Nic, et dépense des quantités totales plus élevées de composé.
Pour la visualisation en direct d’un neurone habenula médial, utilisez l’optique de contraste de contraste de la lumière transmise ou du différentiel infrarouge et une caméra vidéo pour établir un enregistrement stable et à cellule entière. Après avoir établi la configuration à haute résistance attachée aux cellules, mais avant l’effraction, passez la configuration et le logiciel au mode de balayage laser. Après l’effraction, utilisez le balayage laser pour vérifier que le colorant d’imagerie d’intérêt remplit passivement le neurone par diffusion.
Laissez le colorant remplir les compartiments cellulaires pendant au moins 20 à 30 minutes avant d’utiliser la fonction de balayage en direct pour visualiser le neurone et le compartiment subcellulaire d’intérêt. Sélectionnez les paramètres d’imagerie qui permettent une visualisation en direct précise des entités neuronales, en manipulant les paramètres appropriés pour affecter ou modifier la visualisation de l’affichage, la résolution, le rapport signal-bruit et le temps d’acquisition du cadre d’image au besoin. Pour améliorer le contraste du signal, ouvrez la fenêtre de la table de reup et ajustez les paramètres du plancher de la table de reup et du plafond.
Pour localiser une zone d’intérêt dans le tissu, sélectionnez le zoom optique 1X et utilisez les commandes panoramiques. Utilisez l’outil de la série Z pour sélectionner une position de démarrage et d’arrêt qui contient la cellule d’intérêt. Définissez une taille d’étape d’un micromètre et sélectionnez une taille d’image qui donnera une image à haute résolution.
Souvent 1024 par 1024 pixels par ligne. Puis image consécutivement le neurone dans chaque plan Z qui contient la cellule. Pour calibrer la stimulation laser, commencez le balayage du système avec une puissance laser d’imagerie supérieure au minimum, et affiner l’objectif de mise au point sur la mince couche de fluorescence marqueur rouge.
Sélectionnez une zone dans le champ de fluorescence à l’écart des débris et recouverte uniformément d’un marqueur, et ouvrez les outils, l’étalonnage et le menu d’alignement pour sélectionner la fonction de galvocalibration non cinglante. Suivez le tutoriel de points de combustion pour l’étalonnage spatial de la deuxième paire de miroirs galvanomètres, en sélectionnant le laser de 405 nanomètres, une puissance de stimulation laser de 400, et une durée de stimulation de 20 millisecondes. Pour donner des trous d’un à cinq micromètres de diamètre dans le marqueur rouge.
Sélectionnez mise à jour pour stimuler et actualiser l’image après la brûlure de la tache centrale, et déplacer l’indicateur rouge rond à l’emplacement réel de l’endroit du centre, du centre droit et du centre inférieur pour obtenir une grille de neuf taches. Pour tester l’étalonnage, ouvrez la fenêtre des points de marque et activez manuellement les paramètres de stimulation des taches définies dans une nouvelle zone de l’échantillon, en prenant soin que le dernier fichier d’étalonnage correct soit chargé dans la fenêtre des points de marque. Appliquez ensuite une impulsion de test pour vérifier l’étalonnage correct.
Pour visualiser et localiser brièvement la zone d’intérêt subcellulaire, sélectionnez l’analyse en direct et utilisez augmentez le zoom optique pour visualiser les petites structures au besoin. Placez le réticule à point unique juste à côté de la membrane cellulaire et réglez les paramètres de photostimulation à une durée d’une à 50 millisecondes, à une puissance laser d’un à quatre milliwatts et à au moins un essai. Sélectionnez ensuite les points de marque d’exécuter pour initier le protocole des points de marque et observez l’acquisition de données d’électrophysiologie en temps réel.
La fluorescence photoactivable de nicotine 2PE d’un millimolar PA-Nic est facilement détectée pendant l’éjection de pression d’une pipette locale d’application comme démontré. Considérant que la livraison des principaux produits photochimiques de la réaction photoactivatable de photolyse de nicotine ne génère aucun signal fluorescent à la même concentration et puissance d’excitation et longueur d’onde. Démontrer la spécificité des résultats photoactivatables de nicotine.
L’imagerie de la nicotine photoactivatable appliquée sur le tissu cérébral tel que démontré révèle la présence du médicament dans les 100 à 200 micromètres de la pipette d’application locale. Confirmer que la nicotine photoactivable peut être efficacement livrée au tissu cérébral par application locale. Ici, des images de haute qualité dans lesquelles la morphologie neuronale semble être complète, le bruit est minimisé, et les débris n’interfèrent pas avec l’interprétation de la morphologie cellulaire, sont montrés.
Ces images, cependant, sont d’une qualité inférieure. En raison d’un rapport signal-arrière-plan plus faible et de débris importants. L’appariement de la microscopie à balayage laser à deux photons des neurones habenula médials dans les tranches de cerveau avec la photolyse flash laser de PA-Nic comme démontré, permet la réconciliation des réponses électrophysiologiques avec la morphologie cellulaire.
La photolyse à un endroit effectuée à intervalles de 10 secondes permet un temps de récupération suffisant pour le courant de détention de base. Bien qu’un intervalle plus court d’une seconde entraîne une augmentation graduelle du courant de détention au fur et à mesure que le protocole progresse. Suggérant que la nicotine n’a pas assez de temps pour se diffuser loin du système avec les intervalles plus courts.
Lors de la conception d’expériences utilisant des molécules photoactivatables, il est important de se rappeler de sélectionner des indicateurs fluorescents et de signaler les fluorophores avec des spectres d’émission d’excitation compatibles. PA-Nic est compatible avec la plupart des fluorophores communs en raison de son pic de photolyse à courte longueur d’onde. Lors du choix de la technique d’application PA-Nic la plus appropriée, il est important d’examiner attentivement l’expression fonctionnelle, l’activité physiologique des récepteurs nicotiniques dans les neurones d’intérêt.
L’utilisation habile de cette technique permet le contrôle spatiotemporal fin de l’application de nicotine, qui permet de nouvelles possibilités passionnantes pour étudier la cinétique de l’engagement indigène de récepteur nicotinique, de la localisation subcellulaire, et de la modulation de l’activité neuronale par activation nicotinique de récepteur.
