Nous décrivons un protocole pour la microdissection et l’isolement ultérieur des microphages cardiaques résidents par tri cellulaire activé par fluorescence spécifiquement à partir des sinus et des ganglions AV chez la souris. Grâce à la microdissection précise du sinus et du nœud V, suivie de la combinaison du tri cellulaire magnétique et activé par fluorescence, nous sommes en mesure d’isoler spécifiquement les macrophages résidents du sinus et du nœud V avec une grande pureté. L’identification et l’isolement de macrophages résidents cardiaques provenant de régions distinctes du cœur permettent d’étudier davantage leur phénotype et leur impact spécifique à la région sur l’électrophysiologie cardiaque.
Après avoir isolé le cœur, effectuer les procédures de microdissection dans une boîte de dissection avec du PBS glacé une fois sous un microscope à dissection. Utilisez des repères anatomiques cardiaques tels que l’aorte, l’artère pulmonaire, les sinus coronaires et le ventricule gauche ou droit pour déterminer le gauche-droit et l’antéro-postérieur du cœur. Une fois l’orientation déterminée, placez le cœur avec l’avant au bas du plat pour exposer les grosses veines postérieures.
Couper le long de la rainure entre les ventricules et les oreillettes pour enlever la majorité des ventricules. Conservez la partie auriculaire. Fixez le cœur à la boîte de dissection en insérant des broches à travers la partie restante du mur libre BT et le LAA.
Coupez le mur libre de VR restant vers le haut à travers la valve tricuspide et la veine cave supérieure. Retournez le PR et le RV et épinglez le RAA pour exposer la région intercavale de la cavité RA et le septum auriculaire. Pour la microdissection du SAN, couper le cœur le long du septum interauriculaire parallèle à la crista terminalis pour séparer la région intercavale afin d’obtenir l’échantillon SAN.
Placez l’échantillon dans un tube microcentrifuge vide de 1,5 millilitre sur de la glace. Pour la microdissection de l’AVN, épingler les parties restantes du cœur à travers le tissu adjacent au septum interauriculaire et au septum interventriculaire pour faire face au côté auriculaire droit du septum interauriculaire vers le haut. Regardez l’oreillette droite sur la surface endocardique pour le triangle de Koch qui sera bordé antérieurement par la ligne charnière du feuillet septal de la valve tricuspide et postérieurement par le tendon de Todaro.
L’orifice du sinus coronaire est observé à la base. Hachez le tissu SAN et AVN avec des scalpels. Ajoutez ensuite 500 microlitres de tampon de digestion fraîchement préparé à chaque échantillon et lavez tous les tissus émincés de la paroi du tube de microcentrifugation.
Pipeter doucement pour aider à digérer l’échantillon et homogénéiser le tissu sur une machine à vortex. Après digestion, transférer la suspension tissulaire dans un nouveau tube centrifuge de 15 millilitres en la faisant passer à travers une crépine cellulaire de 40 micromètres. Rincez la passoire cellulaire avec cinq millilitres supplémentaires de tampon de tri cellulaire pour arrêter la digestion.
Retirez le surnageant. Après avoir remis en suspension la pastille de cellule avec 90 microlitres de tampon de tri cellulaire, ajoutez 10 microlitres de microbilles CD45 par 10 millions de cellules totales à la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Bien mélanger les échantillons.
Pendant le temps d’incubation de la suspension cellulaire avec des microbilles et un mélange d’anticorps, préparer le jeu de séparation magnétique en fixant la colonne magnétique à un séparateur magnétique approprié, puis en plaçant un tube de collecte sous la colonne magnétique. Préparer les colonnes magnétiques en rinçant avec 500 microlitres de tampon de tri cellulaire ajouté en haut de la colonne et en laissant passer le tampon. Appliquez immédiatement la suspension de cellule sur la colonne, en évitant les bulles d’air, pendant le passage du tampon de tri des cellules.
Lavez la colonne trois fois avec 500 microlitres de tampon de tri cellulaire. Ajoutez un millilitre de tampon de tri cellulaire sur la colonne. Retirez la colonne du séparateur magnétique et placez-la sur un nouveau tube de collecte.
Rincer immédiatement la colonne en appliquant fermement le piston fourni avec la colonne pour obtenir le flux continu contenant les cellules marquées magnétiquement. Après avoir appliqué l’échantillon non coloré et les tubes de compensation, ajustez les tensions de chaque canal pour aligner les pics positifs et négatifs sur la position correcte de l’axe. Définissez la stratégie de contrôle telle que décrite dans le manuscrit en utilisant DAPI comme marqueur de viabilité.
Vérifiez les diagrammes de cytométrie de flux pour confirmer que la population cellulaire d’intérêt est correctement indiquée sur les graphiques. Rassemblez les cellules triées dans un milieu ou un tampon en fonction de la nécessité d’expériences ultérieures. Pour confirmer une dissection correcte, l’identification du SAN et de l’AVN a été effectuée à l’aide d’immunofluorescence et de coloration trichrome de Masson.
La coloration immunofluorescente des cellules du système de conduction positive HCN4 dans le SAN et l’AVN, ainsi que la coloration trichrome de Masson du SAN et de l’AVN sont présentées ici. La stratégie de contrôle pour le tri cellulaire des macrophages cardiaques résidents a permis d’identifier les cellules mononucléaires en excluant les doublets dans la zone de diffusion vers l’avant de l’axe des y par rapport à celle de l’axe des x. Les cellules mortes ont été exclues par le DAPI.
Les cellules vivantes ont été fermées pour les leucocytes CD45 positifs, puis pour les cellules myéloïdes CD11b positives. Les macrophages cardiaques ont été identifiés par l’expression de F4/80 et de CD64, puis stratifiés par l’expression de l’antigène lymphocytaire six. Des cellules fraîchement triées ont été observées en microscopie à fond clair.
Les cellules étaient positives pour CD45 lorsqu’elles ont été observées sous le canal PE fluorophore. Lorsqu’on a observé un fluorophore de taille APC à sept canaux, la même vue des cellules triées a montré des cellules CD11b positives. Le fluorophore PE taille sept canaux a été utilisé pour identifier le phénotype positif F4/80.
Et les cellules triples positives ont été identifiées comme des macrophages résidents cardiaques. Les macrophages cardiaques isolés cultivés en milieu jusqu’à six jours sont indiqués par des flèches blanches, tandis que les flèches noires indiquent les cellules mortes. Les macrophages triés peuvent être utilisés pour d’autres études fonctionnelles telles que des expériences de pince patch ou des études d’expression telles que le séquençage de l’ARN ou des études protéomiques.
