Les travaux menés dans le laboratoire Lécuyer est soutenu par un financement de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG), les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) et le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre et Gaël Moquin-Beaudry sont pris en charge par les bourses de recherche de premier cycle du CRSNG, tandis que Carole Iampietro est pris en charge par la bourse postdoctorale Angelo Pizzagalli.

1. Préparation de la sonde d&#39;ARN Vue d&#39;ensemble: La section suivante décrit les étapes nécessaires pour faire digoxigénine (DIG)-sondes marquées ARN Convient pour les poissons. La première étape consiste à cloner ou PCR amplification d&#39;une séquence correspondant à la région transcrite d&#39;un gène d&#39;intérêt qui sera utilisé pour générer une sonde spécifique de la séquence. Ceci peut être obtenu par clonage premier segment de gène dans un plasmide dans lequel le site de clonage multiple est flanqué par des éléments promoteurs de bactériophage (T7, T3 ou SP6), qui peut alors servir de matrice pour la PCR en utilisant des amorces flanquantes qui incorporent les séquences promotrices , générant ainsi un produit de PCR linéaire avec des séquences promotrices différentes à chaque extrémité (figure 1A). En variante, afin d&#39;éviter l&#39;étape de clonage, on peut aussi réaliser une amplification par PCR à partir d&#39;ADN génomique ou d&#39;ADNc en utilisant des oligonucléotides qui comprennent T7, T3 ou SP6 dans leurs séquences 5 &#39;extrémités (par exemple T7:5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 &#39;; T3: 5&#39;-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3&#39;; Sp6: 5&#39;-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 &#39;). Les produits linéaires de PCR sont ensuite utilisés comme modèles pour donner un sens Dig-étiquetée ou des sondes d&#39;ARN antisens par le ruissellement transcription in vitro avec la polymerase appropriée (figure 1B). Lors de sondes pour les gènes spécifiques, nous vous recommandons de préparer à la fois sens et antisens sondes d&#39;ARN polymérases distinctes à l&#39;aide, ce qui sera utile pour évaluer la spécificité du signal FISH (c.-à moins que le gène d&#39;intérêt est transcrit dans l&#39;orientation antisens, le sens sonde d&#39;ARN révèle la niveau de bruit de fond). Dans toutes les étapes suivantes, il faut prendre grand soin d&#39;éviter la dégradation potentielle par les ribonucléases contaminantes (ARNases) en commençant par le nettoyage de toutes les zones de banc et de l&#39;équipement avec de l&#39;éthanol à 70% ou commerciales des solutions de décontamination RNAse et en utilisant RNase-Free fournitures (par exemple l&#39;eau, des conseils, des microtubes). Mamanriaux <ul><li> Tubes de 1,5 ml microtubes, (Abgene, Rochester, NY, USA Cat. No 0900) </li><li> Gel d&#39;extraction de kits (QIAGEN, Mississauga, ON, Canada, cat. N ° 28706). </li><li> RNAse eau (Wisent, Cat Inc. N ° 809-115-CL) </li><li> ARN polymérases (T7, T3 ou SP6). (20 U / ul, Fermentas Biosciences. No. de cat. EP0101, EP0111, EP0131). </li><li> Inhibiteurs de ribonucléase RNase OUT (40 U / pl), (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. No. 10777-019). </li><li> Digoxigénine (DIG) des mélanges de nucléotides (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Laval, QC, Canada. Cat. No.11209256910). </li></ul> Équipement <ul><li> Plateau de micro-centrifugeuse </li><li> Électrophorèse sur gel appareil </li></ul><ol><li> Amplifier par PCR spécifique d&#39;un gène de séquence d&#39;ADN génomique, d&#39;ADNc, d&#39;ADN plasmidique ou de générer un produit PCR linéaire flanqué de bactériophage T7, des séquences de promoteur T3 ou SP6. Suivez les recommandations du fabricant pour les conditions de PCR. </li><li> Vérifier la qualité et size du produit de PCR par électrophorèse sur gel d&#39;agarose. D&#39;accise et purifier des produits PCR en utilisant une norme de gel extraction kit selon recommandations du fabricant et éluer le produit dans 50 ul de tampon. </li><li> Précipiter le produit de la PCR en ajoutant 5 ul d&#39;acétate de sodium 3M (pH 5,2) et 150 pi de glace 100% d&#39;éthanol froid, et placer les tubes à -70 ° C pendant la nuit. Centrifuger les tubes à 13.000 xg pendant 10 min à 4 ° C et laver le culot avec de l&#39;éthanol à 70%. Faites tourner encore une fois, éliminer toute trace d&#39;éthanol et sécher à l&#39;air le culot. Remettre en suspension dans 25-50 pi d&#39;eau sans RNase. </li><li> Transcrire Creusez sonde marquée à l&#39;aide 200-500 ng produit de PCR purifié dans une réaction de 20 ul comme suit: 2 pi de tampon de transcription T7 10X (Invitrogen), 1 pi (20 U / pl) d&#39;inhibiteur de RNase, 2 pl Dig-NTP mélange , et 2 pl ARN polymérase T7 (20 U / pl). Amener le volume final de 20 ul avec de l&#39;eau sans RNase. Incuber la réaction de transcription à 37 ° C pendant 3-4 heures. </li><li> Réglez transcription mélange à 50 pi avec de l&#39;eau sans RNAse et précipiter le Dig-ARN marqué la sonde comme décrit à l&#39;étape 4. Remettre en suspension le culot d&#39;ARN lavé dans 100 ul d&#39;eau sans RNase. Conserver les échantillons remis en suspension à -70 ° C. </li><li> Quantifier la sonde à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre NanoDrop. Pour vérifier la qualité de la sonde, exécutez un échantillon 1-2 ul sur un gel coloré à 1-2% d&#39;agarose au bromure d&#39;éthidium. </li></ol> 2. Collecte et fixation des embryons de drosophile Vue d&#39;ensemble: Cette section décrit les étapes de récolte et de transformation mis en scène embryon de drosophile. Selon le nombre d&#39;embryons nécessaires, les mouches peuvent être maintenus dans des cages de différentes tailles de population. Les étapes suivantes sont effectuées à l&#39;aide des collections de 900 cm 3 cages cylindriques, en utilisant des plaques de 100mm de pommes de collecte de jus. La fixation adéquate exige le retrait de deux couches de protection entourant l&#39;embryon: le chorion extérieur et l&#39;intérieur vitellinmembrane e 13. Une fois récoltées, les embryons sont d&#39;abord baigné dans une solution javellisée à 50% pour éliminer le chorion, puis ils sont mélangés dans une solution biphasique contenant de l&#39;heptane (perméabilise la membrane vitelline) et du PBS contenant 3,7% de formaldéhyde. La membrane vitelline est ensuite éliminé par craquage et le transfert des embryons dans un mélange biphasique de l&#39;heptane et de méthanol. Fixation embryon proprement dit et le retrait de la membrane vitelline est essentiel pour le succès de la procédure FISH aval. Matériels <ul><li> Jus de pomme plaques de gélose (40% de jus de pomme, 4% de saccharose, de l&#39;agar 3,5%, 0,3% de méthyl paraben) avec de la pâte de levure sou-entreprises (levure de boulanger mélangé avec de l&#39;eau à la consistance du beurre) </li><li> Paraformaldéhyde en poudre (Sciences de la microscopie électronique, Hatfield, PA, États-Unis, cat. N ° 19208) </li><li> Heptane </li><li> Méthanol </li><li> Solution Bleach 3% </li><li> 20 ml en verre flacons à scintillation (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada, cat. No 03-337-15). </li></ul> Équipement <ul><li> Population cages </li><li> Paniers de collecte (faites en utilisant un maillage Nitex et la partie supérieure d&#39;une réduction de 50 ml tube en polypropylène dans lequel un trou a été découpé dans le couvercle). </li><li> Petit pinceau </li><li> Vortex dessus de table </li></ul><ol><li> Pré-claires bien nourris cages de population avec un jus de pomme / levure fraîche plaque pendant 1 heure à 25 ° C. </li><li> Ajouter un nouveau jus de pomme / levure plaque à la cage de récolter des embryons à un stade précoce. Incuber la cage pendant 4 heures à 25 ° C (à noter que les temps de collecte peut être ajustée selon les étapes souhaitées). </li><li> Préparer une solution de formaldéhyde fraîche 37% en combinant 3,7 g de paraformaldéhyde en poudre, 70 pi de KOH 2N et 7,3 ml d&#39;eau milliQ dans un flacon à scintillation en verre sous une hotte chimique. Faire bouillir la solution jusqu&#39;à ce que la poudre soit complètement dissoute paraformaldéhyde, puis laisser refroidir à température ambiante et filtrer dans un flacon à scintillation nouvelle. </li><li> Préparer une solution de fixation par biphasiquecombinant 2,25 ml de PBS 1X avec 250 ml de formaldéhyde à 37% dans un flacon à scintillation, puis en ajoutant 7,5 ml d&#39;heptane. </li><li> Récolter la plaque de jus de pomme de la cage et la collecte des embryons en ajoutant un peu d&#39;eau du robinet à température ambiante et délicatement brosser les embryons de la plaque avec le pinceau. Transférer les embryons remises en suspension dans un panier et rincer à l&#39;eau tiède du robinet. </li><li> Embryons Dechorionate de 90 secondes par baignant les paniers de collecte de l&#39;eau de Javel, puis rincer abondamment à l&#39;eau tiède du robinet (eau de javel jusqu&#39;en odeur a disparu). </li><li> Démonter le panier de collecte, la collecte des embryons délicatement à l&#39;aide d&#39;un pinceau et de les transférer dans la solution de fixation biphasique. Les embryons vont s&#39;accumuler à l&#39;interface entre le PBS et couches heptane. </li><li> Flacons à scintillation joint et le fixer à un vortex. Agiter pendant 20 min à réglage le plus bas. </li><li> Retirez et jetez la plupart des phases de CPE et supérieure inférieurs heptane à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur. Aspirerle reste de PBS / heptane / embryons mélange dans la pipette. Goutte à goutte, élimine la phase inférieure du PBS de la pipette, en prenant soin de ne pas éliminer les embryons. Déposer les embryons dans un tube de 1,5 ml contenant une solution biphasique de 500 ul heptane (phase supérieure) et 500 ul de méthanol (phase inférieure). </li><li> Agiter les tubes vigoureusement à la main pendant 30-45 sec pour casser les membranes vitellines. Une fois fissurée, les embryons vont sombrer dans le méthanol. </li><li> Jeter la phase supérieure heptane et d&#39;embryons non fissurées à l&#39;interphase heptane / méthanol et ajouter 500 ul de méthanol. Agiter pendant 5 sec. </li><li> Laver 3 fois avec du méthanol et de stocker les embryons à -20 ° C (à ce stade, les embryons peuvent être conservés pendant des semaines / mois). </li></ol> 3. Post-traitement des lavages de fixation, d&#39;hybridation et de post-hybridation Vue d&#39;ensemble: Cette section détaille les étapes de traitement de perméabilisation embryon avant FISH, pré-hybridation,hybridation avec les sondes d&#39;ARN et de post-hybridation lavages. Pour les étapes initiales de perméabilisation les embryons sont traités comme une piscine dans un seul tube (étapes 1-9 ci-dessous, dans le but de 10-15 ul d&#39;embryons installés / échantillon), mais ils sont répartie dans des puits individuels d&#39;une plaque de 96 puits PCR avant de procéder à l&#39;étape de pré-hybridation (étape 10 ci-dessous). Cela permet d&#39;assurer un traitement encore de tous les embryons dans les phases initiales de l&#39;expérience. Lorsque la mise en place d&#39;une expérience FISH, il est important d&#39;inclure des contrôles négatifs pour déterminer le niveau du signal de fond dans les expériences individuelles. Pour cela, nous recommandons d&#39;inclure l&#39;échantillon «non-sonde» et, comme il est indiqué à l&#39;article 1, un échantillon hybridé avec le «sens» sonde d&#39;ARN, qui donnent généralement un signal comparable à l&#39;état de la «non-sonde». Matériaux: <ul><li> Méthanol </li><li> Saline tamponnée au phosphate avec 0,1% de Tween-20 (PBT) </li><li> Protéinase-K 1 mg / ml de solution mère (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Canada. Catalogue n ° P2308) </li><li> Glycine (20 mg / ml de solution mère) </li><li> Solution d&#39;hybridation: formamide 50%, SSC 5X, 0,1% de Tween-20, 100 g / ml d&#39;ADN de sperme de saumon cisaillé, 100 ug / ml d&#39;héparine. </li><li> 0,2 ml halfskirted plaques à 96 puits PCR, Abgene, Rochester, NY, USA Cat. Non 0900) </li></ul> Équipement <ul><li> Four à hybridation bain, le bloc chauffant de l&#39;eau ou numérique réglable de 56 ° C, 80 ° C ou 100 ° C, ou une machine de PCR. </li><li> Pipettes multicanaux (recommandé pour simplifier les opérations de lavage) </li><li> Nutation mélangeur </li></ul><ol><li> Rincer les embryons dans le méthanol, puis dans un mélange 1:1 de methanol: PBT, puis deux fois en PBT. </li><li> Fixer les embryons pendant 20 min dans 1 ml de PBT contenant du formaldéhyde 3,7% (fraîchement préparé comme décrit dans l&#39;étape 11) avec balancement constant sur une nutator. </li><li> Laver embryons pour 3 fois pendant 2 min en PBT tout bascule. </li><li> Préparer une solution de 3 pg / ml de protéinase K (PK) dilué dans PBT et ajouter500 pi de solution à échantillons. Incuber les échantillons pendant 10 min à température ambiante sans agitation. Mélanger embryons toutes les 2 min par le jet avec une pipette ou en retournant doucement les tubes. </li><li> Transfert d&#39;embryons échantillons sur la glace pendant 1 heure. </li><li> Déplacer des échantillons à la température ambiante et éliminer la solution de PK. Laver 2 fois pendant 2 minutes avec 1 ml de PBT + 2 mg / ml de glycine. </li><li> Fixer des échantillons 20 min dans 1 ml de formaldéhyde PBT + 3,7% avec bascule. Rincez embryons 5 fois en PBT. </li><li> Rincez embryons avec 1 ml d&#39;un mélange 1:1 de PBT et de la solution Hyb. Remplacez-le par 0,5-1 ml de solution Hyb 100% (à cette étape, les embryons peuvent être conservés pendant plusieurs jours / semaines à -20 ° C). </li><li> Embryons aliquotes dans des puits individuels d&#39;une plaque de 96 puits (~ 10-15 pour but ul d&#39;embryons installés / puits, prenez soin d&#39;utiliser des embouts grande ouverture pour éviter d&#39;endommager les embryons). </li><li> Faire bouillir 100 l / échantillon de solution Hyb pendant 5 min, puis refroidir sur glace pendant 5 min. Cette solution est utilisée pour l&#39;échantillon de pré-hybridation (pré-Hyb). </li><li> Ajouter 100 ul / échantillon de pré-Hyb solution et incuber pendant au moins 2 heures à 56 ° C. </li><li> Pour chaque échantillon, diluer ~ 100 ng de sonde dans 100 ul de solution Hyb. Chauffer à 80 ° C pendant 3 min, puis refroidir sur glace pendant 5 min (sondes chauffées peuvent être conservés sur de la glace pendant plusieurs heures). </li><li> Enlever la solution de pré-Hyb à partir des embryons et la remplacer par la solution de sonde d&#39;ARN. </li><li> S&#39;hybrider à 56 ° C pendant 12-16 heures. </li><li> Préchauffer les solutions de lavage suivants à 56 ° C: (A) 200 l / échantillon de solution Hyb; (B) 100 l / échantillon d&#39;un mélange 3:1 de Hyb: PBT; (C) 100 l / échantillon d&#39;un 01h01 mélange de Hyb: PBT; (D) 100 l / échantillon d&#39;un mélange 1:3 de Hyb: PBT; (E) 400 l / échantillon de PBT. </li><li> Rincer les échantillons avec 100 ul de solution de lavage A, puis effectuer l&#39;étape de lavage avec 100 pl / AD échantillon de solutions à 56 ° C pendant 15 min à chaque fois. Puis, lavez échantillons 4 fois pendant 5 min avec 100 ul / échantillon de la solution E à 56 ° C. </li><li> Échantillons refroidir à température ambiante. </li></ol> Vue d&#39;ensemble: Cette section décrit les anticorps et les réactifs de détection utilisées pour détecter et visualiser la répartition de l&#39;hybridation sonde d&#39;ARN signal suivant. Ces étapes sont décrites schématiquement dans la figure 2. Ici, nous présentons uniquement les réactifs de détection standard que nous utilisons pour l&#39;amplification du signal robuste, mais il existe une variété de réactifs disponibles dans le commerce qui peuvent être utilisés comme des alternatives, en particulier lors de l&#39;exécution à double POISSONS expériences de co-détection des ARN différents simultanément pour les protéines-ARN double coloration. Des exemples de résultats obtenus avec ce protocole sont affichées dans la mosaïque motif de l&#39;expression d&#39;ARNm / localisation dans la figure 3. Matériels <ul><li> HRP-conjugué anticorps monoclonal anti-DIG (Jackson Laboratories Inc ImmunoResearch Cat. No. 200-032-156) </li><li> Conjugué à la biotine monoclonal de souris anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc Cat. N ° 200-062-156) </li><li> Streptavidine-HRP (Molecular Probes, Eugene, USA, Cat. No.S991) </li><li> Cy3-tyramide conjugués (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, Etats-Unis, No. de cat. SAT704A) </li><li> DABCO solution de montage: Dans un tube de 50 ml, diluer 1,25 g de DABCO (1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane; Sigma D-2522) dans 15 ml de PBS 1X, puis ajouter 35 ml de glycérol et mélanger jusqu&#39;à ce que tout homogène. Par mélange préalable avec du PBS, la poudre est dissoute DABCO très rapidement. Magasin solution de montage à -20 ° C. </li><li> Lames de verre, des lamelles </li></ul> Équipement <ul><li> Nutation mélangeur </li><li> Pipette multicanaux </li><li> Microscope à fluorescence </li></ul><ol><li> Préparer la solution PBTB, contenant PBT + 1% de lait écrémé sec (généralement 50-100 ml est suffisant pour tout le réactif de détection et d&#39;incubation étapes de lavage). </li><li> Bloquer les échantillons pendant 10 min à température ambiante dans 100 ul PBTB / échantillon, tout en se balançant sur nutator. </li> &lt;li&gt; Supprimer solution de blocage à partir d&#39;embryons et des échantillons incuber pendant 1,5-2 heures à température ambiante avec 100 ul / échantillon de la solution de biotine anticorps monoclonal anti-DIG (dilué 1/400 en stock dans PBTB) avec bascule. </li><li> Laver les échantillons 6 fois pendant 5 min chacun avec 100 ul PBTB / échantillon avec bascule. </li><li> Incuber 1,5 h à température ambiante avec 75 ml / échantillon de solution de streptavidine-HRP (dilution 1/100 en stock au PBTB, 10 pg / ml de concentration finale) avec bascule. </li><li> Laver les échantillons 6 fois 5 min à chaque fois. 100 PBTB ul / échantillon avec basculement (pour la contre-coloration d&#39;ADN, diluer la concentration 1X DAPI à travailler dans PBTB et utiliser cette solution dans la première étape de lavage) </li><li> Rincez embryons avec PBT, puis laver 2 fois pendant 5 min avec du PBS. </li><li> Incuber les échantillons pendant 2 heures à la température ambiante sur la nutator avec 50 pl / échantillon de Cy3-tyramide solution (dilué 1/50 dans du tampon d&#39;amplification tyramide). A partir de cette étape, assurez-vous de garder les échantillons dans un récipient blindé léger. &lt;/ Li&gt; <li> Laver les échantillons 6 fois pendant 5 min chacun avec 100 ul de PBS / échantillon sur nutator. </li><li> Retirer du PBS et ajouter 100-125 l / échantillon de solution de montage contenant du glycérol à 70% et 2,5% (DABCO). Conserver les échantillons à 4 ° C. Ces échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs années. </li><li> En utilisant une pointe de gros calibre, remettre en suspension les embryons en pipetant doucement les échantillons et transférer 25 ul d&#39;embryons sur une lame de verre, puis placez une lamelle sur les embryons et joint d&#39;étanchéité sur la lame avec du vernis à ongles. </li><li> Analyser les échantillons d&#39;embryons en utilisant un microscope à fluorescence. </li></ol>

<ol>
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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+protocols+in+Drosophila+embryos+and+tissues.">Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues.</a> Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).</li><li>Lecuyer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+fluorescent+in+situ+hybridization+in+Drosophila.">High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila.</a> Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).</li><li>Kosman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846 (2004).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Pour les étapes de synthèse de la sonde, nous générons habituellement en run-off des sondes d&#39;ARN antisens par transcription in vitro à partir des ADNc pleine longueur drosophile amplifiés à partir des plasmides présents dans la collection de Drosophila Gene (DGC), une ressource en détail à l&#39;adresse suivante: <a href="http://www.fruitfly.org/DGC/index.html" target="_blank">http://www .fruitfly.org / DGC / index.html</a> 14,15. Cette approche a été large...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> T7, T3 ou SP6 ARN polymérase </td><td> Fermentas Life Sciences </td><td> EP0101, EP0111, EP0131 </td><td> Les kits contiennent un tampon de réaction. </td></tr><tr><td> DIG RNA Labeling Mix </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11 277 073 910 </td><td></td></tr><tr><td> RNAguard </td><td> Amersham Biosciences </td><td> 27-0816-01 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acétate de sodium 3M </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Froide éthanol à 100%. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Froide éthanol à 70%. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solution de Javel diluée à 1:1 avec de l&#39;eau. </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heptane </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Méthanol </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> protéinase K </td><td> Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada </td><td> Catalog No. P2308 </td><td></td></tr><tr><td> Solution de formaldéhyde à 40%, fraîchement préparé </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solution PBS-Tween (PBT) </td><td></td><td> 1xPBS, 0,1% de Tween-20 </td><td></td></tr><tr><td> Solution de glycine </td><td></td><td> 2 mg / ml de glycine en PBT </td><td></td></tr><tr><td> HRP-conjugué anticorps monoclonal anti-DIG </td><td> Jackson Laboratories Inc ImmunoResearch </td><td> 200-032 - 156 </td><td> (1/400 de dilution de 1 mg / ml de solution mère dans PBTB </td></tr><tr><td> Conjugué à HRP moutons monoclonal anti-DIG </td><td> Roche Applied Science, Laval, QC </td><td> 1 207 733 </td><td> 1/500 de dilution de la solution mère dans PBTB </td></tr><tr><td> Biotine-conjugué anticorps monoclonal de souris anti-DIG </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove, PA, USA </td><td> 200-062-156 </td><td> (1/400 de dilution de 1 mg / ml de solution mère dans PBTB </td></tr><tr><td> Streptavidine-HRP </td><td> Molecular Probes, Eugene OR, USA </td><td> S991 </td><td> (1/100 de dilution d&#39;un 1 ug / ml de bouillon </td></tr></tbody></table>

whole mount rna fluorescent in situ hybridization of drosophila embryos

Évaluer le profil d&#39;expression d&#39;un gène, ainsi que les propriétés de localisation subcellulaire de ses ARN transcrit, sont des éléments clés pour la compréhension de sa fonction biologique au cours du développement. ARN hybridation in situ (ISH-ARN) est une méthode puissante utilisée pour visualiser les propriétés de distribution d&#39;ARN, que ce soit au niveau de tous les organismes, cellulaires ou subcellulaires 1. ARN-ISH est basée sur l&#39;hybridation d&#39;une sonde d&#39;acide nucléique marquée (par exemple un ARN antisens, oligonucléotides) complémentaire de la séquence d&#39;un ARNm ou d&#39;une cible non-codante d&#39;ARN d&#39;intérêt 2. Comme la procédure exige des renseignements séquence primaire seul à générer une séquence des sondes spécifiques, il peut être universellement appliquée à un large éventail d&#39;organismes et les échantillons de tissus 3. En effet, un certain nombre d&#39;études à grande échelle ISH ont été prises pour documenter l&#39;expression des gènes et de l&#39;ARN dynamique de localisation dans divers organismes modèles, ce qui a conduit à lamise en place de ressources communautaires importantes 4-11. Bien qu&#39;une variété de marquage des sondes et des stratégies de détection ont été développées au fil des ans, l&#39;utilisation combinée des réactifs de détection à marquage fluorescent et enzymatiques étapes d&#39;amplification du signal offrent des améliorations significatives dans la sensibilité et la résolution de la procédure 12. Ici, nous décrivons une fluorescence optimisé méthode d&#39;hybridation in situ (FISH) utilisant l&#39;amplification du signal tyramide (TSA) pour visualiser l&#39;expression de l&#39;ARN et la dynamique de localisation des embryons de drosophile mis en scène. La procédure est réalisée en format 96 puits Plaque PCR, ce qui facilite grandement le traitement simultané d&#39;un grand nombre d&#39;échantillons.

Quand elle est réalisée avec succès, cette procédure offre un niveau remarquablement améliorée de détail dans l&#39;analyse spatio-temporelle de l&#39;expression génique et la dynamique de localisation d&#39;ARNm au cours de l&#39;embryogenèse précoce chez la drosophile. En effet, comme illustré sur la figure 3A pour l&#39;avorton gène pair-rule classique (piste), on peut utiliser ce protocole pour observer des événements expression des gènes via la détection d...

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Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Nous décrivons ici un ensemble de montage fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation (FISH) pour la détermination des propriétés d&#39;expression et la localisation des ARN exprimés au cours de l&#39;embryogenèse chez la drosophile,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;.

Toute Mont ARN fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; d&#39;<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

whole-mount-rna-fluorescent-situ-hybridization-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

18.2K vues.  Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM). Nous décrivons ici un ensemble de montage fluorescent In situ Hybridation (FISH) pour la détermination des propriétés d'expression et la localisation des ARN exprimés au cours de l'embryogenèse chez la drosophile, Drosophila melanogaster.

Vidéo: Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Recherche

Biologie

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish entier Mont haute résolution double fluorescent In Situ Hybridation

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Utilisation Mont entier<em&gt; In situ</emHybridation&gt; Lien vers biologie moléculaire et Organismal

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Whole mont In Situ</emHybridation> de E8.5 à E11.5 embryons de souris

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

La détection de l&#39;ARN viral par fluorescence<em&gt; In situ</emHybridation&gt; (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Analyse de la transcription génique unique cellule par l&#39;ARN fluorescent<em&gt; In Situ</emHybridation&gt; (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Timing chromosome Réplication Combiné avec fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

ARN<em&gt; In situ</emHybridation&gt; en embryons entiers de montage et histologie Adapté pour les élasmobranches marins

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Haute Résolution Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans les embryons de poisson zèbre pour étudier l&#39;expression des gènes et la fonction

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Analyse de l&#39;apoptose dans embryons de poissons zèbres par Whole montage immunofluorescence pour détecter caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...