1. Télomères Protocole de longueur 19 <ol><li> isolement de l&#39;ADN </li></ol> La plupart des méthodes d&#39;isolement de l&#39;ADN peuvent être utilisés. Notre laboratoire préfère Kit DNeasy Qiagen (# 69506) pour les sources de sang. Selon l&#39;origine de l&#39;ADN, tels que les sources buccales ou autre, une méthode d&#39;isolement différent peut être utilisé. <ol start="2"><li> Primaires: </li></ol> Toutes les amorces sont diluées à une concentration du stock de 100pmoles/μl dans l&#39;eau PCR grade et conservés à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. Stocks d&#39;exploitation d&#39;amorces sont frais et sont stockés à 20 ° C pendant une courte période de temps (quelques mois). Amorces standards ont été utilisés pour les télomères et β-globine, le SCG, comme décrit dans O&#39;Callaghan et al. 20 . Les séquences des amorces: Telo 1: 5&#39;-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 &#39; Telo 2: 5&#39;-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-CTACC-3 &#39; SCG 1: 5&#39;-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 &#39; SCG 2: 5&#39;-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 &#39; Note: Les amorces sont diluées à une concentration de travail de 10pmoles/μl, avant d&#39;ajouter au mélange réactionnel. <ol start="3"><li> Dilution en série de l&#39;ADN génomique: </li></ol> Dilutions en série de l&#39;ADN génomique pour Telo et seul gène de copie (SCG) sont créés pour générer une courbe de valeur Ct standard pour le dosage. L&#39;ADN génomique utilisé a été extrait à partir de lymphocytes provenant d&#39;échantillons sanguins. Ces dilutions sont créées en diluant l&#39;ADN par PCR de qualité H 2 0 pour chaque concentration par un facteur de 1,68, pour conduire aux deux séries de dilutions en série en utilisant le même ADN génomique. Les concentrations de départ ont été optimisés en fonction de tâtonnements et peuvent avoir besoin d&#39;être ajustée en utilisant différents réactifs, instruments et l&#39;ADN d&#39;autres espèces, les types cellulaires et SCG utilisés. Note: dilution en série en utilisant l&#39;ADN génomique sont fabriqués en mélangeant doucement et attendre au moins 15 minutes à une heure befonouveau prélèvement de l&#39;ADN pour la dilution suivante. Chaque dilution nécessite du temps pour l&#39;ADN génomique de dissocier. Pour le stockage, aliquotes des dilutions en série à long terme en bandes PCR pour le stockage à -80 ° C. Chaque bande PCR est décongelé et utilisé qu&#39;une seule fois pour éviter les cycles de gel-dégel qui peuvent endommager l&#39;ADN. <ol start="4"><li> installation de réaction pour la RT-PCR </li></ol> Instrument utilisé: Roche480 Cycler Light Réactif: Roche Lumière cycleur SYBR-green Diluer les échantillons d&#39;ADN d&#39;essai à une concentration finale de 10 ng / pl. Nous testons concentration en utilisant Nanodrop ou qubit. Nous diluer l&#39;ADN de 10ng/μl à 5ng/μl final. Nous ne testons à nouveau concentration. composants de la réaction: <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> TELO </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td><td fo:width=".25in" rowspan="6"></td><td fo:width="1.5in"> SCG </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td></tr><tr><td> H 2 0 &lt;/ Td&gt; <td> 6 pi </td><td> H20 </td><td> 6 pi </td></tr><tr><td> Telo 1 </td><td> 0,2 pl </td><td> SCG 1 </td><td> 0,6 pl </td></tr><tr><td> Telo 2 </td><td> 1,8 pl </td><td> SCG 2 </td><td> 1,4 pl </td></tr><tr><td> Rxn mélange </td><td> 10 pl </td><td> Rxn mélange </td><td> 10 pl </td></tr><tr><td> ADN ou d&#39;une dilution en série </td><td> 2 pl </td><td> ADN ou d&#39;une dilution en série </td><td> 2 pl </td></tr></tbody></table> Note: Master Mix est faite sans l&#39;ADN et avec un excès de 5% à 10%. Les deux Telo et SCG sont exécutés sur la même plaque en utilisant le programme suivant. Pour tester la précision, au moins trois répétitions de chaque échantillon et de contrôle doit être exécuté. Variations dans les amorces utilisées peuvent affecter les résultats. Notre protocole a été optimisé pour fonctionner comme suit sur le Roche480 Cycler-clair et nos amorces. Endénaturent itial 10 min dénaturent 95 ° C Cyclisme 95 ° C 10 sec attente 60 ° C 5 sec attente 72 ° C 11 sec attente et acquisition unique Répétez de 45 à 55 fois que nécessaire 2. La télomérase détection quantitative (QTD) protocole (Basé sur Kit QTD par Allied Biotech, Inc. No de cat. MT3012) Extrait Préparation <ol><li> Sédimenter les cellules ou les tissus. </li><li> Laver une fois avec PBS 1x. </li><li> Repellet et supprimer 1x PBS. * </li><li> Reprendre le culot cellulaire dans 200 pi de 1 x tampon de lyse pour 10 5 -10 6 cellules ou 40-100 mg de tissu. </li><li> Incuber sur de la glace pendant 30 min. </li><li> Isoler l&#39;échantillon à 12000 g pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Transférer 160 ul du surnageant dans un nouveau tube et déterminer la concentration en protéines. </li><li> Aliquote et rapide geler l&#39;extrait restant sur la glace sèche / éthanol, conserver à -80 ° C. </li></ol> * En tson état de santé, la télomérase dans les cellules ou les tissus congelés est stable pendant au moins un an. Lors de la décongélation à l&#39;emploi, remettre en suspension les cellules immédiatement dans 1 x tampon de lyse. 2.1. Contrôles d&#39;analyse contrôle d&#39;inactivation par la chaleur: Pour chaque échantillon, traiter thermiquement un extrait de commande supplémentaires par incubation à 85 ° C pendant 10 min avant le dosage de l&#39;activité télomérase. Courbe standard de modèle de contrôle TSR: Effectuez PCR quantitative en temps réel en utilisant des dilutions de TSR, un oligonucléotide avec une séquence similaire à amorces télomères fournies avec le kit de générer une courbe standard. <ol><li> Préparer 01:05 dilutions en série de la concentration de TSR boursier (0,5 Amoles / pl) avec le tampon de lyse </li><li> Effectuez le test standard de détection de la télomérase en utilisant 1 ul de chaque dilution de TSR, y compris la concentration des stocks. Ces dilutions peuvent être conservés à 4 ° C pendant au moins 2 semaines. </li></ol> 2.2. Activité télomérase Assayutilisant QTD PCR en temps réel <ol><li> Pour chaque échantillon, ajouter ce qui suit dans un tube PCR ou plaque PCR à paroi mince (volume total 25,0 pi): <ul><li> 12,5 ul de 2 x QTD Premix </li><li> 1,0 ul de cellules ou un extrait de tissu </li><li> 11,5 pi d&#39;eau PCR qualifié </li></ul></li><li> Mélanger soigneusement </li><li> Programme des systèmes de détection par PCR en temps réel selon le programme ci-dessous: - 25 ° C pendant 20 min (réaction de télomérase) - 95 ° C pendant 10 minutes (étape d&#39;activation initiale PCR) 35-40 cycles de: - 95 ° C pendant 30 secondes (dénaturation) - 60 ° C pendant 30 s (recuit) - 72 ° C pendant 30 s (extension) </li><li> Placez tubes PCR dans le thermocycleur et démarrer le programme de cyclisme. </li><li> Recueillir le cycle de seuil ou la valeur C T après la fin des cycles. Le cycle de seuil est le cycle au cours de laquelle une augmentation statistiquement significative de ARn est tout d&#39;abord détecté. </li></ol> 2.3. Analyse des données <ol><li> Generatcourbe standard ch en utilisant les T lectures C et comparer l&#39;activité de la télomérase. </li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La longueur des télomères fournit un marqueur cellulaire unique d&#39;étudier la cellule stressée et vieillissement et offre un aperçu sur les mécanismes du vieillissement. Depuis son rôle dans le vieillissement avait d&#39;abord été suggéré, une multitude d&#39;études ont été faites concernant la longueur des télomères à l&#39;âge, la longévité, la maladie liée à l&#39;âge, les cancers et le stress. Pendant des décennies, l&#39;étalon-or de mesures de la longueur des télomères était l&#39;an...

Les télomères sont des séquences répètent ADN hexamères (TTAGGG) trouvés à l&#39;extrémité des chromosomes. Dans chaque réplication cellulaire, ces extrémités des chromosomes sont raccourcies. S&#39;ils deviennent trop courts, les chromosomes peuvent subir des fusions télomères finaux, recombinaison aberrant, et la dégradation. Ainsi suffisante entretien de la longueur des télomères joue un rôle majeur dans la stabilité des chromosomes et la protection de la cellule 38. Entretien de la longueur des télomères est également crucial pour les gènes trouvés près de l&#39;extrémité des chromosomes, car la réplication de l&#39;ADN ne peut pas continuer jusqu&#39;à la fin de chromosomes 1-2. Par conséquent, la prévention de raccourcissement des télomères peut améliorer la stabilité de la cellule. De nombreuses études ont rapporté que la longueur des télomères est en corrélation avec la longévité de l&#39;organisme et de l&#39;état pathologique, comme dans le cancer 3-4, 5 diabète et les maladies cardiovasculaires 6,7. En outre, les télomères raccourcis ont été associés à un stress excessif ou unmode de vie malsain 8, peut-être en favorisant le vieillissement prématuré des cellules et la mort 9. D&#39;autre part, certaines études ont montré qu&#39;il n&#39;y a pas de différence significative entre la longueur des télomères et la longévité et l&#39;âge liés à la maladie 39, 40, 41. Un des mécanismes innés de la cellule de protection contre le raccourcissement des télomères est en activant son propre enzyme télomérase transcriptase inverse (TERT). Cette enzyme et son unité, la télomérase ARN (TERC), un ARN non codant, utilisez le télomère comme un modèle pour ajouter répète télomères extrémités des chromosomes 10. Bien que l&#39;activité de la télomérase est absent de plusieurs types de cellules et d&#39;autres mécanismes sont impliqués dans le maintien de la longueur des télomères, l&#39;augmentation de l&#39;activité de la télomérase est corrélée à une augmentation de la longueur des télomères. activation de la télomérase a été établi comme l&#39;un des mécanismes par lesquels les cellules répondent aux dommages et le stress et éviter la sénescence prématurée et la mort. Par exemple, plus telomeres ont été démontrées dans une population de juifs ashkénazes avec exceptionnelle durée de vie 11, ont montré des mutations dans TERC ou TERT de contribuer à la maladie mortelle 12, et la régulation épigénétique de la télomérase a été montré pour avoir un effet sur ​​les maladies liées à l&#39;âge 13. Depuis sa découverte, la longueur des télomères a été proposé comme un biomarqueur de l&#39;état de santé dans divers modèles animaux ainsi que chez l&#39;homme, mais ces premières études étaient difficiles à reproduire largement parce que la méthode utilisée était fastidieux, long et coûteux. En 2002 et plus à l&#39;écoute en 2009, Cawthon proposé et fait preuve d&#39;un nouveau protocole, précis, rapide et simple PCR base pour évaluer la longueur des télomères et approfondir son rôle dans divers aspects de la biologie cellulaire, le vieillissement et la maladie 19. Le choix de la méthode de mesure des télomères correct pour une étude est essentielle. Actuellement, il existe diverses méthodes utilisées pour mesurer la longueur des télomères, chacune avec sa propreavantages et des inconvénients. Traditionnellement, la longueur des télomères est mesurée en utilisant une analyse par transfert de Southern de fragments de restriction terminaux (TRF), ce qui implique: a. digestion de l&#39;ADN avec des enzymes de restriction qui ne coupent pas dans les répétitions des télomères afin d&#39;obtenir TRF, b. Southern Blot de ces TRF se fait par la détermination de la durée moyenne de la Fondation à l&#39;aide d&#39;une sonde télomérique 14, 37. Bien que cette méthode est très précise avec un petit coefficient de variation est une mesure directe, et peut être avantageuse pour la mesure de la distribution de la longueur, l&#39;analyse TRF est coûteuse, laborieuse et nécessite au moins 3 pg d&#39;ADN. Cette méthode est également insensible aux télomères courts et la détermination de la longueur peut être confondue par l&#39;ADN subtélomérique, qui peut être détectée par la sonde en raison de la (TTAGGG) n comme séquences qu&#39;elles contiennent 15, 42. Une autre méthode très précise pour mesurer la longueur des télomères est simple télomères Allongement Longueur Analyse (STELA), une single molécule méthode basée sur la PCR qui ne nécessite qu&#39;une petite quantité d&#39;ADN. Dans cette méthode, les amorces sont faits pour reconnaître le G riche en porte à faux à l&#39;extrémité des chromosomes et de se lier à une séquence subtélomérique unique sur un chromosome, qui amplifie le télomère d&#39;un chromosome particulier. L&#39;amplification résultante est alors visualisée par Southern Blot. Cette méthode a l&#39;avantage d&#39;être très précis et est capable de détecter des télomères courts aberrantes 16. Malheureusement, étant donné que tous les chromosomes ont des extrémités riches en G et une séquence subtélomérique utilisable, la longueur des télomères ne peut être mesurée sur les chromosomes spécifiques et ces mesures peuvent ne pas représenter la longueur de l&#39;ensemble des télomères dans la cellule 15. Une autre méthode qui a été pratiquée est l&#39;utilisation d&#39;acide nucléique peptidique (PNA) des sondes pour détecter la longueur des télomères. Fluorescence Quantitative hybridation in situ (Q-FISH) permet de visualiser les télomères pendant la métaphase, où le stAining des télomères avec une sonde PNA en proportion de leur taille permet la comparaison entre des télomères des chromosomes spécifiques. Bien que cette méthode peut également être utilisé pour les cellules en interphase, voici la longueur des télomères des chromosomes distincts ne peut pas être détectée, ce qui introduit une limitation lorsque l&#39;on mesure la longueur des télomères dans les cellules sénescentes ou diviser rarement 17. FISH Flow utilise plutôt la cytométrie de flux et est actuellement la méthode la plus sensible pour mesurer la longueur des télomères des cellules sanguines dans le cadre clinique, mais nécessite des techniciens hautement qualifiés 18. Actuellement, la méthode standard pour mesurer la longueur moyenne des télomères dans notre laboratoire tire profit de la précision, la sensibilité et la facilité de la PCR quantitative en temps réel. Cette méthode a été rendu possible pour mesurer la longueur des télomères par le développement de nouvelles amorces qui permettent d&#39;éviter la synthèse des amorces produits dimères dérivés, qui auraient autrement été produit en tant quetest de tandard en raison de la nature répétitive de télomères. Pour ce test, la mesure de la longueur des télomères est représentée par le rapport T / S, le nombre de répétition de copie des télomères au numéro de gène à copie unique. Comme il existe une relation de proportionnalité directe entre la longueur des télomères et le nombre d&#39;amorces télomères marqué se liant à l&#39;ADN au cours des premiers stades de la PCR, le ratio T / S est directement proportionnelle à la longueur des télomères. Le rapport T / S est mesuré en comparant la différence de Ct, le nombre de cycles fractionnaire à laquelle l&#39;échantillon a accumulé floraison franchit un seuil qui est plusieurs écarts types au-dessus de la fluorescence de base, entre les échantillons avec des amorces télomères et SCG amorces 19. Cette méthode a été critiquée pour sa mesure indirecte de la longueur des télomères, ce qui peut conduire à des erreurs de mesure, par exemple, dans le cas des duplications de chromosomes ou des variations du nombre de copies 15. En outre, la comparaison entre les études est souvent difficult, mais norme oligomères ont été développés pour mesurer la longueur des télomères absolue de 20. Cette méthode a été favorisé amélioré par Cawthon, en utilisant une analyse de qPCR multiplex monochrome. Dans cet essai, le PCR a été effectuée à des températures plus basses pour les premiers cycles d&#39;éviter contraignant dimères d&#39;amorce et le gène de télomère et de contrôle ont été analysés dans le même tube PCR pour éviter de nouvelles erreurs. Les mesures de la longueur des télomères qui en résultent fortement corrélée avec la longueur des télomères mesurée par analyse de transfert de Southern de TRF et a eu une plus grande précision 15, 19, 36. À l&#39;heure actuelle, qRT-PCR est la seule méthode pratique disponible pour tester les échantillons de grande taille et ne nécessite qu&#39;une petite quantité d&#39;ADN à réaliser. Un élément essentiel de cette méthode est des mesures globales de contrôle de qualité, de sorte que quand c&#39;est fait correctement, cette méthode peut fournir des informations comparatives précieuses sur la longueur des télomères. En outre, cette méthode a été adaptée pour une utilisation au-delà de leucocytes pour mesurerla longueur du télomère dans une variété de différents tissus 42. En outre, afin de mieux comprendre la biologie derrière entretien de la longueur des télomères et les interactions entre les deux effets opposés (ie le raccourcissement des télomères lors de la réplication et de l&#39;allongement de l&#39;enzyme télomérase), nous avons accompagné la méthode de la longueur des télomères avec un essai supplémentaire qui mesure l&#39;activité de la télomérase. Pour ce faire, nous avons utilisé un protocole d&#39;amplification de répétition télomérique, un test in vitro. En bref, lysées, préservée, les cellules à activité enzymatique synthétisés répétitions télomériques sur un substrat oligonucléotide en utilisant la télomérase, et les produits ont été amplifiés par PCR en présence de SYBR Green. Les résultats ont ensuite été analysées en comparant les échantillons et contrôle des valeurs seuils ct. Etant donné que la télomérase est une enzyme sensible à la chaleur, traitée commande une chaleur supplémentaire est dirigé à côté de l&#39;échantillon 21. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; En mesurant la longueur des télomères peut fournir des informations précieuses sur le rôle possible de la longueur des télomères dans la physiopathologie du vieillissement et de la maladie, la longueur des télomères n&#39;est pas une propriété statique et plus d&#39;informations sont nécessaires pour comprendre la fonction des télomères. études d&#39;activité de télomérase peuvent ajouter des informations sur les mécanismes de régulation de la longueur des télomères. Par exemple, l&#39;activation contrôlée de la télomérase peut maintenir la longueur du télomère et de la prolifération cellulaire, mais l&#39;activation non contrôlée de la télomérase peut entraîner un cancer. Ces deux méthodes terme peu coûteux et simple combinée nous a fourni non seulement avec des preuves plus solides vers une relation entre la longueur des télomères et la stabilité de la cellule, mais aussi de mieux cerner les mécanismes possibles de raccourcissement des télomères et la récupération. Avec ces méthodes, nous espérons élucider la réponse de la cellule au vieillissement et à divers états de la prolifération cellulaire dans le but ultime d&#39;une meilleure compréhension de la mechanis centralms de la biologie cellulaire.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quantitative Telomerase Detection </td>
 <td>Allied Biotech </td>
 <td>MT3012 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiagen DNeasy Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>69506</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument</td>
 <td>Roche Diagnostics</td>
 <td>4707516</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence

Les télomères sont des séquences répétitives d&#39;ADN à l&#39;extrémité extrémités des chromosomes qui sont diversifiés en longueur et en l&#39;homme peut atteindre une longueur de 15.000 paires de bases. Le télomère est un mécanisme bioprotectrice d&#39;attrition des chromosomes à chaque division cellulaire. À une certaine longueur, les télomères deviennent trop courts pour permettre la réplication, un processus qui peut conduire à une instabilité chromosomique ou la mort cellulaire. La longueur des télomères est régie par deux mécanismes opposés: l&#39;attrition et l&#39;allongement. Attrition se divise comme chaque cellule. En revanche, l&#39;élongation est partiellement modulé par l&#39;enzyme télomérase, qui ajoute des séquences répétitives à l&#39;extrémité des chromosomes. De cette façon, la télomérase pourrait inverser un mécanisme de vieillissement et rajeunit la viabilité cellulaire. Ce sont des éléments cruciaux pour le maintien de la vie cellulaire et sont utilisés pour évaluer le vieillissement cellulaire. Dans ce manuscrit, nous allons décrire un court méthode sophistiquée et pas cher précis, afin d&#39;évaluer la longueur des télomères dans les tissus multiples et des espèces. Ce procédé tire parti de deux éléments principaux, l&#39;unité de répétition en tandem de la séquence de télomère et de la sensibilité de la qRT-PCR pour détecter des nombres de copies différentielles des échantillons testés. En outre, nous allons décrire un test simple pour évaluer l&#39;activité de la télomérase comme un test de la colonne vertébrale complémentaire pour la longueur des télomères.

Un exemple d&#39;un dosage des télomères de longueur qRT-PCR est illustré à la figure 1. Sur le panneau en haut à gauche, les échantillons marqués en rouge et vert représentent l&#39;emplacement des sujets testés sur la plaque de 96 puits. Sur le panneau en haut à droite, la courbe d&#39;amplification est démontrée. Chaque objet est testé par deux essais (télomères et unique copie du gène), qui se fait en triple. En raison de différents nombres de copies d&#39;ADN produites dans les deu...

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Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Une méthode précise, courte, sophistiqué et pas cher est décrit qui évalue la longueur des télomères dans de nombreux tissus et les espèces à l&#39;aide de qRT-PCR. En outre, nous allons décrire un test simple pour évaluer l&#39;activité de la télomérase comme un test de la colonne vertébrale complémentaire pour la longueur des télomères.

La longueur des télomères et de la télomérase activité; Une Yin et Yang de la sénescence cellulaire

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

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In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Recherche

Biologie

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

Suivi de l&#39;activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes aide d&#39;un Degron (dgn)-déstabilisé Green Fluorescent Protein Reporter Protéines (GFP) à base de

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

Mesure de la chimiotaxie cellulaire avec ECIS / Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Dans la migration cellulaire in vitro et Invasion dosages

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Gravité réduite manifestations Environnement matérielles d&#39;un cytomètre de flux et Compagnon microfluidique technologie de mélange prototype miniaturisé

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Corréler spécifique du gène ADN changements méthylation avec l&#39;expression et l&#39;activité transcriptionnelle des astrocytes<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

Applications de la mono-sonde: Mass Spectrometry Imaging et simple Cellule d&#39;analyse dans les conditions ambiantes

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed cellular senescence. Accumulation of senescent cells occurs with organismal aging and through continual culturing in vitro. Senescent cells influence many biological processes, including embryonic development, tissue repair and regeneration, tumor suppression, and aging. Hallmarks of senescent cells include, but are not limited to, increased senescence-associated &#946;-galactosidase activity (SA-&#946;-gal); p16INK4A, p53, and p21 levels; higher levels of DNA damage, including &#947;-H2AX; the formation of Senescence-associated Heterochromatin Foci (SAHF); and the acquisition of a Senescence-associated Secretory Phenotype (SASP), a phenomenon characterized by the secretion of a number of pro-inflammatory cytokines and signaling molecules. Here, we describe protocols for both replicative and DNA damage-induced senescence in cultured cells. In addition, we highlight techniques to monitor the senescent phenotype using several senescence-associated markers, including SA-&#946;-gal, &#947;-H2AX and SAHF staining, and to quantify protein and mRNA levels of cell cycle regulators and SASP factors. These methods can be applied to the assessment of senescence in various models and tissues.

Cellular senescence, the irreversible state of cell-cycle arrest, can be induced by various cellular stresses. Here, we describe protocols to induce cellular senescence and methods to assess markers of senescence.

Techniques pour induire et Quantifier cellulaire sénescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily through modulating protein-protein interactions. Similar to ubiquitin modification, SUMOylation is directed by a sequential enzyme cascade including E1-activating enzyme (SAE1/SAE2), E2-conjugation enzyme (Ubc9), and E3-ligase (i.e., PIAS family, RanBP2, and Pc2). However, different from ubiquitination, an E3 ligase is non-essential for the reaction but does provide precision and efficacy for SUMO conjugation. Proteins modified by SUMOylation can be identified by in vivo assay via immunoprecipitation with substrate-specific antibodies and immunoblotting with SUMO-specific antibodies. However, the demonstration of protein SUMO E3 ligase activity requires in vitro reconstitution of SUMOylation assays using purified enzymes, substrate, and SUMO proteins. Since in the in vitro reactions, usually SAE1/SAE2 and Ubc9, alone are sufficient for SUMO conjugation, enhancement of SUMOylation by a putative E3 ligase is not always easy to detect. Here, we describe a modified in vitro SUMOylation protocol that consistently identifies SUMO modification using an in vitro reconstituted system. A step-by-step protocol to purify catalytically active K-bZIP, a viral SUMO-2/3 E3 ligase, is also presented. The SUMOylation activities of the purified K-bZIP are shown on p53, a well-known target of SUMO. This protocol can not only be employed for elucidating novel SUMO E3 ligases, but also for revealing their SUMO paralog specificity.

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Unlike ubiquitin ligases, few E3 SUMO ligases have been identified. This modified in vitro SUMOylation protocol is able to identify novel SUMO E3 ligases by an in vitro reconstitution assay.

In Vitro Dosage de SUMOylation pour étudier l’activité de Ligase E3 SUMO

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...