1. التيلومير بروتوكول طول 19 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الحمض النووي </li></ol> يمكن استخدام معظم وسائل عزل الحمض النووي. مختبرنا يفضل QIAGEN DNeasy كيت (# 69506) عن مصادر في الدم. اعتمادا على مصدر من الحمض النووي، مثل مصادر الشدق أو غيرها، ويمكن استخدام طريقة العزل المختلفة. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاشعال: </li></ol> مخففة جميع الاشعال إلى تركيز الأسهم من 100pmoles/μl في PCR المياه الصف وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى المطلوبة. مصنوعة مخزونات عمل الاشعال الطازجة ويتم تخزينها عند 20 درجة مئوية لفترة قصيرة من الوقت (بضعة أشهر). استخدمت الاشعال القياسية لالتيلوميرات وβ غلوبين، وSCG، كما هو موضح في أوكاالهان وآخرون. 20 . تسلسل التمهيدي: TELO 1: 5&#39;-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 &#39; TELO 2: 5&#39;-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 &#39; SCG 1: 5&#39;-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 &#39; SCG 2: 5&#39;-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 &#39; ملاحظة: يتم تخفيفه الاشعال إلى تركيز العمل من 10pmoles/μl، قبل إضافة إلى مزيج التفاعل. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخفيف المسلسل من الحمض النووي الجيني: </li></ol> يتم إنشاء التخفيفات المسلسل من الحمض النووي الجيني لTELO واحدة نسخ الجينات (SCG) لإنشاء منحنى قيمة ط م القياسية للمقايسة. تم استخراج الحمض النووي الجيني المستخدمة من الخلايا الليمفاوية من عينات الدم. يتم إنشاء هذه التخفيفات عن طريق تمييع DNA PCR مع الصف H 2 0 إلى كل تركيز من قبل عامل من 1.68 إلى تسفر عن مجموعتين من التخفيفات المتسلسلة باستخدام نفس الحمض النووي الجيني. وقد تم تحسين تركيزات بدءا يعتمد على التجربة والخطأ، وربما تحتاج إلى تعديل عند استخدام الكواشف المختلفة، والصكوك، الحمض النووي من الأنواع الأخرى، أنواع الخلايا، وSCG المستخدمة. ملاحظة: يتم إجراء التخفيف المتسلسل باستخدام الحمض النووي الجيني عن طريق خلط بلطف والانتظار على الأقل 15 دقيقة إلى ساعة واحدة befoإعادة أخذ الحمض النووي لتخفيف المقبل. كل تخفيف يتطلب وقتا لفصل الحمض النووي الجيني ل. للتخزين، قسامة التخفيفات المتسلسلة على المدى الطويل إلى شرائح PCR للتخزين في -80 درجة مئوية. يتم إذابة كل قطاع PCR وتستخدم مرة واحدة لتجنب ذوبان تجميد دورات التي قد تؤدي إلى تلف الحمض النووي. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد رد فعل لRT-PCR </li></ol> الأداة المستخدمة: Roche480 ضوء Cycler الكاشف: روش ضوء cycler SYBR الخضراء تمييع عينات من الحمض النووي اختبار لتركيز النهائي من 10 نانوغرام / ميكرولتر. نحن اختبار تركيز باستخدام معمل NanoDrop أو و qubit. نحن تمييع مزيد من الحمض النووي من 10ng/μl إلى 5ng/μl النهائي. نحن لا اختبار تركيز مرة أخرى. مكونات التفاعل: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> TELO </td><td fo:width="1.5in"> 1X </td><td fo:width=".25in" rowspan="6"></td><td fo:width="1.5in"> SCG </td><td fo:width="1.5in"> 1X </td></tr><tr><td> H 2 0 &lt;/ TD&gt; <td> 6 ميكرولتر </td><td> H20 </td><td> 6 ميكرولتر </td></tr><tr><td> TELO 1 </td><td> 0.2 ميكرولتر </td><td> SCG 1 </td><td> 0.6 ميكرولتر </td></tr><tr><td> TELO 2 </td><td> 1.8 ميكرولتر </td><td> SCG 2 </td><td> 1.4 ميكرولتر </td></tr><tr><td> RXN مزيج </td><td> 10 ميكرولتر </td><td> RXN مزيج </td><td> 10 ميكرولتر </td></tr><tr><td> الحمض النووي أو التخفيف المتسلسل </td><td> 2 ميكرولتر </td><td> الحمض النووي أو التخفيف المتسلسل </td><td> 2 ميكرولتر </td></tr></tbody></table> ملاحظة: يرصد ماستر مزيج من دون الحمض النووي ومع وجود فائض من 5٪ إلى 10٪. يتم تشغيل كلا TELO وSCG معا على نفس لوحة باستخدام البرنامج التالي. لاختبار دقة، على الأقل ثلاث مكررات من كل عينة ويجب تشغيل التحكم. الاختلافات في الاشعال المستخدمة قد يؤثر على النتائج. وقد تم تحسين بروتوكول لدينا للعمل على النحو التالي على Roche480 ضوء Cycler والاشعال لدينا. فيتفسد itial 10 دقيقة تفسد 95 ° C ركوب الدراجات 95 ° C 10 عقد ثوانى 60 ° C 5 ثوانى الانتظار 72 ° C 11 ثوانى الانتظار واقتناء واحد تكرار 45-55 مرات كما هو مطلوب 2. كشف تيلوميراز الكمي (QTD) بروتوكول (بناء على عدة QTD من قبل الحلفاء في مجال التكنولوجيا الحيوية، وشركة كات. رقم MT3012) استخراج التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا أو الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرة واحدة مع 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Repellet وإزالة 1X PBS. * </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه الخلية في 200 ميكرولتر من 1 × الاحتياطي تحلل لكل 10 5 -10 6 خلايا أو 40-100 ملغ من الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار العينة في 12،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 160 ميكرولتر من طاف في أنبوب جديد وتحديد تركيز البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة وسريعة تجميد استخراج المتبقية على الثلج الجاف / الإيثانول، مخزن في -80 درجة مئوية. </li></ol> * في رحالته، تيلوميراز في الخلايا أو الأنسجة المجمدة ثابت لمدة سنة على الأقل. عندما إذابة للاستخدام، resuspend الخلايا مباشرة في 1 × الاحتياطي تحلل. 2.1. تحكم مقايسة التحكم تعطيل الحرارة: لكل عينة، تسخين علاج مستخرج تحكم إضافية التي يحتضنها في 85 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة قبل تيلوميراز فحص النشاط. منحنى القياسية لقالب التحكم TSR: إجراء الكمي في الوقت الحقيقي PCR باستخدام التخفيفات من TSR، وهو قليل النوكليوتيد مع تسلسل مماثلة لالاشعال التيلومير المتضمنة عدة لتوليد منحنى القياسية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1:05 التخفيفات التسلسلي للتركيز TSR الأسهم (0.5 amoles / ميكرولتر) مع العازلة تحلل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء كشف فحص مستوى تيلوميراز باستخدام 1 ميكرولتر من كل تخفيف TSR، بما في ذلك تركيز الأسهم. ويمكن تخزين هذه التخفيفات في 4 درجة مئوية لمدة 2 أسابيع على الأقل. </li></ol> 2.2. تيلوميراز نشاط الفحصباستخدام QTD في الوقت الحقيقي PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة، إضافة ما يلي إلى أنبوب PCR أو رقيقة الجدار لوحة PCR (إجمالي حجم 25.0 ميكرولتر): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12.5 ميكرولتر من 2 بريمكس QTD X </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.0 ميكرولتر من الخلايا أو الأنسجة استخراج </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 11.5 ميكرولتر من PCR المياه مؤهل </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلط جيدا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج في الوقت الحقيقي أنظمة كشف PCR وفقا للبرنامج التالي: - 25 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة (رد فعل تيلوميراز) - 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (PCR خطوة التنشيط الأولي) 35-40 دورات: - 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (تمسخ) - 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (الصلب) - 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (ملحق) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب PCR في cycler الحرارية وبدء برنامج ركوب الدراجات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع دورة عتبة أو C T قيمة بعد الانتهاء من الدورات. دورة عتبة هو دورة في التي تم الكشف عنها زيادة ذات دلالة إحصائية من ΔRn الأول. </li></ol> 2.3. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Generatعصام منحنى قياسي باستخدام T قراءات C والمقارنة النشاط تيلوميراز. </li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

يوفر طول التيلومير علامة الخلوية فريدة لدراسة الخلية وشدد والشيخوخة، ويقدم نظرة ثاقبة لآليات الشيخوخة. منذ دورها في الشيخوخة قد اقترح أولا، وقد تم القيام به العديد من الدراسات المتعلقة طول التيلومير إلى العمر، طول العمر، الأمراض المرتبطة بالعمر، وأمراض السرطان، و?...

التيلوميرات يتم تكرار الحمض النووي مسدوس (TTAGGG) متواليات وجدت في نهايات الكروموسومات. في كل النسخ المتماثل الخلية، يتم تقصير هذه الغايات كروموسوم. إذا أصبحت قصيرة جدا، يمكن الخضوع لاندماج الكروموسومات التيلومير نهاية، إعادة التركيب الشاذة، وتدهور. وهكذا يكفي صيانة طول التيلومير تلعب دورا رئيسيا في استقرار كروموسوم وحماية الخلية 38. صيانة طول التيلومير هو أيضا حاسمة لجينات عثر عليها بالقرب من نهايات الكروموسومات، منذ تكرار الحمض النووي لا يمكن أن يستمر إلى نهاية جدا من الكروموسومات 1-2. ونتيجة لذلك، قد منع تقصير التيلومير تحسين الاستقرار الخلية. وأفادت العديد من الدراسات أن طول التيلومير ويرتبط مع طول العمر للكائن والدولة المريضة، كما هو الحال في سرطان 3-4، مرض السكري 5، وأمراض القلب والأوعية الدموية 6،7. بالإضافة إلى ذلك، وقد ارتبطت التيلوميرات تقصر مع الإجهاد المفرط أونمط الحياة غير الصحي 8، ربما عن طريق تعزيز الشيخوخة المبكرة للخلايا وفاة 9. من ناحية أخرى، وقد وجدت بعض الدراسات أنه لا يوجد اختلاف كبير بين طول التيلومير وطول العمر والسن الأمراض ذات الصلة 39، 40، 41. واحدة من الآليات الفطرية للخلية حماية من تقصير التيلومير هو عن طريق تفعيل الإنزيم تيلوميراز الخاصة الناسخ العكسي (TERT). هذا الانزيم والوحيدات لها، التيلوميراز الحمض النووي الريبي (TERC)، وهو الحمض النووي الريبي غير الترميز، استخدم التيلومير كقالب لإضافة يكرر التيلومير إلى كروموسوم ينتهي 10. على الرغم من أن النشاط تيلوميراز غائب من عدة أنواع من الخلايا وغيرها من الآليات التي تشارك في صيانة طول التيلومير، ويرتبط زيادة النشاط تيلوميراز مع زيادة طول التيلومير. وقد أنشئت تفعيل تيلوميراز باعتبارها واحدة من الآليات التي تستجيب الخلايا للتلف والتوتر وتجنب الشيخوخة المبكرة والموت. على سبيل المثال، تعد الشركة المصرية للاتصالاتوقد أثبتت lomeres في عدد سكانها اليهود الأشكناز مع استثنائية العمر 11، وقد تبين أن الطفرات في TERC أو TERT لتساهم في الإصابة بأمراض مميتة 12، وتنظيم جينية من تيلوميراز وقد تبين أن يكون لها تأثير على الأمراض ذات الصلة سن ال 13. منذ اكتشافه، وقد اقترح طول التيلومير والعلامات البيولوجية للحالة الصحية في مختلف النماذج الحيوانية، وكذلك في البشر، ولكن هذه الدراسات في وقت مبكر الصعب تكرار على نطاق واسع بسبب الطريقة المستخدمة كانت شاقة وطويلة ومكلفة. في عام 2002 ومواصلة ضبطها في عام 2009، اقترح Cawthon وأظهرت ودقيقة بروتوكول جديد وسريع وبسيط PCR مقرها لتقييم طول التيلومير ومواصلة التحقيق دورها في مختلف جوانب بيولوجيا الخلية، والشيخوخة والمرض 19. اختيار طريقة القياس الصحيح التيلومير لدراسة أمر ضروري. حاليا، هناك العديد من الأساليب المستخدمة لقياس طول التيلومير، كل مع تلقاء نفسهامزايا وعيوب. تقليديا، يتم قياس طول التيلومير باستخدام تحليل لطخة الجنوبية من شظايا تقييد محطة (TRFs)، الذي ينطوي على: أ. هضم الحمض النووي مع إنزيمات التقييد أن لا قطع في تكرار التيلومير من أجل الحصول على TRFs، ب. ويتم ذلك وصمة عار الجنوبي من هذه TRFs عن طريق تحديد طول TRF يعني باستخدام مسبار telomeric 14، 37. على الرغم من أن هذا الأسلوب هو درجة عالية من الدقة مع معامل صغيرة من الاختلاف، هو مقياس مباشر، ويمكن أن تكون مفيدة لقياس توزيع طول، تحليل TRF هو أمر مكلف، ويتطلب عمالة كثيفة لا يقل عن 3 ميكروغرام من الحمض النووي. هذا الأسلوب هو أيضا حساسة للالتيلوميرات قصيرة والتصميم يمكن أن يكون طول مرتبك بواسطة الحمض النووي subtelomeric، والتي يمكن الكشف عنها بواسطة لجنة التحقيق بسبب هذا (TTAGGG) ن مثل متواليات أنها تحتوي على 15، 42. آخر طريقة دقيقة للغاية في قياس طول التيلومير واحد التيلومير الاستطالة تحليل طول (STELA)، وهو سينغله جزيء PCR الأسلوب على أساس أن يتطلب سوى كمية صغيرة من الحمض النووي. في هذه الطريقة، يتم إجراء الاشعال الاعتراف عبء G الغنية في نهاية الصبغيات (الكروموسومات) وربط تسلسل subtelomeric فريدة من نوعها على كروموسوم واحد، مما يزيد من التيلومير كروموسوم معين. التضخيم الناتج ثم تصور من قبل جنوب لطخة. هذا الأسلوب له ميزة كونها دقيقة للغاية وغير قادرة على الكشف التيلوميرات قصيرة النموذجية 16. للأسف، منذ ليس كل الكروموسومات يكون إنتهاء G الغنية وتسلسل subtelomeric صالحة للاستعمال، لا يمكن إلا أن يقاس طول التيلومير على الكروموسومات محددة، وربما لا تمثل هذه القياسات طول التيلوميرات في كل خلية 15. طريقة أخرى التي مورست هو استخدام حمض النووي الببتيد (PNA) تحقيقات للكشف عن طول التيلومير. التنوير الكمي في الموقع التهجين (Q-FISH) يتيح لنا أن تصور التيلوميرات خلال الطورية، حيث القديسaining من التيلوميرات مع التحقيق الذي تجريه السلطة الوطنية الفلسطينية بما يتناسب مع حجمها يسمح للمقارنة بين التيلوميرات الكروموسومات محددة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن تستخدم أيضا للخلايا في الطور البيني، وهنا طول التيلومير لالكروموسومات واضحة لا يمكن الكشف، الأمر الذي يضفي وجود قيود عند قياس طول التيلومير في خلايا هرمة أو تقسيم نادرا 17. FISH تدفق بدلا من ذلك يستخدم التدفق الخلوي ويشغل حاليا منصب الأسلوب الأكثر حساسية لقياس طول التيلومير من خلايا الدم في إعداد سريرية، ولكن يتطلب الفنيين ذوي المهارات العالية 18. حاليا، الطريقة المعيارية لقياس متوسط ​​طول التيلومير في المختبر لدينا يستفيد من الدقة والحساسية، وسهولة الكمية في الوقت الحقيقي PCR. وقدم هذه الطريقة ممكنة لقياس طول التيلومير من خلال تطوير الاشعال الرواية التي تجنب تركيب التمهيدي المنتجات ديمر المشتقة، والتي كانت على خلاف ذلك كما تم إنتاجها فيمقايسة نظرا لطبيعة تكرار التيلوميرات tandard. لهذا الاختبار، يتم تمثيل قياس طول التيلومير من قبل T / S نسبة، التيلومير في عدد النسخ تكرار لعدد الجينات نسخة واحدة. لأنه ليس هناك علاقة طردية مباشرة بين طول التيلومير وعدد من المشارع التيلومير المسمى ملزم على الحمض النووي خلال المراحل الأولى من PCR، نسبة T / S يتناسب طرديا مع طول التيلومير. يتم قياس نسبة T / S بمقارنة الفرق في التصوير المقطعي، وعدد دورة كسري الذي المتراكم العينة الإزهار يعبر عتبة هذا هو عدة انحرافات معيارية فوق الإزهار خط الأساس، بين العينات مع الاشعال التيلومير وSCG الاشعال 19. وقد انتقدت هذه الطريقة لقياس غير المباشرة من طول شريط الحامض النووي، الذي يمكن أن يؤدي إلى قياسات غير دقيقة، على سبيل المثال، في حالة من الازدواجية كروموسوم أو الاختلافات في عدد النسخ 15. أيضا، المقارنة بين الدراسات في كثير من الأحيان ديوقد وضعت fficult، ولكن معيار الأوليغومرات لقياس طول التيلومير المطلقة 20. وقد تم تعزيز هذه الطريقة تحسن عليها Cawthon، وذلك باستخدام أحادية اللون متعددة مقايسة QPCR. في هذا الاختبار، تم تشغيل PCR في درجات حرارة منخفضة للدورات القليلة الأولى لتجنب ملزم التمهيدي-ديمر وتم تحليل التيلومير والتحكم الجيني في نفس أنبوب PCR لمزيد من تجنب الخطأ. الناتجة قياسات طول التيلومير مرتبطة ارتباطا قويا مع طول التيلومير تقاس تحليل لطخة الجنوبية من TRFs وكان أعلى دقة 15 و 19 و 36. في هذه اللحظة، QRT-PCR هو الأسلوب الوحيد المتاح مريحة لاختبار أحجام عينة كبيرة ويتطلب سوى كمية صغيرة من الحمض النووي للقيام بها. جزء حاسم من هذا الأسلوب هو اتخاذ تدابير شاملة لمراقبة الجودة، بحيث عندما يكون القيام به بشكل صحيح، وهذه الطريقة يمكن أن توفر معلومات مقارنة قيمة عن طول التيلومير. بالإضافة إلى ذلك، قد تم تكييف هذه الطريقة للاستخدام خارج الكريات البيض لقياس<html> طول التيلومير في مجموعة متنوعة من الأنسجة المختلفة 42. بالإضافة إلى ذلك، من أجل مزيد من فهم البيولوجيا وراء صيانة طول التيلومير والتفاعلات بين اثنين من آثار معارضة (أي تقصير التيلومير أثناء النسخ المتماثل واستطالة بواسطة انزيم تيلوميراز)، ونحن رافق طريقة طول التيلومير مع فحص إضافي الذي يقيس النشاط تيلوميراز. لهذا الغرض، استخدمنا Telomeric بروتوكول التضخيم كرر، وهو فحص في المختبر. لفترة وجيزة، هي lysed، والحفاظ عليها، وخلايا نشطة إنزيمي توليفها يكرر telomeric على ركيزة قليل النوكليوتيد باستخدام تيلوميراز، وتم تضخيم PCR المنتجات التي تستخدم في وجود SYBR الأخضر. ثم تم تحليل النتائج من خلال مقارنة العينة وسيطرة القيم عتبة ط. منذ تيلوميراز هو انزيم حساسة للحرارة، يتم تشغيل حرارة إضافية تعامل التحكم جنبا إلى جنب مع كل عينة 21. هناك حاجة إلى &quot;jove_content&quot;&gt; بينما قياس طول التيلومير يمكن أن توفر معلومات قيمة حول الدور الذي يمكن أن طول التيلومير في الفيزيولوجيا المرضية من الشيخوخة والمرض، وطول التيلومير هو ليس خاصية ثابتة ومزيد من المعلومات لفهم وظيفة التيلومير. يمكن أن دراسات النشاط تيلوميراز إضافة معلومات حول آليات تنظيم طول التيلومير. على سبيل المثال، يمكن تفعيل رقابة من تيلوميراز الحفاظ على طول التيلومير وتكاثر الخلايا، ولكن التنشيط غير المنضبط للتيلوميراز يمكن أن يؤدي إلى السرطان. هذه الأساليب إلى الأمام مباشرة وغير مكلفة والجمع بين اثنين وفرت لنا ليس فقط مع أدلة أقوى نحو علاقة بين طول التيلومير والاستقرار الخلية، ولكن أيضا مزيد من التبصر في الآليات الممكنة من تقصير التيلومير والانتعاش. مع هذه الأساليب ونأمل في مزيد من توضيح استجابة الخلية إلى الشيخوخة ومختلف الدول من انتشار الخلايا مع الهدف النهائي المتمثل في التوصل إلى فهم أفضل للوسط mechanisMS بيولوجيا الخلية.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quantitative Telomerase Detection </td>
 <td>Allied Biotech </td>
 <td>MT3012 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiagen DNeasy Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>69506</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument</td>
 <td>Roche Diagnostics</td>
 <td>4707516</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence

التيلوميرات يتم تكرار تسلسل الحمض النووي في الطرف ينتهي من الكروموسومات التي هي متنوعة في الطول والبشر يمكن أن تصل إلى طول 15،000 أزواج قاعدة. التيلومير بمثابة آلية السلامة البيولوجية الاستنزاف كروموسوم في كل انقسام الخلايا. في مدة معينة، تصبح التيلوميرات قصيرة جدا للسماح النسخ المتماثل، وهي العملية التي قد تؤدي إلى عدم الاستقرار كروموسوم أو موت الخلية. وينظم طول التيلومير من قبل اثنين من آليات معارضة: الاستنزاف واستطالة. يحدث الاستنزاف كما يقسم كل خلية. في المقابل، هو استطالة التضمين جزئيا من قبل التيلوميراز الانزيم، الذي يضيف تسلسل تكرار لنهايات الكروموسومات. في هذه الطريقة، يمكن تيلوميراز ربما عكس آلية الشيخوخة ويجدد بقاء الخلية. وهذه هي عناصر حاسمة في الحفاظ على حياة الخلية وتستخدم لتقييم الشيخوخة الخلوية. في هذه المخطوطة سنقوم بشرح طريقة دقيقة، قصيرة ومتطورة ورخيصة لتقييم طول التيلومير في أنسجة متعددةق والأنواع. هذا الأسلوب يستفيد من عنصرين رئيسيين، وتكرار جنبا إلى جنب من تسلسل التيلومير وحساسية QRT-PCR للكشف عن أرقام نسخة التفاضلية للعينات التي تم اختبارها. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا سوف تصف فحص بسيط لتقييم النشاط تيلوميراز كاختبار العمود الفقري مكملة لطول التيلومير.

ويرد مثال على طول التيلومير QRT-PCR مقايسة في الشكل 1. على لوحة أعلى اليسار، وعينات صفت باللون الأحمر والأخضر يمثل الموقع من الموضوعات اختبارها على لوحة 96 جيدا. على لوحة أعلى اليمين، ويتجلى منحنى التضخيم. يتم اختبار كل مادة من قبل اثنين من المقايسات (التيلومير و?...

Watch this Scientific Journal Video about Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence at JoVE.com

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

يوصف أسلوبا دقيقا، قصيرة ومتطورة ورخيصة أن يقيم طول التيلومير في الأنسجة والأنواع باستخدام QRT-PCR متعددة. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا سوف تصف فحص بسيط لتقييم النشاط تيلوميراز كاختبار العمود الفقري مكملة لطول التيلومير.

التيلومير طول ونشاط تيلوميراز؛ A الين واليانغ من الشيخوخة الخلية

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

telomere-length-telomerase-activity-yin-yang-cell

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biology

Unit 1

DNA Replication

SCIENTISTS IN ACTION

46.3K Views.  Albert Einstein College of Medicine. يوصف أسلوبا دقيقا، قصيرة ومتطورة ورخيصة أن يقيم طول التيلومير في الأنسجة والأنواع باستخدام QRT-PCR متعددة. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا سوف تصف فحص بسيط لتقييم النشاط تيلوميراز كاختبار العمود الفقري مكملة لطول التيلومير.

Video: Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

رصد اليوبيكويتين-proteasome نشاط في الخلايا الحية باستخدام Degron (DGN)-زعزعة استقرار الأخضر نيون البروتين البروتين مراسل (GFP) على أساس

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

قياس من الانجذاب الكيميائي الخلوي مع ECIS / سيارات الأجرة

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

في المختبر الهجرة الخليوي والغزو فحوصات

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

انخفاض الجاذبية المظاهرات الأجهزة البيئة في نموذج المنمنمة تدفق عداد الكريات ورفيق ميكروفلويديك تقنية خلط

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

ربط الجينات المحددة الحامض النووي التغييرات مع التعبير والترانسكربتي آخر من نجمي<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

تطبيقات أحادية التحقيق: وسائل التصوير الطيفي والتحليل خلية واحدة في ظل الظروف المحيطة

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species' diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

تشريح وشقة-تصاعد للThreespine أبو شوكة الخيشومي الهيكل العظمي

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed cellular senescence. Accumulation of senescent cells occurs with organismal aging and through continual culturing in vitro. Senescent cells influence many biological processes, including embryonic development, tissue repair and regeneration, tumor suppression, and aging. Hallmarks of senescent cells include, but are not limited to, increased senescence-associated &#946;-galactosidase activity (SA-&#946;-gal); p16INK4A, p53, and p21 levels; higher levels of DNA damage, including &#947;-H2AX; the formation of Senescence-associated Heterochromatin Foci (SAHF); and the acquisition of a Senescence-associated Secretory Phenotype (SASP), a phenomenon characterized by the secretion of a number of pro-inflammatory cytokines and signaling molecules. Here, we describe protocols for both replicative and DNA damage-induced senescence in cultured cells. In addition, we highlight techniques to monitor the senescent phenotype using several senescence-associated markers, including SA-&#946;-gal, &#947;-H2AX and SAHF staining, and to quantify protein and mRNA levels of cell cycle regulators and SASP factors. These methods can be applied to the assessment of senescence in various models and tissues.

Cellular senescence, the irreversible state of cell-cycle arrest, can be induced by various cellular stresses. Here, we describe protocols to induce cellular senescence and methods to assess markers of senescence.

تقنيات للحث وتحديد الخلوي الشيخوخة

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...