1. Comprimento dos telômeros Protocolo n º 19 <ol><li> O isolamento do DNA </li></ol> Pode ser utilizado A maioria dos métodos de isolamento do ADN. Nosso Lab prefere Qiagen DNeasy Kit (# 69506) para as fontes de sangue. Dependendo da fonte de ADN, tais como fontes de bucais ou outro, um método de isolamento diferentes podem ser utilizados. <ol start="2"><li> Iniciadores: </li></ol> Todos os iniciadores são diluídas até uma concentração de caldo de 100pmoles/μl em água grau de PCR e armazenadas a -20 ° C até ser necessário. Stocks de trabalho dos iniciadores são feitas novas e são armazenadas a 20 ° C durante um curto período de tempo (de alguns meses.) Iniciadores dos padrões foram usados ​​para os telómeros e β-globina, a SCG, tal como descrito no O&#39;Callaghan et ai 20. . Seqüências de primers: Telo 1: 5&#39;-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 &#39; Telo 2: 5&#39;-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 &#39; SCG 1: 5&#39;-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 &#39; SCG 2: 5&#39;-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3? Nota: Os iniciadores são diluídas até uma concentração de trabalho de 10pmoles/μl, antes de se adicionar à mistura de reacção. <ol start="3"><li> Diluição seriada do DNA genômico: </li></ol> Diluições em série de ADN genómico e para Telo único gene de cópia (SCG) são criados para gerar uma curva padrão para o valor Ct do ensaio. O ADN genómico foi utilizado extraída a partir de linfócitos a partir de amostras de sangue. Estas diluições são criados através da diluição de ADN por PCR grau de H 2 0 a cada concentração por um factor de 1,68 para se obter os dois conjuntos de diluições em série usando o mesmo DNA genómico. As concentrações iniciais foram optimizadas com base em experimentação e erro e pode precisar de ser ajustada quando se utiliza reagentes diferentes, instrumentos de ADN a partir de outras espécies, tipos de células, e SCG utilizados. Nota: Diluição em série utilizando ADN genómico são feitos misturando suavemente e esperando pelo menos 15 minutos a uma hora before tendo o ADN para o próximo diluição. Cada diluição requer tempo para o DNA genómico de dissociar. Para o armazenamento, alíquotas de diluições em série de longo prazo em tiras de PCR para o armazenamento a -80 ° C. Cada tira de PCR é descongelado e usado uma vez para evitar ciclos de descongelamento congelamento, que podem danificar o DNA. <ol start="4"><li> Reacção custos para RT-PCR </li></ol> Instrumento utilizado: Roche480 Luz Cycler Reagente: Roche Luz termociclador SYBR-green Diluir as amostras de ADN de teste a uma concentração final de 10 ng / ul. Testamos concentração usando Nanodrop ou Qubit. Nós diluir o ADN para 10ng/μl 5ng/μl final. Nós não testar a concentração novamente. Componentes da reação: <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> TELO </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td><td fo:width=".25in" rowspan="6"></td><td fo:width="1.5in"> SCG </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td></tr><tr><td> H 2 0 &lt;/ Td&gt; <td> 6 mL </td><td> H20 </td><td> 6 mL </td></tr><tr><td> Telo 1 </td><td> 0,2 mL </td><td> SCG 1 </td><td> 0,6 mL </td></tr><tr><td> Telo 2 </td><td> 1,8 mL </td><td> SCG 2 </td><td> 1,4 mL </td></tr><tr><td> Rxn mix </td><td> 10 ul </td><td> Rxn mix </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> DNA ou diluição em série </td><td> 2 ul </td><td> DNA ou diluição em série </td><td> 2 ul </td></tr></tbody></table> Nota: Master Mix é feita sem o ADN e com um excesso de 5% a 10%. Ambos Telo e SCG são executados juntos na mesma placa com o seguinte programa. Para testar a precisão, no mínimo, três repetições de cada amostra e controle deve ser executado. As variações nos iniciadores utilizados podem afectar os resultados. Nosso protocolo foi otimizado para funcionar da seguinte forma no Roche480 Luz Cycler e nossos primers. Emdesnaturam mador inicial 10 min 95 ° C desnatura Ciclismo 95 ° C 10 seg preensão 60 ° C, 5 segundos preensão 72 ° C 11 seg espera e única aquisição Repita 45 a 55 vezes, conforme necessário 2. Quantitativa telomerase Detection (QTD) Protocol (Baseado no Kit QTD por Allied Biotech, Inc. gato. Não. MT3012) Extrato de Preparação <ol><li> Pellet células ou tecidos. </li><li> Lavar uma vez com PBS 1x. </li><li> Repellet e remove 1x PBS. * </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 200 uL de 1 x tampão de lise por cada 10 5 -10 6 células ou 40-100 mg de tecido. </li><li> Incubar no gelo por 30 min. </li><li> Girar a amostra a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Transferir 160 jil de sobrenadante para um tubo fresco e determinar a concentração de proteína. </li><li> Alíquota e rápido congelar o extrato restante em gelo seco / etanol, armazenar a -80 ° C. </li></ol> * Em ta sua condição, a telomerase em células ou tecidos congelados é estável durante pelo menos um ano. Quando descongelado para uso, ressuspender as células imediatamente em 1 x Tampão de Lise. 2.1. Controles de ensaio Controle de inactivação pelo calor: Para cada amostra, o tratamento térmico de um extracto de controlo adicional por incubação a 85 ° C durante 10 minutos antes do ensaio de actividade da telomerase. Curva padrão para o modelo de controlo TSR: Executar PCR quantitativo em tempo real usando diluições de ATR, um oligonucleótido com uma sequência semelhante à iniciadores telomere incluídas no kit para gerar uma curva padrão. <ol><li> Prepare 01:05 diluições da concentração TSR estoque (0,5 Amoles / l) com tampão de lise </li><li> Realizar o ensaio padrão de detecção da telomerase usando 1 fil de cada diluição TSR, incluindo a concentração de estoque. Essas diluições podem ser armazenados a 4 ° C durante pelo menos 2 semanas. </li></ol> 2.2. Ensaio da Actividade da Telomeraseusando QTD Real-Time PCR <ol><li> Para cada amostra, adicione o seguinte a um tubo de PCR ou de parede fina placa de PCR (volume total de 25,0 mL): <ul><li> 12,5 ul de 2 x Premix QTD </li><li> 1,0 ml de celular ou Extrato Tissue </li><li> 11,5 ul de água PCR Qualificado </li></ul></li><li> Misturar bem </li><li> Programa de PCR em Tempo Real Sistemas de Detecção de acordo com o programa abaixo: - 25 ° C durante 20 minutos (reacção da telomerase) - 95 ° C durante 10 min (passo de activação inicial de PCR) 35-40 ciclos de: - 95 ° C durante 30 seg (desnaturação) - 60 ° C durante 30 segundos (emparelhamento) - 72 ° C durante 30 seg (extensão) </li><li> Coloque tubos PCR no termociclador e iniciar o programa de ciclismo. </li><li> Recolher o ciclo limiar ou C valor T após ciclos de acabamento. O ciclo de limiar é o ciclo no qual é detectada pela primeira vez um aumento estatisticamente significativo de ΔRn. </li></ol> 2.3. Análise de Dados <ol><li> Generatcurva padrão ea utilizar as leituras C T e comparar a atividade telomerase. </li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Comprimento Telômero proporciona um marcador celular única para o estudo da célula esforçado e envelhecimento e oferece perspectivas sobre os mecanismos de envelhecimento. Desde o seu papel no envelhecimento primeira tinha sido sugerido, uma infinidade de estudos têm sido feitos relativos comprimento dos telômeros de idade, longevidade, doenças relacionadas com a idade, câncer e estresse. Durante décadas, o padrão ouro de medidas de comprimento dos telômeros foi a análise de fragmentos de restrição do term...

Os telômeros são repetitivas de DNA hexâmeros (TTAGGG) seqüências encontradas nas extremidades dos cromossomos. Em cada replicação celular, essas extremidades dos cromossomas são encurtados. Se eles se tornam muito curtos, os cromossomos podem sofrer fusão telômero finais, recombinação aberrante e degradação. Assim manutenção comprimento dos telômeros suficiente desempenha um papel importante na estabilidade dos cromossomas e proteção da célula 38. Manutenção comprimento do telômero também é crucial para genes encontrados perto das extremidades dos cromossomos, uma vez que a replicação do DNA não pode continuar até o fim de cromossomos 1-2. Consequentemente, a prevenção do encurtamento dos telômeros pode melhorar a estabilidade da pilha. Numerosos estudos têm avaliado que o comprimento dos telómeros está correlacionada com a longevidade de um organismo e estado de doença, tais como cancro, em 3-4, 5 a diabetes, doença cardiovascular e 6,7. Além disso, os telómeros encurtados têm sido associados com o stress excessivo ouestilo de vida saudável 8, talvez, promovendo o envelhecimento prematuro e morte celular 9. Por outro lado, alguns estudos demonstraram que não há diferença significativa entre o comprimento dos telômeros e longevidade e doenças relacionadas com idade 39, 40, 41. Um dos mecanismos inatos da célula de proteção de encurtamento dos telômeros está ativando sua própria enzima telomerase transcriptase reversa (TERC). Esta enzima e sua subunidade, o RNA da telomerase (TERC), um RNA não-codificante, utilizar o telómero como um molde para adicionar repete telomere para as extremidades do cromossoma 10. Embora a atividade telomerase está ausente de vários tipos de células e outros mecanismos estão envolvidos na manutenção do comprimento dos telômeros, o aumento da atividade da telomerase está correlacionada com o aumento do comprimento dos telômeros. Activação de telomerase foi estabelecido como um dos mecanismos pelos quais as células respondem a danos e stress e senescência prematura e evitar a morte. Por exemplo, mais de telomeres foram demonstrados em uma população de judeus Ashkenazi com uma excepcional duração 11, as mutações em TERC ou terc foram mostrados para contribuir para a doença fatal, 12, e regulação epigenética da telomerase foi demonstrado ter um efeito sobre a doença relacionada com a idade 13. Desde a sua descoberta, o comprimento dos telómeros foi proposto como um biomarcador para o estado de saúde em diversos modelos animais, bem como em seres humanos, mas estes primeiros estudos foram difíceis de replicar amplamente porque o método utilizado foi tedioso, longo e dispendioso. Em 2002 e mais sintonizado em 2009, Cawthon propôs e demonstrou um novo protocolo preciso, rápido e simples PCR baseado para avaliar o comprimento dos telômeros e investigar o seu papel em vários aspectos da biologia celular, envelhecimento e doença 19. Escolher o método de medição dos telômeros correto para um estudo é essencial. Atualmente, existem vários métodos usados ​​para medir o comprimento dos telômeros, cada um com o seu própriovantagens e desvantagens. Tradicionalmente, o comprimento dos telómeros é medido utilizando a análise de Southern Blot de fragmentos de restrição terminal (TRF), que envolve: a. digerir o ADN com enzimas de restrição que não cortam no repete telomere, a fim de obter TRFs, b. Southern Blot destas TRFs é feito através da determinação do comprimento TRF significativo utilizando uma sonda telomérica 14, 37. Embora este método seja altamente preciso, com um pequeno coeficiente de variação é uma medida directa, e pode ser vantajoso para a medição da distribuição do comprimento, a análise TRF é caro, trabalhoso e requer, pelo menos, 3 ug de DNA. Este método também é insensível à telómeros curtos e determinação comprimento pode ser confundida pelo DNA subtelomérica, que pode ser detectado pela sonda devido a (TTAGGG) n como sequências que contêm 15, 42. Outro método de alta precisão para medir o comprimento dos telômeros é Única dos telômeros Alongamento Análise Comprimento (STELA), um singlmolécula e método baseado em PCR que requer apenas uma pequena quantidade de DNA. Neste método, os iniciadores são feitas para reconhecer o G-rico saliência na extremidade dos cromossomas e para se ligar a uma sequência de subtelomérica única sobre um cromossoma, o qual amplifica o telómero de um cromossoma específico. A amplificação resultante é, então, visualizado por Southern Blot. Este método tem a vantagem de ser altamente precisa e é capaz de detectar os telómeros outlier curtas 16. Infelizmente, uma vez que nem todos os cromossomos têm extremidades G-ricos e uma seqüência subtelomérica utilizável, o comprimento dos telômeros só pode ser medido em cromossomos específicos e essas medidas podem não representar o comprimento de todos os telômeros nas células 15. Outro método que tem sido praticado é o uso do ácido nucleico de péptido (ANP) sondas para detectar comprimento dos telómeros. Florescimento quantitativa em hibridização in situ (Q-FISH) nos permite visualizar os telômeros durante a metáfase, onde a ruaaining dos telómeros com uma sonda de PNA, em proporção ao seu tamanho permite a comparação dos telómeros entre cromossomas específicos. Embora este método também pode ser usado para células na interfase, aqui o comprimento dos telómeros para cromossomas diferentes não pode ser detectado, o que introduz uma limitação quando medição do comprimento dos telómeros nas células senescentes, ou raramente divisória 17. FISH fluxo em vez disso usa citometria de fluxo e é atualmente o método mais sensível para medir o comprimento dos telômeros das células do sangue na clínica, mas exige técnicos altamente qualificados 18. Actualmente, o método padrão para a medição do comprimento dos telómeros, em média, o nosso laboratório tem a vantagem de precisão, sensibilidade e facilidade de PCR quantitativa em tempo real. Este método só foi possível por medição do comprimento dos telómeros pelo desenvolvimento de novos iniciadores que evitam a síntese de dímeros de iniciadores produtos derivados, que teriam sido produzidas comoensaio tandard devido à natureza repetitiva de telômeros. Para este ensaio, a medição do comprimento de telómeros é representado pela razão T / S, o número de cópias de repetição telomérica para o número de genes de cópia única. Uma vez que existe uma relação proporcional directa entre o comprimento dos telómeros e o número de iniciadores marcados telomere ligação ao ADN durante os estágios iniciais de PCR, a razão T / S é directamente proporcional ao comprimento dos telómeros. A razão T / S é medida pela comparação da diferença de Ct, o número do ciclo fraccionada em que a amostra é de fluorescência acumulada cruza um limite que é de vários desvios padrão acima da linha de base de fluorescência, entre as amostras, com os primários telomere iniciadores e SCG 19. Este método tem sido criticado por sua medida indireta do comprimento dos telômeros, o que pode levar a medições imprecisas, por exemplo, no caso da duplicação de cromossomos ou cópia variações número 15. Além disso, a comparação entre os estudos é muitas vezes difficult, mas padrão oligômeros foram desenvolvidos para medir o comprimento dos telômeros absoluta 20. Este método foi melhorado por promoveu Cawthon, utilizando um ensaio multiplex qPCR monocromática. Neste ensaio, o PCR foi executado a temperaturas mais baixas para os primeiros ciclos para evitar a ligação de dímeros de iniciadores e o gene telómeros e de controlo foram analisados ​​no mesmo tubo de PCR, para evitar uma maior erro. As medidas de comprimento dos telômeros resultantes fortemente correlacionada com o comprimento dos telômeros medidos por análise de Southern blot dos TRFs e teve maior precisão 15, 19, 36. No momento, qRT-PCR é o único método prático disponível para testar amostras de grande tamanho e requer apenas uma pequena quantidade de ADN para levar a cabo. Uma parte crucial do método tem medidas de controle de qualidade, de modo que quando ele é feito corretamente, este método pode fornecer informações comparativas valiosas sobre o comprimento dos telômeros. Adicionalmente, este método foi adaptado para utilização além de leucócitos para medircomprimento dos telómeros numa variedade de diferentes tecidos 42. Além disso, a fim de melhor entender a biologia por trás manutenção comprimento dos telómeros e as interacções entre os dois efeitos opostos (isto é, telómeros de encurtamento durante a replicação e alongamento pela enzima telomerase), que acompanha o comprimento dos telómeros método com um ensaio adicional, que mede a actividade da telomerase. Para este efeito, foi utilizado um protocolo de amplificação repetição telomérica, um ensaio in vitro. Resumidamente, foram lisadas preservada, células enzimaticamente activas repetições teloméricas sintetizados sobre um substrato de oligonucleótido usando a telomerase, e os produtos foram amplificadas usando PCR, na presença de SYBR Green. Os resultados foram então analisadas por comparação da amostra de controlo e os valores de limiar Ct. Desde telomerase é uma enzima sensível ao calor, um calor adicional controle tratado é executado ao lado de cada amostra 21. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Ao medir o comprimento dos telômeros pode fornecer informações valiosas sobre o possível papel do comprimento dos telômeros na fisiopatologia do envelhecimento e da doença, o comprimento dos telômeros não é uma propriedade estática e é necessária mais informação para entender a função dos telômeros. Estudos a atividade da telomerase pode adicionar informações sobre os mecanismos de regulação comprimento dos telômeros. Por exemplo, a activação controlada de telomerase pode manter o comprimento do telómero e da proliferação celular, mas a activação descontrolada da telomerase pode resultar em cancro. Estes dois métodos de baixo custo para a frente e em linha reta combinados forneceu-nos não só com a evidência mais forte no sentido de uma relação entre o comprimento dos telômeros e da estabilidade celular, mas também uma visão mais aprofundada os possíveis mecanismos de encurtamento dos telômeros e recuperação. Com estes métodos esperamos elucidar a resposta da célula ao envelhecimento e vários estados de proliferação celular com o objetivo final de uma melhor compreensão do mechanis Centralms de biologia celular.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quantitative Telomerase Detection </td>
 <td>Allied Biotech </td>
 <td>MT3012 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiagen DNeasy Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>69506</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument</td>
 <td>Roche Diagnostics</td>
 <td>4707516</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence

Os telómeros são sequências de ADN de repetição na ponta extremidades dos cromossomas, que são diferentes em comprimento e em seres humanos pode atingir um comprimento de 15000 pares de bases. Os telómeros serve como um mecanismo de atrito bioprotector cromossoma em cada divisão celular. A um certo comprimento, os telómeros tornar demasiado curto para permitir a replicação, um processo que pode conduzir à instabilidade do cromossoma ou morte celular. O comprimento do telômero é regulada por dois mecanismos opostos: atrito e alongamento. Atrito ocorre à medida que cada célula se divide. Em contraste, o alongamento é modulado em parte pela enzima telomerase, que adiciona as sequências de repetição para as extremidades dos cromossomas. Desta forma, a telomerase pudesse inverter um mecanismo de envelhecimento e rejuvenesce viabilidade celular. Estes são elementos cruciais na manutenção da vida celular e são utilizadas para avaliar o envelhecimento celular. Neste artigo vamos descrever um método pouco preciso, sofisticado e barato para avaliar o comprimento dos telômeros em tecido múltiplas e espécies. Este método tira vantagem de dois elementos chave, a repetição em tandem da sequência do telómero e da sensibilidade do qRT-PCR para detectar números de cópias diferenciais de amostras testadas. Além disso, vamos descrever um teste simples para avaliar a atividade da telomerase como um teste backbone complementar para o comprimento dos telômeros.

Um exemplo de um comprimento de ensaio de qRT-PCR dos telómeros é mostrado na Figura 1. No painel superior esquerdo, amostras marcadas em vermelho e verde representam a localização dos sujeitos testados na placa de 96 poços. No painel superior direito, a curva de amplificação é demonstrada. Cada indivíduo é testado por dois ensaios (telômero e único gene Copy), que é feito em triplicata. Devido a diferentes números de cópias de ADN produzidos nos dois ensaios de indivíduos seleccionados,...

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Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Um método preciso, curto, sofisticado e barato é descrito que avalia o comprimento dos telômeros em múltiplos tecidos e espécies usando qRT-PCR. Além disso, vamos descrever um teste simples para avaliar a atividade da telomerase como um teste backbone complementar para o comprimento dos telômeros.

Comprimento dos telômeros e da telomerase atividade; Um Yin e Yang da senescência celular

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

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In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biologia

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

Monitoramento da ubiquitina-proteassoma Atividade em células vivas Usando um Degron (dgn) desestabilizado Green Fluorescent Protein Protein Repórter (GFP) com base em

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

Medição de Quimiotaxia celulares com ECIS / Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Na migração celular in vitro e invasão Ensaios

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

De gravidade reduzida Manifestações ambiente de hardware de uma tecnologia de mistura de fluxo Cytometer e Companion microfluídicos Prototype Miniaturized

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Correlacionando DNA Alterações metilação específico do gene com expressão e transcrição Atividade de astrocítica<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

Aplicações da sonda Individual: Imagem Espectrometria de Massa e Análise única célula sob condições ambientais

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed cellular senescence. Accumulation of senescent cells occurs with organismal aging and through continual culturing in vitro. Senescent cells influence many biological processes, including embryonic development, tissue repair and regeneration, tumor suppression, and aging. Hallmarks of senescent cells include, but are not limited to, increased senescence-associated &#946;-galactosidase activity (SA-&#946;-gal); p16INK4A, p53, and p21 levels; higher levels of DNA damage, including &#947;-H2AX; the formation of Senescence-associated Heterochromatin Foci (SAHF); and the acquisition of a Senescence-associated Secretory Phenotype (SASP), a phenomenon characterized by the secretion of a number of pro-inflammatory cytokines and signaling molecules. Here, we describe protocols for both replicative and DNA damage-induced senescence in cultured cells. In addition, we highlight techniques to monitor the senescent phenotype using several senescence-associated markers, including SA-&#946;-gal, &#947;-H2AX and SAHF staining, and to quantify protein and mRNA levels of cell cycle regulators and SASP factors. These methods can be applied to the assessment of senescence in various models and tissues.

Cellular senescence, the irreversible state of cell-cycle arrest, can be induced by various cellular stresses. Here, we describe protocols to induce cellular senescence and methods to assess markers of senescence.

Técnicas para induzir e quantificar a senescência celular

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily through modulating protein-protein interactions. Similar to ubiquitin modification, SUMOylation is directed by a sequential enzyme cascade including E1-activating enzyme (SAE1/SAE2), E2-conjugation enzyme (Ubc9), and E3-ligase (i.e., PIAS family, RanBP2, and Pc2). However, different from ubiquitination, an E3 ligase is non-essential for the reaction but does provide precision and efficacy for SUMO conjugation. Proteins modified by SUMOylation can be identified by in vivo assay via immunoprecipitation with substrate-specific antibodies and immunoblotting with SUMO-specific antibodies. However, the demonstration of protein SUMO E3 ligase activity requires in vitro reconstitution of SUMOylation assays using purified enzymes, substrate, and SUMO proteins. Since in the in vitro reactions, usually SAE1/SAE2 and Ubc9, alone are sufficient for SUMO conjugation, enhancement of SUMOylation by a putative E3 ligase is not always easy to detect. Here, we describe a modified in vitro SUMOylation protocol that consistently identifies SUMO modification using an in vitro reconstituted system. A step-by-step protocol to purify catalytically active K-bZIP, a viral SUMO-2/3 E3 ligase, is also presented. The SUMOylation activities of the purified K-bZIP are shown on p53, a well-known target of SUMO. This protocol can not only be employed for elucidating novel SUMO E3 ligases, but also for revealing their SUMO paralog specificity.

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Unlike ubiquitin ligases, few E3 SUMO ligases have been identified. This modified in vitro SUMOylation protocol is able to identify novel SUMO E3 ligases by an in vitro reconstitution assay.

In Vitro Ensaio de SUMOylation para estudar a atividade de Ligase E3 sumô

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...