Le travail est soutenu par un prix de l&#39;Institut de développement de l&#39;Hôpital pour enfants de Philadelphie.

1. Cross-link chromatine <ol><li> Cultiver les cellules dans des boîtes de culture cellulaire 100x20mm. La quantité de cellules peut varier de 1 à 10 millions de cellules par boîte selon le type de cellule. Environ 2 millions de cellules est suffisant pour une immunoprécipitation. </li><li> Cellules Cross-Link 1% de formaldéhyde pendant 10 min à température ambiante avec bascule occasionnelle. </li><li> Étancher la réticulation en ajoutant une concentration finale de 125 mM de glycine et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Laver les cellules avec du phosphate 1X saline tamponnée (PBS) deux fois, décanter PBS, puis ajoutez 0,2 ml de PBS. </li><li> Récolte des cellules avec un grattoir en plastique cellulaire dans un tube de centrifugation. </li><li> Isoler les cellules à 2000 rpm pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant. Remettre les cellules dans un tampon de lyse SDS (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8,1) pour lysat cellulaire ou les garder comme une pastille pour l&#39;extraction nucléaire. </li><li> Les cellules peuvent être sauvegardés à -80 ° C ou l&#39;on peut procéder immediatEly avec ultrasons. </li></ol> 2. Préparer noyaux (Passez à l&#39;étape 3.5 pour lysat de cellules entières) <ol><li> Supplément tampon de lyse cellulaire (5 mm tuyaux pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% de NP-40) avec 1X inhibiteur de la protéinase chaque expérience. </li><li> Reprendre décongelé culot cellulaire dans environ 10 fois le volume de granulés avec le tampon de lyse cellulaire. </li><li> DOUNCE-homogénéiser 10 fois avec un pilon puis incuber sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Centrifuger à 4000 rpm pendant 5 min à 4 ° C, éliminer le surnageant et sauver culot nucléaire. </li></ol> 3. Sonication * <ol><li> Réchauffez-vous SDS tampon de lyse et le montant du supplément de tampon pour être utilisé avec l&#39;inhibiteur de la protéinase. </li><li> Remettre en suspension culot nucléaire en SDS Lysis Buffer (environ 0,5 ml de tampon par 1-10000000 cellules) </li><li> Incuber sur de la glace pendant 10 min. </li><li> Ajouter 0,5 ml d&#39;aliquotes d&#39;échantillons à des microtubes. </li><li> Soniquer sur de la glace à l&#39;aide Misonix ultrasons avec 30 sec sur sec et 45off avec un réglage d&#39;amplitude de 2. Nombre de cycles de taille idéale de fragment peut être déterminée en premier essayer différents nombres de cycles (ex. 2, 4, 8, 12, 16 et 20 cycles ou plus). Une autre marque de sonicator peut être utilisé, cependant, les conditions peuvent varier. L&#39;expérimentation avec le nombre de cycles et la quantité de temps sur et en dehors doivent être effectuées afin de déterminer les conditions idéales. </li><li> Recueillir 20 ul de chaque échantillon pour vérifier les résultats de sonication et faire quantification. Le reste de l&#39;échantillon peut être conservé à -80 ° C. </li><li> Diluer le 20 ul d&#39;échantillon en ajoutant 30 ul de 0,1 X TE Buffer. </li><li> Traiter l&#39;échantillon avec 1 pi de RNase A à 37 ° C pendant 1 heure puis ajouter 1 l de protéinase K et incuber à 62 ° C pendant 2 heures. </li><li> Exécuter 20 pl de l&#39;échantillon sur un gel d&#39;agarose à 2%. </li><li> Purifier le montant restant de l&#39;échantillon avec QIAquick PCR purification kit puis quantifier en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop. </li></ol> * Pour Chi nativeP, microccocal digestion à la nucléase peut être utilisé alternativement pour cisailler l&#39;ADN. 4. Bloquer Agarose perles * <ol><li> Si les perles sont déjà bloqués, passez à l&#39;étape 5.1. </li><li> Utilisez une protéine ou protéine G agarose. Pour 5 immunoprécipitat (IPS), utiliser 600 ul de 50% Billes en suspension (300 pi perle granulés) </li><li> Pour laver les perles, les faire tourner vers le bas à 800 rpm pendant 1 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Ajouter un peu plus de 2 ml ChIP Dilution Buffer (0,01% SDS, 1,2 mM EDTA, NaCl 167 mM, 1,1% de Triton X-100, Tris-HCl 16,7 mM pH 8.1) et mélanger en retournant lentement le tube 10X. Tournez à nouveau à 800 rpm pendant 1 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Répétez les lave 2 fois plus. </li><li> Bloc billes en faisant tourner à 4 ° C pendant une nuit dans une solution de blocage. Reportez-vous au tableau 1 pour la recette de la solution de blocage. </li></ol> 5. Chromatine pré-claire <ol><li> Dégel ultrasons chromatine sur la glace. </li><li> Isoler à 12000 rpm fou 10 min à 4 ° C puis mis sur la glace tout de suite pour éliminer le SDS (blanc boulette). </li><li> Recueillir le surnageant, jetez granulés, et combiner des échantillons si nécessaire. </li><li> Sortez les montants nécessaires pour l&#39;expérience basée sur des calculs (1-10 ug de la chromatine par IP). </li><li> Diluer la chromatine 10X tampon de dilution ChIP complété par un inhibiteur de protéinase. </li><li> Ajouter 100 ul de billes bloqués par IP. </li><li> Tournez à 4 ° C pendant 1 heure. </li></ol> 6. Immunoprécipitation <ol><li> Isoler les échantillons à 800 rpm pendant 1 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube. </li><li> Isoler surnageant à 800 rpm pendant 1 min et le transfert à un autre tube propre. </li><li> Economisez 20 pi du surnageant, pour servir de contrôle d&#39;entrée, à -20 ° C. </li><li> Aliquote de la chromatine au nombre d&#39;adresses IP à faire dans l&#39;expérience. </li><li> Ajouter 2 ug d&#39;anticorps par 1-10 ug de la chromatine à chaque échantillon. </li><li> Incuber pendant 4 ° C avec rotation. </li><li> Ajouter 100 ul de billes bloqués pour chaque échantillon IP. </li><li> Incuber pendant 1 heure à 4 ° C avec rotation. </li><li> Pellet les perles en faisant tourner vers le bas à 800 rpm pendant 1 min et jeter autant de surnageant que possible. </li><li> Lavez perles fois avec du tampon de lavage complexe immunitaire Low Salt. Ajouter 1 ml de tampon à chaque tube, tourner à température ambiante pendant 5-8 min; ralentit à 800 rpm pendant 1 min, puis éliminer le surnageant. Répétez laver une fois avec le tampon de haut sel complexe immun de lavage et un tampon de lavage complexe immunitaire LiCl et deux fois avec du tampon TE pour un total de 5 lavages (tableau 2). </li></ol> 7. Élution <ol><li> échantillons d&#39;entrée de dégel du jour précédent à traiter avec les éluants. </li><li> Faire Elution Buffer frais (tableau 3). </li><li> Faites un mélange maître de suffisamment de tampon d&#39;élution nécessaire pour IPs et les échantillons de contrôle d&#39;entrée plus 1-2 échantillons supplémentaires. </li><li> Ajouter 100 pi de tampon d&#39;élution à chaque échantillon IP et incuber à température ambiante pendant 15 mdans la rotation. </li><li> Isoler à 800 rpm pendant 1 min et ajouter le surnageant dans un nouveau tube. </li><li> Ajouter un autre 100 pi de tampon d&#39;élution à chaque tube de perles et incuber à température ambiante pendant 15 min avec rotation. </li><li> Vortex pendant 15 secondes après incubation, centrifuger à 5000 rpm pendant 1 min, puis les combiner surnageant avec le surnageant de la première élution. (Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas laissés sur des billes dans les surnageants. Cas de doute, ralentit à nouveau surnageant à 5000 rpm pendant 1 minute et recueillir le surnageant dans un nouveau tube. </li><li> Ajouter 180 ul de tampon d&#39;élution à la 20 pl d&#39;échantillons de contrôle d&#39;entrée. </li></ol> 8. Inverser la Croix-link <ol><li> Pour les 200 pi de éluants et les contrôles d&#39;entrée, ajouter 8 pi de 5 M de NaCl. </li><li> tubes de sceller avec du Parafilm et incuber dans un bain d&#39;eau à 65 ° C pendant la nuit. </li></ol> 9. Purification de l&#39;ADN <ol><li> Traiter chaque échantillon avec 1 pi de RNase A pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Ajouter 4 μl d&#39;EDTA 0,5 M, 8 pi 1M Tris-HCl, mélanger, puis ajouter 1 l de protéinase K à chaque échantillon et incuber à 45 ° C pendant 2 heures. </li><li> Purifier les échantillons à l&#39;aide QIAquick PCR purification kit. Les échantillons peuvent être enregistrés à -20 ° C et chèque PCR peut être fait à une date ultérieure. </li></ol> * Alternativement, les billes magnétiques ChIP-grade peuvent être utilisés à la place d&#39;agarose pour la partie immunoprécipitation. 10. Chèque PCR <ol><li> Pour le contrôle PCR, utiliser des amorces pour les régions connues pour être lié par la protéine d&#39;intérêt. En outre, utiliser des amorces pour les régions non contraignants que les contrôles négatifs. </li><li> Mélanger les réactifs pour la réaction. Diluer l&#39;échantillon d&#39;entrée à 1:100 (tableau 3). </li><li> Exécuter réaction. Programme PCR: </li></ol> Etape 1: 94 ° C 3 min Étape 2: 94 ° C 20 sec 59 ° C 30 sec 72 ° C 30 sec (Répétez l&#39;étape 2 pour au moins 30 cycles) Etape 3: 72 ° C 2 min <ol start="4"><li> Exécuter des échantillons sur gel agarose 1%. </li><li> L&#39;enrichissement peut aussi être déterminée de manière quantitative par PCR en temps réel. </li></ol>

<ol>
	<li>Odom, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pancreas+and+liver+gene+expression+by+HNF+transcription+factors.">Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors.</a> Science. 303, 1378-1381 (2004).</li><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+association+study+of+type+2+diabetes+in+Finns+detects+multiple+susceptibility+variants.">A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants.</a> Science. 316, 1341-1345 (2007).</li><li>Steinthorsdottir, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+in+CDKAL1+influences+insulin+response+and+risk+of+type+2+diabetes.">A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes.</a> Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).</li><li>Salonen, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+8q24+cancer+risk+variant+rs6983267+shows+long-range+interaction+with+MYC+in+colorectal+cancer.">The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer.</a> Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).</li><li>Tuupanen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+common+colorectal+cancer+predisposition+SNP+rs6983267+at+chromosome+8q24+confers+potential+to+enhanced+Wnt+signaling.">The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling.</a> Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).</li><li>Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+loci+are+significantly+over-represented+among+genes+bound+by+transcription+factor+7-like+2+(TCF7L2)+in+vivo.">Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo.</a> Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).</li><li>Benjamini, Y., Yekutieli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+trait+Loci+analysis+using+the+false+discovery+rate.">Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate.</a> Genetics. 171, 783-790 (2005).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Il est désormais possible d&#39;effectuer l&#39;ensemble du génome profil de l&#39;association des interactions protéine-ADN en utilisant ChIP-seq, comme cela a été récemment démontrée avec d&#39;autres facteurs de transcription 2,3. La clé d&#39;un résultat de séquençage réussie est la génération d&#39;un modèle chromatine de l&#39;ADN d&#39;immunoprécipitation de haute qualité. Une fois la matrice d&#39;ADN a été généré et déterminé à être enrichi de m...

Depuis de nombreuses années, il ya eu un besoin non satisfait pour identifier l&#39;ensemble des gènes liés et réglementée par une protéine échelle du génome entier, en particulier compte tenu de ceux de la classe de facteur de transcription. Odom et al. 1 utilisé immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) combiné avec des puces de promoteurs afin d&#39;identifier systématiquement les gènes occupées par des régulateurs de transcription pré-spécifiés dans le foie humain et îlots pancréatiques. Par la suite, Johnson et al. 2 mis au point un test d&#39;immunoprécipitation de la chromatine à grande échelle basée sur le séquençage direct ultra haut débit ADN (ChIP-seq) afin de cartographier en détail les interactions protéine-ADN dans l&#39;ensemble de génomes de mammifères. En cas de test, ils ont cartographié in vivo la liaison du facteur de silencieux neurones restrictive (CRSN) à 1946 endroits dans le génome humain. Les données affichées résolution forte de position de reliure (+ 50 paires de bases), ce qui a facilité à la fois le iconsolation de motifs et de l&#39;identification des motifs CRSN contraignantes. Ces données ChIP-Seq également eu une grande sensibilité et de la spécificité et de la confiance statistique (p &lt;10 -4), propriétés qui sont importantes pour déduire de nouvelles interactions candidats. Robertson et al. 3 également utilisé ChIP-seq afin de cartographier STAT1 cibles dans l&#39;interféron γ-(IFN-γ)-stimulés et non stimulés cellules HeLa S3 humains in vivo. Par Chip-Seq, avec 15,1 et 12,9 millions de séquence cartographiée unique lit, et un taux de fausses découvertes estimée à moins de 0.001, ils ont identifié 41 582 et 11 004 régions STAT1-putatifs de liaison dans les cellules stimulées et non stimulées, respectivement. Sur les 34 loci connus pour contenir l&#39;interféron STAT1 sensible liaison 4-8 sites ChIP-seq trouvé 24 (71%). Objectifs ChIP-Seq ont été enrichies en séquences similaires à connaître STAT1 motifs de liaison. Les comparaisons avec les données de la puce deux-PCR existants définit suggéréque la sensibilité ChIP-seq se situait entre 70% et 92% et la spécificité était d&#39;au moins 95%. En outre, il était clair que ChIP-seq offre à la fois une faible complexité analytique et une sensibilité qui augmente avec la profondeur de séquençage. Alors que les technologies de séquençage tel, Génome &quot;nouvelle génération&quot; offrent 1-2 ordres de grandeur dans l&#39;augmentation de la quantité de séquence qui peut être rentable généré plus anciennes technologies 9. Méthodes ChIP-Seq fournissent donc directement couverture du génome entier pour le profilage efficace des interactions protéine-ADN de mammifères 3. En 2006, une forte association des variants du facteur de transcription 7-like 2 (TCF7L2) gène du diabète de type 2 a été découvert 10. D&#39;autres chercheurs ont déjà répliqué indépendamment de cette constatation dans différentes ethnies et, curieusement, depuis les premières études d&#39;association génomique échelle du diabète de type 2 publiés dans Nature 11,12 </splace&gt;, Science 13-15 et ailleurs 16,17, la plus forte association était en effet avec TCF7L2, ce qui est maintenant considéré comme le résultat génétique le plus important dans le diabète de type 2 à ce jour 18-20. En outre, TCF7L2 a été liée à un risque de cancer 21,22, en effet, ce lien est devenu plus évident lorsque le locus 8q24 révélé par Génome larges études d&#39;association d&#39;un certain nombre de cancers, y compris les carcinomes colorectaux, s&#39;est révélée être en raison d&#39;une extrême amont TCF7L2 élément contraignant de conduire la transcription MYC 23,24. En tant que tel, il ya un grand intérêt dans la détermination des gènes en aval régulés par ce facteur de transcription clé. Basé sur l&#39;expérience avec TCF7L2 comme un exemple de la méthodologie, ce document décrit comment générer une matrice d&#39;ADN de Morceau de qualité. Puce a été effectuée de la lignée cellulaire de carcinome colorectal, HCT116, pour le séquençage ultérieur afin de construire un haut-résolcarte ution des gènes liés par TCF7L2 25 dans un effort pour donner un meilleur aperçu de son rôle clé dans la pathogenèse de traits complexes.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>28104 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EZ-ChIP Kit </td>
 <td>Millipore </td>
 <td>17-371 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GoTaq Hot Start Polymerase </td>
 <td>Promega</td>
 <td>M5001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Misonix Sonicator</td>
 <td>Qsonica </td>
 <td>XL-2000 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>
 NanoDrop 1000 Spectrophotometer </td>
 <td>
 Thermo-Scientific</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Positive control primer sequences (TCF7L2-1) 
 Forward- 5'-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3' 
 Reverse- 5'-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3' 
 Negative control primer sequences (CTRL-1) 
 Forward-5'-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3'
 
 Reverse- 5'-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3'</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of high quality chromatin immunoprecipitation dna template for high-throughput sequencing (chip-seq)

ChIP-séquençage (ChIP-seq) méthodes offrent directement couverture du génome entier, où la combinaison immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et le séquençage massivement parallèle peut être utilisé pour identifier le répertoire de séquences d&#39;ADN de mammifères liés par des facteurs de transcription in vivo. &quot;La nouvelle génération&quot; technologies de séquençage du génome fournissent 1-2 ordres de grandeur dans l&#39;augmentation de la quantité de séquence qui peut être rentable généré plus anciennes technologies permettant ainsi des méthodes ChIP-Seq pour fournir directement la couverture du génome entier pour le profilage efficace des mammifères interactions protéine-ADN. Pour les approches ChIP-Seq succès, il faut générer une matrice d&#39;ADN de Morceau de qualité afin d&#39;obtenir les meilleurs résultats de séquençage. La description est basée sur l&#39;expérience avec le produit protéique du gène le plus fortement impliquée dans la pathogenèse du diabète de type 2, à savoir le facteur de transcription facteur de transcription 7-like 2 (TCF7L2). Ce facteur a également été impliqué dans divers cancers. Décrit est de savoir comment générer une matrice d&#39;ADN de puce de haute qualité issu de la lignée de cellules de carcinome colorectal, HCT116, afin de construire une carte à haute résolution par séquençage de déterminer les gènes liés par TCF7L2, donner un nouvel aperçu de son rôle clé dans la pathogenèse des traits complexes.

Une fois la chromatine a été traité par ultrasons et ont été traités à la RNase et protéinase, les échantillons analysés sur le gel à 2% d&#39;agarose doivent présenter un frottis avec la majeure partie de l&#39;ADN à la taille désirée. Si plusieurs cycles différents sont testés, une diminution progressive de la taille doit être considéré comme le nombre de cycles de hausse (figure 2). Après avoir terminé la partie d&#39;immunoprécipitation du protocol...

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Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

La combinaison de l&#39;immunoprécipitation de la chromatine et le séquençage ultra-haut débit (chip-seq) permet d&#39;identifier et de cartographier les interactions protéine-ADN dans une lignée de tissu ou de cellule donné. Décrit est de savoir comment générer un modèle de puce de haute qualité pour le séquençage ultérieur, en utilisant l&#39;expérience avec le facteur de transcription TCF7L2 comme un exemple.

Génération de haute qualité Immunoprécipitation de la chromatine Patron de l&#39;ADN pour le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

generation-high-quality-chromatin-immunoprecipitation-dna-template

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

24.3K vues.  Children's Hospital of Philadelphia Research Institute. La combinaison de l'immunoprécipitation de la chromatine et le séquençage ultra-haut débit (chip-seq) permet d'identifier et de cartographier les interactions protéine-ADN dans une lignée de tissu ou de cellule donné. Décrit est de savoir comment générer un modèle de puce de haute qualité pour le séquençage ultérieur, en utilisant l'expérience avec le facteur de transcription TCF7L2 comme un exemple.

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Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

La ligature très efficace de petites molécules d&#39;ARN pour microARN quantification par séquençage à haut débit

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Recherche

Biologie

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Ciblé méthylation de l&#39;ADN Analyse par séquençage de nouvelle génération

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Immunoprécipitation de la chromatine test pour l&#39;identification de Arabidopsis interactions protéine-ADN<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-seq: L&#39;échelle du génome Cartographie des protéine-ADN Interactions par séquençage à haut débit de fragments d&#39;ADN adénine-méthylé

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Séquençage de nouvelle génération, et l&#39;ADN génomique Cartographie des rétrovirales Sites d&#39;intégration

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

Haut-débit CRISPR Vector Construction et caractérisation de l&#39;ADN Modifications par génération de tomate Poilu Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Un protocole pour l&#39;évaluation fonctionnelle de Whole-Protein Saturation mutagenèse Bibliothèques Utilisant à haut débit de séquençage

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

Essai cinétique à molécule unique à haut débit parallèle pour le clivage d’ADN spécifique au site

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, host characteristics, and broader ecosystem functions. With this rapid increase in breadth and depth of sequencing capabilities have come methods to extract, amplify, analyze, and interpret environmental DNA successfully with maximum efficiency. Unfortunately, performing DNA extractions quickly can come at the cost of increasing the risk of contamination among samples. In particular, high-throughput extractions that are based on samples contained in a 96-well plate offer a relatively quick method, compared to single-tube extractions, but also increase opportunities for well-to-well cross-contamination. To minimize the risk of cross-contamination among samples, while retaining the benefits of high-throughput extraction techniques, we developed a new method for loading environmental samples into 96-well plates. We used pierceable PCR sealing films to cover each plate while loading samples and added samples first to PCR tubes before moving them into wells; together, these practices reduce the risk of sample drift and unintended double loading of wells. The method outlined in this paper provides researchers with an approach to maximize available high-throughput extraction techniques while reducing the risk of cross-contamination inherent to 96-well plates. We provide a detailed step by step outline of how to move from sample collection to DNA extraction while minimizing the risk of unwanted cross-contamination.

Current methods for loading 96-well plates for DNA extractions can be prone to contamination. We detail a new method for loading 96-well plates that reduces risk of cross-contamination among wells. Our method will help other researchers capitalize on the efficiency of high-throughput DNA extraction techniques and minimize risk of contamination.

Méthodes modifiées pour le chargement des plaques d’extraction d’ADN à haut débit réduisent le risque de contamination

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...