Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de l’épigénétique telles que la quantité de modifications chromatiques sont réglementées d’une manière spécifique de type cellulaire avec les génomes. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons isoler la chromatine des cellules ciblées et ensuite suivre la gitane typique en aval. Ainsi, cette méthode peut fournir un aperçu de trimincil spécifique neurone, lysinc 4, opisoncilly.
Il peut également être appliqué à d’autres modifications de l’histone, d’autres types de cellules, puis d’autres organismes modèles. Mari Mito, technicienne de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer, utilisez de fins ciseaux à ressort pour disséquer le tissu d’intérêt en petits morceaux.
Ajouter les fragments de tissu dans un récipient propre rempli d’azote liquide. Ensuite, transférez les fragments de tissu à deux tubes millilitres remplis d’azote liquide. Conserver les tubes à moins 80 degrés Celsius pendant cinq minutes avec le bouchon ouvert pour évaporer l’azote liquide.
Placer les tubes contenant les échantillons de tissus sur une grille de glace en métal réfrigéré. Ensuite, placez une balle métallique dans un tube de 1,5 millilitre et refroidissez-la avec de l’azote liquide. Placez la balle en métal réfrigéré sur l’un des tubes de l’échantillon.
Fermez le bouchon et placez le tube dans le support du tube d’un broyeur cryogénique. Trempez immédiatement le support de tube assemblé dans de l’azote liquide pendant une minute. Insérez le support de tube congelé dans la cassette extérieure du broyeur cryogénique.
Et secouez-le vigoureusement pendant 30 secondes, 60 fois. Après cela, démonter le broyeur cryogénique, enlever la balle en métal. Et placez le tube dans un refroidisseur d’échantillon pré-refroidi.
Conserver le refroidisseur à 20 degrés Celsius négatif pendant 15 minutes. Ajouter ensuite 900 microlitres de formaldéhyde de 1 % au tube et à la pipette pour mélanger. Transférer la suspension dans un nouveau tube de deux millilitres avec 900 microlitres de formaldéhyde à 1 %.
Ensuite, fixez la suspension pendant 10 minutes avec une rotation douce à 23 degrés Celsius. Pour arrêter la réaction de fixation, ajouter 100 microlitres de 2,5 glycines molaires au tube. Et centrifugeuse à 3000 fois la gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Après cela, jeter le super supernatant. Ajouter un millilitre de PBS au tube et au vortex pour mélanger. Centrifugeuse à 3000 fois la gravité pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Répétez cette étape de lavage, deux fois de plus. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse un à la pastille et pipette à mélanger. Centrifuger le tube pendant cinq minutes à 3000 fois la gravité à quatre degrés Celsius et jeter le supernatant.
Ajouter un millilitre de tampon de lyse deux à la pastille et au vortex pour mélanger. Ensuite, centrifugez la suspension pendant cinq minutes à 3000 fois la gravité à quatre degrés Celsius et jetez le supernatant. Après cela, ajouter 800 microlitres de tampon asssay immunoprecipitation radio avec cocktail inhibiteur de protéase à la pastille et pipette à mélanger.
Centrifuger la suspension pendant cinq minutes à 3000 fois la gravité à quatre degrés Celsius et jeter le supernatant. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon RIPA avec cocktail inhibiteur de la protéase à la pastille. Ensuite, centrifugez la suspension pendant cinq minutes à 3000 fois la gravité à quatre degrés Celsius et jetez le supernatant.
Ajouter un millilitre de tampon RIPA avec un cocktail inhibiteur de la protéase. Immédiatement après avoir ajouté le tampon RIPA avec un cocktail inhibiteur de la protéase, transférer le lysate dans un tube sonicateur. Et placez le tube sur un ultrason.
En utilisant les paramètres décrits dans le protocole de texte, cisaillez la chromatine. Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube de liaison faible en protéines de 1,5 millilitre. Et centrifuger pendant cinq minutes à 20 000 fois la gravité à quatre degrés Celsius.
Recueillir le surnatant de l’échantillon et le transférer dans un nouveau tube à faible liaison protéique. Dans ce protocole, le séquençage tandem d’immunoprécipitation de chromatine a été introduit et démontré. Au cours de la procédure, la qualité de l’ADN a été testée à plusieurs étapes.
Immédiatement après sonication, l’ADN cisaillé a été isolé et examiné avec la machine microfluidique d’électrophoresis. Après avoir utilisé des anticorps anti-FLAG et anticorps anti-H3K3me3 pour effectuer la purification d’affinité, la qualité de l’ADN a été vérifiée à nouveau. La spécificité de la purification immunitaire de l’ADN sur H2B-FLAG a été confirmée avec des échantillons de contrôle négatifs.
Où des quantités négligeables d’ADN ont été détectées. Plus loin dans le protocole, la qualité de la bibliothèque de séquençage a été vérifiée. Le succès du ChIP et du T-ChIP a été démontré par l’analyse d’enrichissement utilisant des amorces ciblant la région de promoteur du gène GAPDH.
Des redistributions représentatives le long de trois gènes de neurone ont été obtenues. Et l’enrichissement des lues aux cinq extrémités principales des gènes par le neurone T-ChIP chercher sur le cerveau entier T-ChIP chercher a été observé. Après un stabiliment, cette technique ouvre la voie pour des chercheurs dans le domaine épigénétique d’explorer le type de cellule spécifique modification d’histone générale largement dans les neurones chez les souris.
N’oubliez pas que travailler avec du formaldéhyde peut être extrêmement dangereux et prendre des précautions telles que le port de vêtements en caoutchouc et de lunettes doit toujours être pris lors de l’exécution de cette procédure.
