This work was supported by the BLUERPINT EU grant (BLUEPRINT &#8211; A BLUEPRINT of Haematopoietic Epigenomes). We also thank the Walloon Region (DG06) for its financial support.

1. Expériences standard ChIP <ol><li> collection cellulaire et les protéines et l&#39;ADN réticulation. <ol><li> Cultiver les cellules HeLa-S3 à une confluence de 80% -90%. Retirez milieu de culture, laver le plat deux fois avec 10 ml de 1x tampon phosphate salin (PBS), et ajouter la trypsine-EDTA (1x) à la plaque de culture. Incuber pendant un maximum de deux minutes pour détacher les cellules de la boîte. Recueillir les cellules et laver deux fois avec 10 ml de PBS. NOTE: Plus long temps d&#39;incubation vont conduire à des dommages cellulaires. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g et remise en suspension des cellules dans 20 ml de PBS. Passez à compter les cellules. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 minutes à 500 xg, jeter le surnageant et ajouter 500 ul de PBS. Le nombre optimal de cellules pendant l&#39;étape de fixation est de 10 millions de cellules par 500 pi de PBS. </li><li> Ajouter 13,5 ul de 37% de formaldéhyde fraîche dans chaque fraction aliquote de 500 pl de suspension cellulaire. Fixer les cellules pendant 8 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter 57 ul de 1,25 M de glycine solution pour arrêter la fixation. Incuber pendant 5 min à température ambiante avec agitation constante par vortex doux. Travailler sur la glace partir de ce point. </li><li> Centrifuger les cellules à 500 g pendant 5 min à 4 ° C et jeter le surnageant sans déranger le culot cellulaire. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 1 ml de PBS. Jeter doucement le surnageant et garder le culot de cellules sur la glace. </li></ol></li><li> La lyse des cellules et la chromatine cisaillement <ol><li> Ajouter 10 ml de glace iL1 tampons de lyse froid au culot de cellules (1 ml de tampon de lyse par million de cellules est le rapport optimal). Pipette de haut en bas plusieurs fois et incuber pendant 10 min à 4 ° C en mélangeant doucement. </li><li> Centrifuger le lysat pendant 5 min à 500 x g et 4 ° C. Jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 10 ml de tampon de lyse froid glace iL2 aux lysats et mélanger doucement par pipetage de haut en bas. Incuber les lysats pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 500 g et 4 ° C et jeter le surnageant. </li><li> Prepare le tampon de cisaillement complet adjonction, 200x cocktail d&#39;inhibiteurs de protease (PIC) de la mémoire tampon de cisaillement iS1. Gardez le tampon sur la glace pendant 5 min et de travailler sur la glace par la suite. Ajouter 1 ml de la mémoire tampon complète de cisaillement iS1 à chaque 10 millions de cellules Pellet et mélanger délicatement par pipetage de haut en bas. Avant la sonification Incuber les échantillons sur de la glace pendant 10 min pour réduire la viscosité de l&#39;échantillon. </li><li> Cisaillement 300 ul de parties aliquotes de la chromatine par sonication en utilisant un sonicateur de bain d&#39;eau pendant 2 à 3 séries de 10 cycles chacun. Un cycle se compose de 30 sec &quot;ON&quot; et 30 sec &quot;OFF&quot; sur un réglage de puissance élevée. Sinon, utilisez un dispositif pico-sonication avec un temps de sonication plus courte de 5 à 10 cycles de 30 sec &quot;ON&quot;, 30 sec &quot;OFF&quot;. Brièvement vortex et tourner les tubes entre les pistes. Lors de l&#39;utilisation d&#39;autres types de sonicateurs, suivez les instructions du fabricant correspondant pour la chromatine cisaillement. </li><li> Centrifuger la chromatine cisaillé à 16 000 xg pendant 10 min et collect le surnageant à être utilisé immédiatement dans l&#39;étape IP. Alternativement, la chromatine stocker à -80 ° C pendant jusqu&#39;à deux mois pour une utilisation future. </li><li> Analyser le cisaillement efficacité de la chromatine avant l&#39;étape d&#39;immunoprécipitation utilisant 1-1,5% de gels d&#39;agarose TAE ou bionalyzer. Optimal tailles de fragments chromatine varient entre 100 à 600 pb. </li></ol></li></ol> 2. Faible expériences cellulaire ChIP <ol><li> collection cellulaire et les protéines et l&#39;ADN reticulation <ol><li> Cultiver les cellules HeLa-S3 à une confluence de 80% -90%. Retirez milieu de culture, laver le plat deux fois avec 10 ml de 1x tampon phosphate salin (PBS), et ajouter 1x trypsine-EDTA à la plaque de culture. Incuber pendant un maximum de deux minutes pour détacher les cellules de la boîte. NOTE: Plus long temps d&#39;incubation vont conduire à des dommages cellulaires. </li><li> Recueillir les cellules par addition de milieu de culture de 1 ml contenant du sérum dans un tube de centrifugation de 1 ml. Compter les cellules. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g. Porter le nombre de cellulesà 10 000 cellules par ml de milieu de culture pour la fixation. </li><li> Ajouter 27 pi de 36,5% de formaldéhyde préparés frais dans chaque tube pour la fixation. Inverser le tube deux ou trois fois et incuber 10 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 115 ul de 1,25 M de glycine à la solution de l&#39;échantillon, le tube inverser deux ou trois fois et incuber 5 minutes à température ambiante. Travailler sur la glace partir de ce point. </li><li> Centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant lentement. </li><li> Laver les cellules avec 1 ml de glace froide HBSS avec PIC (200x, concentration finale 1x). Inverser le tube deux ou trois fois pour remettre en suspension les cellules et centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C. Jeter doucement le surnageant et garder le culot de cellules sur la glace. </li></ol></li><li> La lyse des cellules et la chromatine cisaillement <ol><li> Ajouter 25 ul de tampon de lyse complet tL1 (Lysis Buffer tL1 + PIC) par 10 000 cellules et agiter manuellement le fond du tube pour remettre en suspension les cellules. Incuber sur de la glace pendant 5 min. </li><li> Ajouter 75 pi de HBSS complet (HBSS + PIC) tampon dans chaque aliquote contenant 10 000 cellules. </li><li> Cisaillement aliquotes de 100 pi de 10 000 cellules par ultrasons pendant 5 séries de 5 chaque cycle. Un cycle se compose de 30 sec &quot;ON&quot; et 30 sec &quot;OFF&quot; sur le réglage haute puissance. Sinon, utilisez un dispositif pico-sonication utilisé avec un temps de sonication plus courte de cinq cycles de 30 sec &quot;ON&quot;, 30 sec &quot;OFF&quot;. Optimal tailles de fragments chromatine varient entre 100 à 600 pb. Notez que les préparations de chromatine, des types de cellules différents et nécessitent d&#39;ultrasons expériences d&#39;optimisation de cisaillement distincts. </li><li> Centrifugeuse la chromatine cisaillé à 14 000 g pendant 10 min à jeter l&#39;insoluble et recueillir le surnageant à être utilisé immédiatement dans l&#39;étape IP. Alternativement, la chromatine stocker à -80 ° C pendant jusqu&#39;à deux mois pour une utilisation future. </li><li> Analyser le cisaillement efficacité de la chromatine avant l&#39;étape d&#39;immunoprécipitation utilisant 1-1,5% TAE gels d&#39;agarose oul&#39;bionalyzer. Traiter les échantillons avec de la RNase avant l&#39;analyse sur gel d&#39;agarose afin d&#39;améliorer l&#39;évaluation visuelle de cisaillement. Optimal tailles de fragments chromatine varient entre 100 à 600 pb. </li></ol></li></ol> 3. Immunoprécipitation de la chromatine et de la Bibliothèque Prep <ol><li> Pour standards automatisé expériences ChIP <ol><li> Ajouter 120 ul de la puce tampon H (Chip tampon H + PIC) à 100 pi chromatine cisaillées. Utilisez 200 pi pour l&#39;IP et de garder 2 pi à 20 pi comme échantillon d&#39;entrée. </li><li> Sélectionnez le automatisé ChIP 200 protocole ul dans l&#39;instrument d&#39;automatisation. Le débit du protocole est de 1 à 16 échantillons par cycle. </li><li> Exécutez une expérience de ChIP automatisé utilisant, chromatine correspondant à 1-2000000 cellules, 1-2 ug d&#39;anti-H3K79me3, le grade -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 et H3K9me3 ChIP-seq des anticorps polyclonaux de lapin. Montants anticorps optimales varient selon la modification des histones et l&#39;affinité et la specificity de l&#39;anticorps correspondant. <ol><li> Utiliser des quantités égales de non-IgG de lapin immunisé comme un anticorps de contrôle d&#39;isotype. Sinon, utilisez des perles non couchés ou anticorps bloqué spécifique contrôles de puce. Ajouter 20 pi de protéine A-perles magnétiques revêtues pour chaque réaction. </li></ol></li><li> Utilisez les histones automatisé ChIP-seq kit de réactifs pour effectuer des expériences de ChIP automatisés avec des anti-H3K79me3 et polyclonaux -H3K4me2. Utilisez le kit de réactifs de ChIP-seq idéales pour effectuer des expériences de puce anti-H3K27me3, -H3K4me3, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 et -H3K9me3. </li><li> Sélectionnez le protocole de ChIP automatisé suivant les instructions de logiciels mis en oeuvre dans l&#39;appareil d&#39;automatisation. Régler les paramètres expérimentaux ChIP à 4 heures pour l&#39;étape de revêtement d&#39;anticorps et 15 heures pour l&#39;étape d&#39;immunoprécipitation. L&#39;étape de réticulation inverse a lieu dans l&#39;instrument automatisé à 65 ° C pendant 4 heures. </li><li> Purifier l&#39;ADN réticulé inverse sur le système automatisé. Sélectionnez automated protocoles pour la purification d&#39;ADN avec un protocole ou un kit utilisant magnétique purification d&#39;ADN à base de perles. Éluer l&#39;ADN dans 25 pi d&#39;eau. </li><li> Quantification de l&#39;ADN immunoprécipité par extraction de 10% de l&#39;ADN immunoprécipité. Le rendement en ADN immunoprécipité dépend de la qualité de la chromatine et l&#39;anticorps, le type de cellule cible et la modification d&#39;histone. Quantification de l&#39;ADN en utilisant un kit de dosage selon les instructions du fabricant. </li><li> Analyser la qualité de l&#39;ADN immunoprécipité par PCR quantitative en utilisant des amorces pendant au moins une positive et une régions génomiques de contrôle négatif. Ne pas utiliser plus de 10% de l&#39;ADN immunoprécipité total pour évaluer enrichissements puce. <ol><li> Préparer les réactions de qPCR. Ajouter 10 ul d&#39;un mélange maître 2x Sybergreen qPCR, 1 ul de mélange d&#39;amorces, 1-5 ul d&#39;ADN immunoprécipité ou de l&#39;entrée et de l&#39;eau stérile jusqu&#39;à 20 ul de volume réactionnel final. Le programme PCR quantitative comprend une étape de dénaturation initiale à 95 ° Cpendant 5-10 min selon le fournisseur de la Taq polymérase et les températures de recuit doivent être définies en fonction des amorces choisies. </li></ol></li><li> les protocoles de préparation de bibliothèque automatisé Utilisation compatibles avec les Illumina ChIP-seq réactifs de préparation de bibliothèques disponibles dans le commerce pour construire des bibliothèques utilisant à la fois l&#39;ADN de ChIP ainsi que l&#39;ADN d&#39;entrée enregistré à partir de la même préparation de la chromatine. Utilisez 10-20 ng d&#39;ADN immunoprécipité de chaque anticorps pour la préparation bibliothèque. Préparer jusqu&#39;à 16 bibliothèques automatisées par cycle. </li><li> Séquencer les bibliothèques et générer des grappes selon les instructions du fabricant Illumina. Effectuer primaire analyse bioinformatique (filtrage de cluster, appel de base, etc.) conformément à la norme Illumina pipeline, filtre et alignez le lit à la dernière assemblée du génome humain (version actuelle est GRCh38) avec l&#39;alignement ELAND. Utilisez SICER 7 ou 8 MACS pour le pic appel et effectuer les analyses en aval de pics wième Homer 9, 10 ou logiciels bedtools préféré. </li></ol></li><li> Pour nombre automatisé à faible cellulaires expériences ChIP <ol><li> Ajouter 120 pi de tampon de ChIP complète tC1 (Chip Buffer tC1 + PIC) à 100 pi chromatine cisaillées. Utilisez 200 pi pour l&#39;IP et de garder 20 pi comme entrée. </li><li> Sélectionnez automatisé ChIP 200 protocole ul dans le système d&#39;automatisation. Le débit du protocole est de 1 à 16 échantillons par cycle. </li><li> Exécutez une expérience de ChIP-seq automatisé utilisant des réactifs de ChIP automatisés et des anticorps de qualité ChIP optimisés pour travailler sur des quantités faibles de la chromatine. Utilisation chromatine correspondant à 10 000 cellules 100 000 cellules, et 0,5 pg d&#39;anticorps anti-H3K27me3, 0,25 ug -H3K4me3, 0,1 ug -H3K27ac, 0,25 ug -H3K9me3 anticorps polyclonaux de lapin lapin professionnelles ChIP-seq qualité. Montants anticorps optimales varient en fonction de la modification des histones et l&#39;affinité et la spécificité de l&#39;anticorps correspondant. <ol><li> Utilisez quantité égale de rab non-immuneIgG de bits comme un anticorps de contrôle d&#39;isotype. Sinon, utilisez des perles non couchés ou anticorps bloqué spécifique contrôles de puce. Ajouter 10 pi de protéine A-perles magnétiques revêtues pour chaque réaction. </li></ol></li><li> Sélectionnez le protocole de ChIP automatisé suivant les instructions de logiciels mis en oeuvre dans l&#39;appareil d&#39;automatisation. Régler les paramètres expérimentaux ChIP à 4 heures pour l&#39;étape de revêtement d&#39;anticorps et 15 heures pour l&#39;étape d&#39;immunoprécipitation. L&#39;étape de réticulation inverse a lieu dans l&#39;instrument automatisé à 65 ° C pendant 4 heures. </li><li> Purifier l&#39;ADN réticulé inverse en utilisant des colonnes de centrifugation suivant les instructions du fabricant et éluer des volumes de 6 pi à 25 pi d&#39;eau. </li><li> Quantification de l&#39;ADN en utilisant un kit de dosage commercial. Analyser les résultats de qPCR en utilisant des amorces pour les régions de témoins positifs et négatifs pour évaluer la qualité de la puce. </li><li> Utilisez un kit de préparation bibliothèque avec des réactifs de préparation de bibliothèques optimisé pour préparer des banques à faible quan d&#39;ADNtités. Utilisez 30 pg et 300 pg de puce à ADN (correspondant à 10 000 et 100 000 cellules expériences respectivement) pour la préparation bibliothèque. Préparer bibliothèques utilisant le protocole automatisé compatible avec les réactifs de préparation bibliothèque. La bibliothèque prep débit automatisé est de 1 à 48 bibliothèques par cycle. </li><li> Après la réparation des modèles d&#39;ADN double brin extrémité, ligaturer les adaptateurs clivables tige-boucle contenant les sites d&#39;amorce de séquençage. Après l&#39;étape d&#39;extension de l&#39;ADN, amplification de l&#39;échantillon avec la méthode d&#39;amplification décrite haute fidélité dans la bibliothèque protocole de kit de préparation. </li><li> Après amplification bibliothèque, de quantifier et de purifier les bibliothèques suivantes la bibliothèque directives du kit de préparation. On notera que la sélection de la taille, après purification ne est pas nécessaire. </li><li> Séquencer les bibliothèques et générer des grappes selon les instructions du fabricant. Effectuer primaire analyse bioinformatique (filtrage de cluster, appel de base, etc.) à la suite du standpipeline de fabricant ard, filtre, et aligner les lectures à la dernière assemblée du génome humain (version actuelle est GRCh38) avec le ELAND 7 alignement. Utilisez SICER 8 ou 9 MACS pour le pic appel et effectuer les analyses en aval de pics avec Homer, bedtools 10, ou ne importe quel logiciel préféré. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig1highres.jpg" /> Figure 1. Captures d&#39;écran du logiciel montrant comment mettre en place des expériences de ChIP automatisées sur le IP Compact-Star. Le logiciel offre la possibilité de choisir la quantité d&#39;échantillons par cycle ainsi que pour modifier les paramètres expérimentaux clés (Anticorps revêtement, IP et lavages ) en fonction des besoins du chercheur. La procédure automatisée permet de tester différentes conditions en parallèle (par exemple, différents types et quantités d&#39;anticorps, différents types et quantités de cellules et même différente types et quantités de billes magnétiques dans la même série. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig2highres.jpg" /> Figure 2. Captures d&#39;écran du logiciel montrant comment mettre en place la préparation de la bibliothèque automatisée pour le séquençage de prochaine génération en utilisant le kit de la bibliothèque dans le système d&#39;automatisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<ol>
	<li>Dahl, J. A., Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(microChIP).">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (microChIP).</a> Nature Protocols. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Adli, M., Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+chromatin+profiling+from+limited+numbers+of+cells+using+nano-ChIP-seq.">Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq.</a> Nature Protocols. 6, 1656-1668 (2011).</li><li>Blecher-Gonen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states.">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nature Protocols. 8, 539-554 (2013).</li><li>Aldridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHT-ChIP-seq:+a+completely+automated+robotic+protocol+for+high-throughput+chromatin+immunoprecipitation.">AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation.</a> Genome Biology. 14, 124 (2013).</li><li>Farias-Hesson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+library+preparation+for+high-throughput+DNA+sequencing+platforms.">Semi-automated library preparation for high-throughput DNA sequencing platforms.</a> Journal of Biomedicin., &amp; Biotechnology. 2010, (2010).</li><li>Callejas, S., Alvarez, R., Benguria, A., Dopazo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AG-NGS:+a+powerful+and+user-friendly+computing+application+for+the+semi-automated+preparation+of+next-generation+sequencing+libraries+using+open+liquid+handling+platforms.">AG-NGS: a powerful and user-friendly computing application for the semi-automated preparation of next-generation sequencing libraries using open liquid handling platforms.</a> BioTechniques. 56, 28-35 (2014).</li><li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data.">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25, 1952-1958 (2009).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137 (2008).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities.">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38, 576-589 (2010).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 26, 841-842 (2010).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22, 1813-1831 (2012).</li></ol>

The authors of this article, at the time of its writing, are employed by Diagenode S.A. and Diagenode, Inc., the manufacturer of the automated system described.

Immunoprécipitation de la chromatine suivie par séquençage est maintenant une procédure standard. Voici un protocole de ChIP-seq automatisé qui peut générer des profils épigénétiques de la chromatine avec aussi peu que 10 000 cellules de matériau de départ est présenté. Automatisation puce et préparation de la bibliothèque des essais permet la standardisation de la procédure d&#39;optimisation de la puce et de réduire la variabilité expérimentale. Le système de manipulation de liquides présentée ici élimine bon nombre des procédures manuelles associées avec puce réduire les mains sur le temps de seulement 30 min, minimise la perte échantillon et permet précise ChIP-seq avec seulement quelques picogrammes d&#39;entrée bibliothèque. Afin de réaliser des expériences de ChIP-seq automatisés succès, il est également crucial d&#39;utiliser des préparations de la chromatine cisaillées de haute qualité et des anticorps de qualité puce suivants dans chaque expérience Le système utilise la technologie à base de billes magnétiques et offre une flexibilité de changer principaux paramètres expérimentaux tels que l&#39;incubation temps pour la couche d&#39;anticorpsING et étapes d&#39;immunoprécipitation ou la modification des conditions de lavage permettant au chercheur de mener toutes les expériences nécessaires pour l&#39;optimisation de ChIP-seq. Le système automatisé est une plate-forme «ouverte» qui permet également de comparer plusieurs réactifs en parallèle pour l&#39;optimisation des conditions expérimentales pour chaque lignée cellulaire individuelle et anticorps et permet la comparaison directe de différents types et concentrations de la chromatine, anticorps différents et même différents types de magnétique perles. Une des limitations du système automatisé est la nécessité d&#39;automatiser les protocoles des volumes qui varient de 5 ul à 200 ul. Cependant, la miniaturisation des expériences dans cette plate-forme automatisée permet également la réduction des coûts dans les réactifs. En plus des protocoles décrits dans la présente étude, le système est adaptable et automatise une variété d&#39;autres applications basées sur des billes magnétiques, tels que une immunoprécipitation égalementnd capture de l&#39;ADN méthyle (technologies MeDIP et MethylCap), une immunoprécipitation d&#39;ADN hydroxylmethylated (de hMEDIP), immunoprécipitation de la chromatine séquentiel (ReChIP), immunoprécipitation ARN (ARN-IP), la conversion au bisulfite, et des essais de purification de l&#39;ADN.

Comme séquençage de nouvelle génération (NGS) technologies sont devenues monnaie courante et plus accessible, la principale méthode pour la cartographie du génome entier des interactions protéine-ADN est maintenant immunoprécipitation de la chromatine suivie d&#39;une détection NGS (ChIP-seq), qui permet la découverte du facteur de transcription des sites ou des motifs de modifications des histones contraignant. ChIP-seq est avantageux de fournir des données à haut débit de l&#39;ensemble du génome qui peut être utilisé pour l&#39;analyse quantitative et qualitative des interactions protéine-ADN par la mesure des fragments d&#39;ADN enrichies. Cependant, il ya quelques inconvénients dans les expériences de ChIP-seq standard tels que la difficulté à obtenir suffisamment de matière pour créer une bibliothèque de séquençage. expériences de puce sont divisés en six étapes de base y compris les régions de liaison 1) protéine-ADN de réticulation 2) préparation de l&#39;échantillon qui comprend la lyse des cellules et le cisaillement de la chromatine par sonication, 3) formation des complexes immuns,4) la précipitation des complexes immuns, 5) le lavage des complexes immuns, et 6) l&#39;élution du matériau enrichi et analyse par qPCR et END. Le succès d&#39;un essai de ChIP dépend de trois facteurs principaux: une bonne préparation de la chromatine, la quantité d&#39;antigène dans l&#39;échantillon original, et la spécificité et d&#39;affinité de l&#39;anticorps pour son antigène correspondant. Une limitation importante est la nécessité de grandes quantités de départ du nombre de cellules afin d&#39;obtenir suffisamment d&#39;ADN enrichi pour créer une bibliothèque de séquençage. Pour les scientifiques qui travaillent avec des quantités limitées des échantillons, tels que des échantillons de biopsie ou de sous-populations de cellules, des expériences de ChIP-seq sont très difficiles. Des études récentes ont montré que des essais ChIP-seq peuvent être effectuées lorsque vous travaillez avec une faible quantité de cellules 1, 2. Diagenode a développé un système de manipulation de liquides robotisé qui peut automatiser entièrement expériences ChIP-seq quand on commence avec un nombre limité de cellules. Automation fournitde nombreux avantages par rapport à la préparation manuelle des échantillons de puce suivants car il diminue l&#39;erreur humaine, réduit la variabilité, et réduit le coût expérimental. Protocoles semi-automatiques pour immunoprécipitation de la chromatine et la préparation de la bibliothèque ont été signalés, mais aucune de ces études a montré des données lors de l&#39;utilisation des numéros de cellulaires faibles 3, 4, 5, 6. Dans cet article, un flux de production automatisé complète est décrite pour les deux immunoprécipitation et de préparation de la bibliothèque dosages chromatine dans un système de manipulation de liquide robotisé qui utilise une technologie à base de billes magnétiques et qui peut traiter plusieurs paramètres dans l&#39;optimisation de protocole. Ici, les expériences de ChIP-seq automatisés ont été effectués avec succès sur un nombre limité de cellules dans le but de simplifier, normaliser, et de fournir une solution fiable pour étudier les profils épigénétiques dans de petites populations de cellules. Le protocole de ChIP automatisé décrit dans le présent document a été optimisé sur des cellules HeLa en utilisant des anticorps histones spécifiques et réactifs but le flux de travail peut être adaptée à d&#39;autres lignées cellulaires et d&#39;anticorps avec optimisation expérimentale correspondante.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="917">
	<tbody>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:333px;">Product Description</td>
			<td style="width:111px;">Company</td>
			<td style="width:107px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:367px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">PBS&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Formaldehyde 37%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">1,25M Glycine Solution</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer iL1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer iL2</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Shearing Buffer iS1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01020010</td>
			<td>Component of the ideal ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Protease Inhibitors Mix (200x)</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">HBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14175-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Lysis Buffer tL1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ChIP Buffer tC1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td>Component of the Auto True Micro ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ideal ChIP-seq kit</td>
			<td>Diagneode</td>
			<td>C01010051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">ChIP-Buffer H</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td>Component of the Auto Histone ChIP-seq kit</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto Histone ChIP-seq kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto True Micro ChIP kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K79me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15310068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K27me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K4me3 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K4me2 polyclonal antibody-Classic</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9ac polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9/14ac polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K36me3 polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">H3K9me3 polyclonal antibody-Premium</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Rabbit IgG</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Protein-A coated paramagnetic beads</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C01010020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Auto IPure</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C03010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">MicroChIP DiaPure columns</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C03040001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Universal SyberGreenMaster Mix 1.25ml</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>DMMLD2D100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Quant-IT dsDNA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Sample Preparation kit fro Genomic DNA</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-121-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina True-seq kit ChIP library Prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>IP-202-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">MicroPlex Library Preparation Kit</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C05010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Agencourt AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Library prep Quantification kit</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">IP-Star Compact&#160; Automated System</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B03000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Bioruptor Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Bioruptor Pico</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Qubit system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Illumina Hiseq systems</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automating chip-seq experiments to generate epigenetic profiles on 10,000 hela cells

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq has been used for mapping protein-DNA interactions and allocating histones modifications. The procedure is tedious and time consuming, and one of the major limitations is the requirement for high amounts of starting material, usually millions of cells. Automation of chromatin immunoprecipitation assays is possible when the procedure is based on the use of magnetic beads. Successful automated protocols of chromatin immunoprecipitation and library preparation have been specifically designed on a commercially available robotic liquid handling system dedicated mainly to automate epigenetic assays. First, validation of automated ChIP-seq assays using antibodies directed against various histone modifications was shown, followed by optimization of the automated protocols to perform chromatin immunoprecipitation and library preparation starting with low cell numbers. The goal of these experiments is to provide a valuable tool for future epigenetic analysis of specific cell types, sub-populations, and biopsy samples.

Optimisation expériences ChIP-seq automatisés pour huit marqueurs d&#39;histones différents Afin de développer et de valider les protocoles de ChIP automatisés, des anticorps de qualité ChIP-seq qui étaient auparavant validés dans le manuel expériences ChIP-Seq succès (données non présentées) ont été sélectionnés. Les anticorps de qualité ChIP-seq suivants ont été choisis pour cette étude: anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, -H3K9 / 14ac, -H3K36me3 et -H3K9me3. La spécificité de tous les anticorps de qualité ChIP-seq a déjà été confirmé par dot blot, des réseaux de peptides et des expériences de Western Blot (données non présentées). Pilot expériences ChIP-qPCR avec des quantités croissantes d&#39;anticorps ont été effectués afin de déterminer la sensibilité des anticorps (figure 3). qPCR avec au moins deux positifs et deux cibles témoins négatifs ont été analysés et les profils avec enrichissements de positif plus négative cible plus élevés que quintuplé sont qualifiés pour le séquençage exper<html> modes de. Il est important de réaliser des expériences de puce et-seq avec une haute qualité de la chromatine cisaillé. Toutes les expériences de ChIP présentés dans cette publication ont été réalisées avec la chromatine frais. Il est également possible de congeler les cellules fixées à -80 ° C et procéder à la préparation de la chromatine et de cisaillement sur un autre jour. Cependant, la chromatine préparé à partir de cellules fixées congelés peuvent se comporter différemment de la chromatine fraîchement préparés et donc des conditions de sonication peuvent avoir besoin d&#39;être optimisé pour chaque préparation chromatine. Lorsque l&#39;on travaille avec différents types de cellules, des tampons de cisaillement avec différentes compositions détergentes (SDS) peuvent être utilisés. Les types de cellules telles que des lignées de cellules primaires ou des cellules cultivées en suspension sont des cellules difficiles à cisaillement et nécessiteront de fortes concentrations de SDS (1%), tandis que des lignées cellulaires qui sont faciles à cisaillement telle que HeLa, il faudra concentrations de SDS faible (0,1%) dans la tampons de cisaillement. res.jpg &quot;/&gt; Figure 3. Validation des anticorps ChIP de qualité en utilisant le système d&#39;automatisation. Puce a été effectuée avec anti-H3K79me3, -H3K27me3, -H3K4me3, -H3K4me2, -H3K9ac, H3K9 / 14ac, -H3K36me3 et -H3K9me3 anticorps polyclonaux de lapin sur la tonte de la chromatine 1 million de cellules HeLa-S3 en fonction des modifications des histones. Protocoles ChIP automatisés avec 200 pi volumes de travail ont été utilisés dans l&#39;instrument d&#39;automatisation pour des expériences de titrage d&#39;anticorps. Des quantités d&#39;anticorps de 1, 2, 5 et 10 mg ont été testées par expérience de puce et 2 ug IgG ont été utilisés comme contrôle négatif dans chaque expérience. Enrichissements ont été évalués par qPCR. Les résultats sont présentés en tant que% de l&#39;entrée (la quantité relative d&#39;ADN immunoprécipité par rapport à l&#39;ADN d&#39;entrée après analyse qPCR). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Après la validation et la détermination optima<html> l quantités d&#39;anticorps ChIP de qualité à utiliser dans le système d&#39;automatisation, des expériences de ChIP-seq automatisés ont été effectués afin de générer des profils de séquençage pour chaque modification d&#39;histone (Figure 4). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig4highres.jpg" /> Profils ChIP-seq 4. histones Figure générés par des expériences de ChIP-seq automatisés. La figure montre les profils de ChIP-seq dans différentes régions génomiques pour H3K4me3, H3K9ac et H3K9 / 14acH3K4me2 H3K79me3 et H3K36me3. 4A montre la distribution de pointe le long de la complète X -chromosome et 4B la distribution dans une région de 75 kb entourant le gène de la GAPDH. 4C montre les profils de H3K27me3, H3K36me3 et H3K4me3 dans une région de 500 kb qui entoure le gène Myt1 et 4D montre la répartition des H3K9me3 dans un ZNF12 environnante 200 de la région kb.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Histones profils épigénétiques pour six différentes modifications des histones associées à l&#39;expression de gènes ont été générés (H3K4me3, H3K9ac, H3K9 / 14ac, H3K4me2, H3K79me3 et H3K36me3). La figure 4A montre profils ChIP-Seq long du chromosome X pour les différents marqueurs d&#39;histones. La corrélation hautement pic observé entre les profils des histones six différentes indique les capacités du système automatisé pour générer des données précises et fiables. Figure 4B, 4C et 4D montrent la répartition des pics pour les différentes modifications des histones dans les régions génomiques spécifiques. Automatisés expériences d&#39;immunoprécipitation de la chromatine bas pour 200 cellules La quantité minimum de cellules qui peut être utilisé dans des expériences de ChIP dépend de la qualité de la chromatine, la specificity et la sensibilité de l&#39;anticorps et l&#39;abondance de la modification des histones ou de la protéine étudiée. Sélection de bons anticorps de qualité ChIP-seq est important lorsque l&#39;on travaille avec des quantités limitées de l&#39;échantillon et la sélection de réactifs optimales et différents transporteurs améliore l&#39;efficacité de la récupération de l&#39;ADN et contribuer à la réussite de l&#39;expérience de puce. Pour déterminer le montant minimum de cellules que le protocole de ChIP automatisé peut traiter, des quantités différentes de la chromatine, anticorps, et des billes magnétiques ont été testés dans le système automatisé IP-Star utilisant des réactifs de ChIP spécifiquement optimisé pour fonctionner avec de faibles quantités de la chromatine. Tout d&#39;abord, la chromatine de 10 000 cellules a été traité par ultrasons comme décrit dans le protocole. Les résultats ChIP ont été confirmés par PCR quantitative (figure 5A) qui montre des enrichissements significatifs avec H3K4me3 anticorps dans les régions de contrôle positif et un signal négligeable dans les régions de contrôle négatif. A titre de comparaison et la preuve de cohérence, additionadonnées de l obtenus avec H3K27ac, H3K9me3, et des anticorps H3K27me3, en utilisant 10 000 cellules est fourni. Expériences ChIP automatisés ont été effectués alors pour démontrer les capacités du système automatisé de travailler avec de faibles quantités de cellules en utilisant le même anticorps H3K4me3. La puce automatisé bien performé, démontré par une série de dix réactions IP qui étaient reproductibles et très comparables avec les résultats ChIP manuelles (figure 5B). Expériences manuelles et automatisées ont été réalisées et les avantages des protocoles automatisés ont été observés dans une expérience à réduire la variabilité (figure 5C). <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52150/52150fig5highres.jpg" /> Figure 5. Optimisation des expériences puce et Auto puce sur 10 000 cellules expériences ChIP manuelles ont été effectuées sur 10 000 cellules et en utilisant 0,25 pg de H3K4me3, 0,1 pg de H3K27ac, 0,5 pg de H3K9me3 et 0,25 ug d&#39;anticorps H3K27me3. Des quantités identiques de l&#39;IgG de lapin ont été utilisés comme contrôle. La PCR quantitative a été réalisée avec des amorces pour les deux loci positif et deux loci négatif pour chaque test de la puce. La figure 5A montre la récupération, exprimée en pourcentage de l&#39;entrée (la quantité relative d&#39;ADN immunoprécipité par rapport à l&#39;ADN d&#39;entrée après analyse qPCR). La figure 5B montre 10 réactions ChIP se exécutent sur le IP-Star Compact à l&#39;aide 0,25 pg H3K4me3 anticorps polyclonaux et 0,25 pg d&#39;IgG de lapin anticorps de contrôle négatif. Puis l&#39;analyse qPCR a été réalisée avec des amorces pour le promoteur positif loci EIF4A2 et GAPDH TSS et de la myoglobine loci négative exon2 et Sat2. La figure montre la récupération, exprimé en pour cent de l&#39;entrée (quantité relative d&#39;ADN immunoprécipité par rapport à l&#39;ADN d&#39;entrée après analyse qPCR). La figure 5C montre les données H3K4me3 puce 10 manuelles expériences de jetons par rapport aux 10 expériences de ChIP automatisés. Les barres d&#39;erreur représentent s<html> TANDARD écarts de chacun des dix répétitions. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig5large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Afin de comprendre la sensibilité des protocoles de ChIP automatisés, des expériences ont été réalisées en utilisant une quantité de cellules qui variait de 100 000 à 200 cellules vers le bas par IP. L&#39;anticorps anti-H3K27me3 a été utilisé en tant que ce est une modification d&#39;histone très commun. L&#39;utilisation d&#39;autres anticorps histones ou non histones cellules peut nécessiter plus ou moins, en fonction de l&#39;abondance de l&#39;épitope et la qualité de l&#39;anticorps. Les expériences ont été validés par PCR quantitative et il a été observé que, en réduisant les montants de perles et anticorps fond dans les expériences est réduite permettant résultats ChIP-qPCR fructueuses avec aussi peu que 200 cellules anticorps (figure 6). iles / ftp_upload / 52150 / 52150fig6highres.jpg &quot;/&gt; Figure 6. automatisé tests de puce sur 200 cellules. Cellules HeLa-S3 et anticorps dirigés contre H3K27me3. Chromatine a été cisaillé à partir de 1 million de cellules et des dilutions en série de cette chromatine (de 100 000 à 200 équivalent cellulaire) ont été utilisés par la réaction de la puce. 1 pg de H3K27me3 et 10 pi de protéines billes magnétiques A enduit ont été utilisés sur l&#39;expérience 100 000 cellules, 0,5 pg de H3K27me3 et 10 ul de billes sur 10 000 et 1 000 cellules, et 0,25 pg de H3K27me3 et 5 pi de perles avec 500 et 200 cellules. 1 ug et 0,5 ug d&#39;IgG de lapin ont été utilisés comme anticorps témoin négatif lors de la réalisation des expériences avec 100 000 cellules et 1 000 cellules, respectivement. La figure 6A représente le taux d&#39;occupation des gènes TSH2B et GAPDH en% par rapport à l&#39;entrée. La figure 6B montre occupation relative des TSH2B par rapport au contrôle GAPDH négatif région génomique. L&#39;analyse en aval des résultats ChIP-Seq10 000 cellules Afin d&#39;évaluer la qualité globale des expériences automatisé ChIP-seq avec un faible nombre de départ de cellules, automatisées essais ChIP-seq ont été effectuées avec 0,25 pg de l&#39;anticorps H3K4me3 sur 10 000 cellules HeLa et des expériences de puce sur 100 000 cellules HeLa-S3 ont été utilisés comme témoin positif pour l&#39;expérience. Les bibliothèques automatisées ont été préparés en utilisant la bibliothèque Microplex kit de préparation des réactifs adaptés aux bibliothèques préparés avec des quantités faibles d&#39;ADN. Notez que même si il est possible d&#39;effectuer puce expériences réussies automatisés avec moins de 10 000 cellules, les quantités d&#39;ADN tiré vers le bas ne sera pas suffisant pour préparer les bibliothèques en utilisant les réactifs du kit. Génération de cluster et le séquençage ont été réalisées conformément aux instructions du fabricant. La bioinformatique analyses après les résultats exceptionnels séquençage montrent des échantillons de copeaux faible nombre de cellules. L&#39;ensemble de données de 30 pg (à 10 000 cellules de matière de départ correspondante<html> ) Contiennent un faible bruit de fond et des pics d&#39;enrichissement très fiables qui sont confirmés à la fois par le pg ensemble de données 300 (correspondant à 100 000 cellules de la matière de départ) et l&#39;ensemble de données H3K4me3 généré par le Broad Institute pour le projet ENCODE qui a été utilisé comme une référence externe. Il est important de noter le rapport des données 40 de chevauchement Haut, qui se réfère à une méthode standard utilisée dans le projet ENCODE 11, dans lequel la puce-seq est considéré comme reproductible si la comparaison de deux ensembles de données il ya au moins un chevauchement des meilleurs 40% 80% des pics selon leur indice de pointage de signification. L&#39;ensemble de données de 30 pg répond à ces critères par rapport à la fois à l&#39;ensemble de données pg 300 (compte tenu de toutes ses sommets, et pas seulement le meilleur 40%) et les données Broad Institute (tableau 1). L&#39;ensemble de données de 300 pg montre des pics presque identiques aux données Broad Institute avec un Top 40 taux de recouvrement de 98% (figure 7). ighres.jpg &quot;/&gt; Figure 7. essais de puce et génération bibliothèque sur 10 000 cellules expériences ChIP-Seq ont été générées sur 10 000 et 100 000 cellules HeLa-S3 utilisant un anticorps H3K4me3 (0,25 ug / ul). Les 35 balises pb ont été cartographiés au génome humain avec l&#39;alignement ELAND. Durant le pic ultérieure appelant SICER pourrait identifier de manière fiable les enrichissements du faible nombre de cellules ainsi que des millions de cellules. Les ensembles de données ont été analysées et comparées entre elles et avec les données de référence produites par le Broad Institute. Les échantillons de cellules faibles sont conformes et ont de très grande similarité. L&#39;échantillon de 30 pg remplit les critères ENCODE 11 (min. 80% du top 40% des pics doit chevaucher). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52150/52150fig7large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/52150/52150table1.jpg" /> Tableau 1. </strong&gt;

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Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

Automatisation expériences ChIP-seq pour générer des profils épigénétiques sur 10 000 cellules HeLa

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.6K vues.  Diagenode S.A.. Methods for mapping in vivo protein-DNA interactions are becoming crucial for every aspect of genomic research but they are laborious, costly, and time consuming. Here a commercially available robotic liquid handling system that automates chromatin immunoprecipitation for mapping in vivo protein-DNA interactions with limited amounts of cells is presented.

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Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

Injection d&#39;un. Embryons stephensi pour générer le paludisme résistant à moustiques

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Recherche

Biologie

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Génération de haute qualité Immunoprécipitation de la chromatine Patron de l&#39;ADN pour le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induction et analyse des épithéliale à mésenchymateuses transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Génération de Myospheres De CSEh par Reprogrammation épigénétique

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human iPS cells (iPS-RPE), and fetal RPE. The protocols include collection of RNA for analysis by microarray, and the analysis of microarray data to identify miRNAs that are differentially expressed among three cell types. The methods for culture of iPS cells and fetal RPE are explained. The protocol used for differentiation of RPE from human iPS is also described. The RNA extraction technique we describe was selected to allow maximal recovery of very small RNA for use in a miRNA microarray. Finally, cellular pathway and network analysis of microarray data is explained. These techniques will facilitate the comparison of the miRNA profiles of three different cell types.

The microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, retinal pigment epithelium (RPE) derived from human induced-pluripotent stem (iPS) cells (iPS-RPE), and fetal RPE, were compared.

Profils MicroRNA d&#39;expression de cellules iPS humaines, l&#39;épithélium pigmentaire rétinien Derived From iPS, et fœtale épithélium pigmentaire rétinien

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making malaria control an omnipresent problem in tropical countries. The emergence of insecticide resistant populations warrants the exploration of novel drug target pathways and compounds for vector mosquito control. Epigenetic drugs are well established in cancer research, however not much is known about their effects on insects. This study provides a simple protocol for examining the toxicological effects of 3-Deazaneplanocin A (DZNep), an experimental epigenetic drug for cancer therapy, on the malaria vector, Anopheles gambiae. A concentration-dependent increase in mortality and decrease in size was observed in immature mosquitoes exposed to DZNep, whereas the compound reduced the fecundity of adult mosquitoes relative to control treatments. In addition, there was a drug-dependent decrease in S-adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase activity in mosquitoes following exposure to DZNep relative to control treatments. These protocols provide the researcher with a simple, step-by-step procedure to assess multiple toxicological endpoints for an experimental drug and, in turn, demonstrate a unique multi-prong approach for exploring the toxicological effects of water-soluble epigenetic drugs or compounds of interest against vector mosquitoes and other insects.

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

Les analyses toxicologiques pour Effets d&#39;essais d&#39;un médicament épigénétique sur le développement, la fécondité et de la survie du paludisme moustiques

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

Une procédure ChIP-Seq semi-automatisée pour les études épigénétiques à grande échelle

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe a new strategy that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues, to generate mammalian pluripotent cells. Two main steps are required. In the first step, adult mature (terminally differentiated) cells are exposed to the epigenetic eraser 5-aza-cytidine to drive them into a pluripotent state. This part of the protocol was developed, based on the increasing understanding of the epigenetic mechanisms controlling cell fate and differentiation, and involves the use of the epigenetic modifier to erase cell differentiated state and then drive into a transient high plasticity window.
In the second step, erased cells are encapsulated in polytetrafluoroethylene (PTFE) micro-bioreactors, also known as Liquid Marbles, to promote 3D cell rearrangement to extend and stably maintain the acquired high plasticity. PTFE is a non-reactive hydrophobic synthetic compound and its use permits the creation of a cellular microenvironment, which cannot be achieved in traditional 2D culture systems. This system encourages and boosts the maintenance of pluripotency though bio-mechanosensing-related cues.
The technical procedures described here are simple strategies to allow for the induction and maintenance of a high plasticity state in adult somatic cells. The protocol allowed the derivation of high plasticity cells in all mammalian species tested. Since it does not involve the use of gene transfection and is free of viral vectors, it may represent a notable technological advance for translational medicine applications. Furthermore, the micro-bioreactor system provides a notable advancement in stem cell organoid technology by in vitro re-creating a specific micro-environment that allows for the long-term culture of high plasticity cells, namely as ESCs, iPSCs, epigenetically erased cells and MSCs.

We here present a method that combines the use of chemical epigenetic erasing with mechanosensing-related cues to efficiently generate mammalian pluripotent cells, without the need of gene transfection or retroviral vectors. This strategy is, therefore, promising for translational medicine and represents a notable advancement in stem cell organoid technology.

Une stratégie en deux étapes qui combine la modification épigénétique et les indices biomécaniques pour générer des cellules pluripotentes de mammifères

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

Automatisation de la quantification agrégée chez Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Utilisation de biopsies cutanées pour générer des podocytes dérivés de patients

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the glomerulus. Mutations in podocyte-specific genes can cause focal segmental glomerulosclerosis (FSGS), and podocytes are also affected in many other primary and secondary nephropathies. Due to their differentiated nature, primary cell culture models are limited for podocytes.&#160;Therefore, commonly conditionally immortalized cells are used. However, these conditionally immortalized podocytes (ciPodocytes) have several limitations: the cells can dedifferentiate in culture, especially when they reach confluency, and several podocyte-specific markers are either only slightly or not expressed at all. This brings the use of ciPodocytes and their applicability for physiological, pathophysiological, and clinical reach into question. Here, we describe a protocol for the generation of human podocytes-including patient-specific podocytes-from a skin punch biopsy by episomal reprogramming of dermal fibroblasts into hiPSCs and subsequent differentiation into podocytes. These podocytes resemble in vivo podocytes much better in terms of morphological characteristics, like the development of foot processes and the expression of the podocyte-specific marker. Finally, yet importantly, these cells maintain patients&#39; mutations, resulting in an improved ex vivo model to study podocyte diseases and potential therapeutic substances in an individualized approach.

Pleins feux sur l’auteur : Génération de podocytes dérivés de patients à partir de biopsies cutanées  

This manuscript describes a two-step protocol to generate patient-specific podocytes from dermal fibroblasts via episomal reprogramming into human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and subsequent differentiation into podocytes.

Génération de podocytes dérivés de patients à partir de biopsies cutanées

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...