Nous tenons à remercier Tal Nawy et Martin Bayer pour leurs conseils sur l&#39;isolement de l&#39;embryon. MTR, VG, UG et CB conçu le matériel d&#39;isolation de l&#39;embryon. MTR, VG et CB ont développé le protocole d&#39;isolement de l&#39;embryon. MTR, VG et CB établi le protocole, isolés les embryons, et l&#39;embryon ADNc généré, VG réalisé la PCR, le MTR de coloration GUS, JJ des expériences du poisson. MTR, VG, CG et UG écrit le manuscrit. Ce travail a été financé par l&#39;Université de Zürich, une bourse de la Fondation de recherche Roche (à MTR), et des subventions de la Fondation nationale suisse (à UG et CB).

La procédure est résumée dans l&#39;organigramme de la figure 1. Le microcapillaires et la configuration instrumentale sont présentés dans la figure 2 et la figure 3, et les étapes typiques de l&#39;isolement de l&#39;embryon sont présentés dans la figure 4. 1. Matière et mémoire tampon Préparation 1.1 Silicon revêtement de verre microcapillaires <ol><li> Placez le microcapillaires dans un tube Falcon de 15 ml avec environ 5 ml de Sigmacote (Sigma) et inverser plusieurs fois. </li><li> Retirez la solution, placer le tube Falcon contenant les capillaires dans une feuille d&#39;aluminium et cuire au four pendant 3 heures à 60 ° C. Stocker à température ambiante. </li></ol> 1.2 Obtenir ~ 50-100 um de diamètre conseils microcapillaires <ol><li> Tirez 1 mm de diamètre capillaires en verre soit manuellement sur un bec Bunsen ou en utilisant un extracteur commercial (extracteur filament vertical ou micropipette extracteur). </li><li> Utiliser un diamantStylo à pointe ou une lame pour couper le bout du capillaire tiré pour créer l&#39;ouverture souhaitée. Sélectionnez les capillaires meilleure forme sous un microscope stéréo. L&#39;ouverture devrait être 50-100 um (Figure 2). </li></ol> 1.3 Préparation de la lame <ol><li> Siliconize lames propres en couvrant tous les puits avec Sigmacote (~ 1 ml / slide) pendant 5 min, retirer. Cuire 3 heures dans du papier d&#39;aluminium. Stocker à température ambiante. </li><li> Laver les lames microscopiques verre multi-puits pendant 10 min dans 10% SDS, 2 x 2 min dans de l&#39;eau sans nucléase (autoclave DEPC-DDH 2 O), 2 min dans de l&#39;éthanol à 70%, 2 min dans de l&#39;éthanol à 100%, air- sécher. Toutes les étapes sont effectuées dans des bocaux Coplin autoclave. Les diapositives peuvent être réutilisés plusieurs fois fournir un nettoyage en profondeur entre chaque utilisation. </li><li> Juste avant l&#39;embryon propagation d&#39;isolement ~ 0,5 ul de 10 mg / ml de sérum albumine bovine (BSA) avec une pipette sur toute la surface de chaque puits et séché à l&#39;air. </li></ol> 1.4 Microscope et la configuration capillaire &lt;ol&gt; <li> Utiliser un microscope inversé avec un 10x et 20x objectif de grossissement. Optimiser le contraste de lumière (embryons sont tout à fait transparent). </li><li> Placez un micromanipulateur pour maintenir le capillaire en verre à côté du microscope. Le verre capillaire est connecté à un micro-injecteur (figure 3A) ou à une pipette régulière P-200 via un tube en caoutchouc (Figure 3B, voir discussion pour une description détaillée de cette installation). </li><li> Placer le capillaire au-dessus de la lame de microscope à un angle de ~ 70 ° (figure 3) et régler la position d&#39;avoir l&#39;ouverture dans le champ de vision. </li><li> Juste avant l&#39;isolement de l&#39;embryon prendre et relâcher ~ 5-10 ul BSA (1 mg / ml) pour enrober le capillaire. </li></ol> 1,5 Tampons Le tableau 1 présente l&#39;isolement et la destination des tampons en fonction des applications en aval. <ol><li> Préparer ~ 1 tampon d&#39;isolement ml par échantillon fraîchement avant l&#39;utilisation et le garder sur la glace. </li><li> Préparer le tampon de destination dans un tube à faible liaison 0,5 ml Eppendorf sur la glace (applications moléculaires) ou sur une lame de microscope (applications cytologiques) dans une chambre humide. </li></ol> 2. Dissection de semences et d&#39;extraction de l&#39;embryon 2.1 Synchronisation de développement des semences <ol><li class="jove_content"> Émasculer fleurs et les garder 2 jours dans la chambre de croissance, tout en évitant le contact des pistils exposés avec d&#39;autres fleurs, alors les polliniser (par exemple 11). </li><li class="jove_content"> Testez le stade de développement sous vos conditions de croissance par étude microscopique des graines compensés. Grâce à nos conditions de croissance (16 heures de lumière à 21 ° C, 8 h obscurité à 18 ° C et 70% d&#39;humidité) de graines collectées 2,5 jours après la pollinisation (DAP) ont livré principalement 2-4 embryons cellulaires et les graines collectées 3,5 à 4 DAP a donné globulaire embryons. </li></ol> 2.2 Seed Dissection et Rupture <ol><li> Retirez le seeds 10-15 siliques (~ 2,5 DAP) sous une loupe binoculaire avec des pinces et des aiguilles à insuline. </li><li> Plonger les graines dans 20 tampon d&#39;isolement ul dans un tube Eppendorf 2 ml à fond rond placé sur la glace. </li><li> Écraser délicatement les graines avec un pilon en plastique (préalablement nettoyé avec 10% de SDS, rincé avec DEPC-DDH 2 O et lavé avec de l&#39;éthanol à 70%) pour libérer les embryons jusqu&#39;à ce que l&#39;extrait de pépins est trouble. La force à appliquer doit être déterminé par chaque utilisateur lors de son procès. </li><li> Rincer le pilon avec 300 pi de tampon d&#39;isolement pour laver le pilon et diluer l&#39;échantillon. </li><li> Spin-bas l&#39;extrait à 5000 g pendant 5 sec. Resuspendre doucement l&#39;extrait granulés par aspiration-et-vient 2-3 fois. </li><li> Filtrer l&#39;extrait avec une maille de nylon de 30 um (monté sur les adaptateurs de tubes, par exemple de PartecCelltricks). Rincez le filet avec un tampon d&#39;isolement supplémentaire de 200 ul. </li></ol> 3. Isolation des embryons 3.1 Préparation de la lame <ol> &lt;li&gt; Placez une lame multi-puits propre, BSA-couché et siliconé sur la scène du microscope inversé, remettre en suspension l&#39;extrait de graines filtrée par un léger pipetage de haut en bas et d&#39;une pipette 2 gouttes de 40-50 ul extrait de graines dans 1 ou 2 puits . Dépistage seulement 1 ou 2 gouttes à la fois empêche l&#39;évaporation de l&#39;échantillon. </li><li> Placer 50 pi de tampon d&#39;isolement frais (1 goutte de lavage st) dans un puits d&#39;une autre diapositive préparée comme avant. Gardez cette diapositive dans une chambre humide couverte pour éviter l&#39;évaporation. </li></ol> 3.2 Ecran, nettoyer, collecter <ol><li> Écran les gouttelettes d&#39;extrait de pépins pour les embryons au stade souhaité avec l&#39;objectif de grossissement de 10x. Si nécessaire, confirmez la scène avec un grossissement de 20x. Les embryons coulent généralement vers le bas de la glissière. </li><li> Retirer manuellement les débris autour de l&#39;embryon d&#39;une aiguille de tungstène, d&#39;une aiguille d&#39;insuline ou d&#39;un équipement similaire. </li><li> Déplacez le capillaire en verre près de l&#39;embryon à l&#39;aide du micromanipulateur, take l&#39;embryon avec aussi peu de solution possible. </li><li> Rassemblez plusieurs embryons (par exemple tous une gouttelette) et les libérer dans la chute de lavage 1er (demande moléculaire) ou dans un tampon de destination (applications cytologiques). Chaque tour de collecte doit être conservé dans les 5-10 min et embryons doivent être collectés dans un volume minimal (le volume total de tous les tours de collecte doit être &lt;5 pi). </li><li> Répéter le dépistage et la collecte jusqu&#39;à la quantité désirée d&#39;embryons est rassemblée dans la chute de lavage 1er (au centre, si possible, afin de faciliter souvenir). </li><li> Rappelez tous les embryons à la fois de la baisse de lavage (si des débris sont reportés, retirez-les avec une aiguille avant de souvenir). </li><li> Relâchez les embryons dans une goutte de lavage 2 ème de 50 pi. Répétez 3.2.6. </li><li> Relâchez les embryons dans le tampon de destination. Le transfert devrait impliquer seulement un contact, et non l&#39;immersion, de la pointe capillaire. </li><li> Remplacez le microcapilLary pour l&#39;échantillon suivant. </li></ol>

<ol>
	<li>Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+demethylation+of+repetitive+elements+during+seed+development+underlies+gene+imprinting.">Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting.</a> Science. 324, 1447-1451 (2009).</li><li>Muller, B., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinin+and+auxin+interaction+in+root+stem-cell+specification+during+early+embryogenesis.">Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis.</a> Nature. 453, 1094-1097 (2008).</li><li>Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+parent-of-origin+allelic+expression+in+Arabidopsis+thaliana+seeds.">Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds.</a> PLoS One. 6, 23687-23 (2011).</li><li>Xiang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+gene+expression+and+metabolic+network+dynamics+during+embryo+development+in+Arabidopsis.">Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).</li><li>Nawy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GATA+factor+HANABA+TARANU+is+required+to+position+the+proembryo+boundary+in+the+early+Arabidopsis+embryo.">The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 19, 103-113 (2010).</li><li>Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+triploid+endosperm+genome+of+Arabidopsis+adopts+a+peculiar,+parental-dosage-dependent+chromatin+organization.">The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization.</a> Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).</li><li>Autran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+epigenetic+pathways+control+parental+contributions+to+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis.</a> Cell. 145, 707-719 (2011).</li><li>Wohrmann, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+DNA+methylation-independent+imprinting+control+region+at+the+Arabidopsis+MEDEA+locus.">Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus.</a> Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).</li><li>Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+Flexibility+of+Genomic+Imprinting+during+Seed+Development.">Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development.</a> Plant Cell. 23, 16-26 (2011).</li><li>Rea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+DNA+methylation+of+imprinted+genes+in+Arabidopsis+endosperm.">Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm.</a> J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).</li><li>Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+WOX+genes+mediates+apical-basal+axis+formation+in+the+Arabidopsis+embryo.">Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo.</a> Dev Cell. 14, 867-876 (2008).</li><li>Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana+MEDEA+Polycomb+group+protein+controls+expression+of+PHERES1+by+parental+imprinting.">The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting.</a> Nature. 37, 28-30 (2005).</li><li>Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+chromosomes+in+Arabidopsis+are+organized+as+well+defined+chromocenters+from+which+euchromatin+loops+emanate.">Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).</li><li>Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+single+cells.">Transcriptome analysis of single cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).</li><li>Nodine, M. D., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+and+paternal+genomes+contribute+equally+to+the+transcriptome+of+early+plant+embryos.">Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos.</a> Nature. 482 (7383), (2012).</li><li>Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fusions:+beta-glucuronidase+as+a+sensitive+and+versatile+gene+fusion+marker+in+higher+plants.">fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.</a> EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).</li><li>Schmidt, A., W&#246;hrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Polycomb+group+protein+MEDEA+and+the+DNA+methyltransferase+MET1+interact+in+Arabidopsis+to+repress+autonomous+endosperm+development.">The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development.</a> Plant J. 73 (5), (1111).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous avons élaboré un protocole d&#39;isolement de l&#39;embryon qui est rapide, efficace, et peuvent être facilement transférées à d&#39;autres laboratoires. L&#39;équipement décrit ici se compose d&#39;un microscope inversé, un micromanipulateur, verre microcapillaires, un extracteur de filament vertical et un micro-injecteur (figure 3A). La configuration est similaire à celle décrite pour l&#39;isolement de cellules animales unique pour l&#39;analyse transcript...

L&#39;embryon de plantes à fleurs est entouré par l&#39;albumen, un tissu nutritif dérivé d&#39;un deuxième événement de la fécondation. Les deux embryon et de l&#39;endosperme sont entourés de plusieurs couches cellulaires de l&#39;enveloppe de la graine. Collectivement, ces tissus constituent une graine, qui se développent à l&#39;intérieur du fruit. Ainsi, les tissus et les analyses spécifiques des cellules d&#39;embryons d&#39;Arabidopsis sont fortement altérées en raison de leur inaccessibilité. Néanmoins, les embryons au stade tardif globulaires ou plus sont relativement bien prête à dissection manuelle en utilisant des aiguilles de tungstène fines au microscope stéréoscopique, ou en appliquant une légère pression sur la graine en utilisant une pince pour les extraire. Ces techniques ont été utilisées avec succès pour les analyses de profilage épigénome telles que l&#39;hybridation de puces à ADN, séquençage au bisulfite, ou de l&#39;ARN (par exemple 1-3) ou transcriptome. En revanche, les études d&#39;embryons au zygote jusqu&#39;au début du stade globulaire restent techniquement difficile. À ce jour, seules quelques études ont repLes analyses du transcriptome signalés auparavant sur ​​les jeunes embryons en utilisant soit microdissection laser-capture (LCM) de tissus embryonnaires de sections de semences fixe 4 ou extraction manuelle des embryons individuels de semences à l&#39;intérieur en utilisant des outils fines 5. Toutefois, l&#39;équipement LCM n&#39;est pas couramment disponibles et extraction de l&#39;embryon aux premiers stades manuel prend du temps et exige d&#39;excellentes compétences de dissection qui ne sont pas facilement transférables. En plus des analyses du génome entier, dans les analyses d&#39;expression génique in situ sont également difficiles à réaliser sur les jeunes, l&#39;ensemble du montage embryons d&#39;Arabidopsis. Dans une certaine mesure, les jeunes embryons peuvent être libérés sur des lames de microscope par une légère pression sur les graines et utilisés pour des essais de gène rapporteur ou la détection des protéines par coloration immunologique (voir par exemple 6,7). Cette technique, cependant, ne permet pas l&#39;isolement des embryons à haut débit, entravant ainsi les analyses quantitatives. Par conséquent, nous avons développé un protocole efficace et rapidepour l&#39;isolement précoce de l&#39;embryon à partir de graines d&#39;Arabidopsis qui est simple à mettre en place, facilement transférable et approprié pour une variété d&#39;applications en aval. Le principe de base est d&#39;écraser doucement graines - disséqué de jeunes siliques dans un tube Eppendorf à l&#39;aide d&#39;un pilon en plastique dans un tampon d&#39;isolement approprié. L&#39;extrait de graines est placée sous forme de gouttelettes sur un chariot multi-puits et est projeté pour la présence d&#39;embryons libérés au stade souhaité à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé. Les embryons sont recueillies à l&#39;aide d&#39;un verre MICROCAPILLAIRE attaché à un micro-injecteur ou une pipette de laboratoire standard. Pour les applications moléculaires, les embryons sont lavés deux fois par libération répétées dans des gouttes d&#39;un nouveau tampon d&#39;isolement avant de les transférer à la mémoire tampon de destination dans un volume minimal. Pour les applications cytologiques (dosages de rapporteur, immunomarquage, poisson), des étapes de lavage peuvent être omises. La méthode présente plusieurs avantages: (i) il donne 25-40 embryons ~ 45 min pour app cytologiquecations ou à 3-4 h pour les applications moléculaires (qui comprend les étapes de lavage), (ii) il permet l&#39;isolement des stades embryonnaires spécifiques, (iii) il est facilement transférable à d&#39;autres personnes et les laboratoires en raison de sa configuration simple, (iv) nécessite un équipement abordable pour la configuration de base qui se prête à la mise à niveau et (v) il a été utilisé avec succès pour diverses applications en aval telles que séquençage de l&#39;ARN 8, analyse méthylation de l&#39;ADN spécifique du gène 9, des dosages de rapporteur (10 et Raissig et al., en prép.) et le poisson (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux inédit, voir figure 5).

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>SIGMA </td>
 <td>SL2-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse OUT</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>10777-019</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>First- strand buffer</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>18064-022</td>
 <td>contained in Superscript II package</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Invitrogen (life technologies)</td>
 <td>18064-022</td>
 <td>contained in Superscript II package</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml </td>
 <td>New England Biolabs Inc.</td>
 <td></td>
 <td>Different suppliers will also work </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Thin wall Capillaries 1.0 mm</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>TW100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNA LoBind tube 0.5 ml</td>
 <td>Vaudaux-Eppendorf</td>
 <td>0030108.035</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTrics&Delta; 30 &mu;m</td>
 <td>PARTEC</td>
 <td>04-0042-2316</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5wells 10 mm diameter slides</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>63421-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde Solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F1635</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost Plus slide</td>
 <td>Thermo Fisher</td>
 <td>J1800AMNZ</td>
 <td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris</td>
 <td>Amaresco</td>
 <td>0497</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Applichem</td>
 <td>A2937</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycin</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>50050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDS pellets</td>
 <td>Roth</td>
 <td>CN30.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Pestle</td>
 <td>VWR</td>
 <td>431-0094</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microfine insulin syringes</td>
 <td>BD</td>
 <td>U-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D5758</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Schaurlau</td>
 <td>ET00102500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forceps N5</td>
 <td>Dumont</td>
 <td>0108-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioanalyzer Pico Chip</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>5067-1513</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope</td>
 <td>Nikon TMS (Japan),</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micromanipulator</td>
 <td>Leitz</td>
 <td></td>
 <td>Leica</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micomanipulator Post mount LH1 probe</td>
 <td>Leica microsystems</td>
 <td>39430101</td>
 <td>Different brand will also do the work</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vertical filament puller</td>
 <td>Sutter instrument</td>
 <td>P-20 model</td>
 <td>Other model are also suitable </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell Tram vario</td>
 <td>Vaudaux-Eppendorf</td>
 <td>5176.000.033</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bioanalyzer</td>
 <td>Agilent Technologies</td>
 <td>2100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qubit Fluorometer</td>
 <td>Invitrogen (life technologies</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

efficient and rapid isolation of early-stage embryos from arabidopsis thaliana seeds

Chez les plantes à fleurs, l&#39;embryon se développe au sein d&#39;un tissu nourricier - l&#39;endosperme - entouré par les téguments de la graine mère (ou tégument). En conséquence, l&#39;isolement des embryons de plantes à des stades précoces (1 cellule de stade globulaire) est techniquement difficile en raison de leur inaccessibilité relative. Dissection manuelle efficace à un stade précoce est fortement altérée par la petite taille des jeunes graines d&#39;Arabidopsis et l&#39;adhérence de l&#39;embryon aux tissus environnants. Nous décrivons ici une méthode qui permet l&#39;isolement efficace des jeunes embryons d&#39;Arabidopsis, produisant jusqu&#39;à 40 embryons en 1 h à 4 h, en fonction de l&#39;application en aval. Les embryons sont libérés dans le tampon d&#39;isolement d&#39;un peu écrasant 250-750 graines avec un pilon en plastique dans un tube Eppendorf. Un verre microcapillaire monté soit une pipette de laboratoire standard (par l&#39;intermédiaire d&#39;un tube de caoutchouc) ou un micro-injecteur à commande hydraulique est utilisé pour recueillir des embryons d&#39;un endroit gouttelettesd sur un chariot multi-puits sur un microscope optique inversé. Les compétences techniques requises sont simples et facilement transférables, et la configuration de base ne nécessitent pas de matériel coûteux. Embryons collectés sont adaptés à une grande variété d&#39;applications en aval telles que la RT-PCR, séquençage de l&#39;ARN, des analyses de méthylation de l&#39;ADN, l&#39;hybridation fluorescente in situ (FISH), immunologique, et des dosages de gènes rapporteurs.

Notre procédure d&#39;isolement de l&#39;embryon (figure 1) permet d&#39;isoler jusqu&#39;à 40 embryons à 4 heures si les lavages sont effectués, par exemple pour les applications moléculaires, ou en moins d&#39;une heure si lavages sont omis, par exemple pour des applications cytologiques. Figure 2 affiche haut et bas Conseils microcapillaires qualité et la figure 3 montre la configuration de la machine d&#39;isolement de l&#39;embryon. ...

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Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Nous rapportons une méthode simple et efficace pour isoler les embryons aux premiers stades de développement de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Graines. Embryons jusqu&#39;à 40 peuvent être isolés dans 1 h à 4 h, en fonction de l&#39;application en aval. Le procédé est approprié pour transcriptome, la méthylation de l&#39;ADN, l&#39;expression du gène rapporteur, et la fluorescence immunomarquage<em&gt; In situ</em&gt; Analyses d&#39;hybridation.

Isolation efficace et rapide des embryons à un stade précoce de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Graines

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

17.6K vues.  University of Zürich. Nous rapportons une méthode simple et efficace pour isoler les embryons aux premiers stades de développement de Arabidopsis thaliana Graines. Embryons jusqu'à 40 peuvent être isolés dans 1 h à 4 h, en fonction de l'application en aval. Le procédé est approprié pour transcriptome, la méthylation de l'ADN, l'expression du gène rapporteur, et la fluorescence immunomarquage In situ Analyses d'hybridation.

Vidéo: Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

Placer du facteur de croissance des billes recouvertes sur les premiers embryons de poulet scène

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

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Biologie

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

Isolement de protoplastes à partir de tissus de 14 jours d&#39;âge des plantules Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Assay immunoprécipitation de la chromatine des gènes spécifiques de tissus en utilisant des embryons de souris en début de

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolement et purification de la kinésine de Drosophila Embryons

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

La coloration histochimique de l&#39;<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cellule secondaire Elements mur

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Méthode normalisée pour la stérilisation à haut débit des graines d’Arabidopsis

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Etude spatio-temporelle de la dynamique d’ERL1 via l’imagerie confocale

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Pleins feux sur l’auteur : Méthodes basées sur l’image pour étudier les événements de trafic membranaire dans les cellules de la lignée stomatique  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

Méthodes basées sur l’image pour étudier les événements de trafic membranaire dans les cellules de la lignée stomatique

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

Une méthode améliorée pour mesurer les profils d’hydratation du pollen chez Arabidopsis thaliana

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is established between the interacting partners. Studies across a range of species have revealed that a series of molecular checkpoints regulate the pollen-stigma interaction to ensure that only compatible, generally intraspecific pollen is successful in effecting fertilization. In species that possess a 'dry stigma', such as the model plant Arabidopsis thaliana, the first post-pollination, prezygotic compatibility checkpoint is the establishment of pollen hydration. 
This phase of pollination is tightly regulated, whereby signals from the pollen grain elicit the release of water from the stigma, thus permitting pollen hydration. The ability to accurately measure and track pollen hydration over time is key to the design of experiments directed at understanding the regulation of this critical step in reproduction. Published protocols frequently utilize flowers that have been excised from the parent plant, maintained on liquid or solid media, and bulk pollinated. 
This paper describes a noninvasive, in vivo pollination bioassay that permits minute-by-minute hydration tracking of individual A. thaliana pollen grains at high resolution. The assay is highly reproducible, able to detect very subtle variations of pollen hydration profiles, and thus is suitable for the analysis of mutants that affect pathways regulating pollination. Although the protocol is lengthier than those described for bulk pollinations, the precision and reproducibility it provides, along with its in vivo nature, make it ideal for the detailed dissection of pollination phenotypes.

Pleins feux sur l’auteur : Un essai biologique d’hydratation du pollen in vivo à grain unique à haute résolution pour Arabidopsis thaliana  

An improved method to measure pollen hydration profiles in Arabidopsis thaliana is described here. The new method offers higher resolution, is noninvasive, and is highly reproducible. The protocol represents a new tool for a finer dissection of the processes that regulate the early stages of pollination.

Un essai biologique in vivo à haute résolution sur l’hydratation du pollen à grain unique pour Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...