Avec TRAP, nous pouvons étudier le traitement du développement à la résolution cellulaire. Nous utilisons des promoteurs spécifiques au type de cellule pour conduire une sous-unité ribosomique marquée, et à partir de là, nous pouvons isoler l’ARN polysome. Ce protocole donne un ARN de haute qualité, mais en quantités très limitées, par conséquent, des méthodes spécialisées pour les intrants ultra-faibles sont nécessaires pour produire de manière fiable des bibliothèques d’ARN de haute qualité.
TRAP est un outil idéal pour la recherche végétale, car de nombreux processus de développement reposent sur des voies de signalisation mécaniques et liées à la paroi cellulaire. Nous utilisons TRAP pour étudier la communication cellule-cellule dans la formation latérale des racines. Comme l’obtention d’ARN de bonne qualité ne s’est pas avérée aussi simple que nous l’avions prévu, nous espérons que cette instruction vidéo étape par étape augmentera l’applicabilité TRAP et aidera à promouvoir cette technique puissante.
Pour stériliser les lignes d’homozygotes propagées, étalez moins de 300 microlitres de graines uniformément sur 12 plats de Petri carrés de 12 centimètres, et empilez les plats sur un desiccator de 60 litres. Après la stérilisation du gaz pendant la nuit, laisser le gaz s’évaporer avant de recueillir les graines dans un tube de stockage de 50 millilitres. Avant le placage, diluer les graines stérilisées avec 0,1 % d’agar pour obtenir un millilitre de mélange de graines imbibées par assiette.
Pour plaquer le mélange de graines, utilisez des couvercles carrés de boîte de Petri pour créer un support de modèle laminé pour planter trois rangées de graines par plaque, et placez les plaques vides d’agar dans le support de modèle. Répartir uniformément un millilitre des graines imbibées sur trois rangées d’assiettes. Et placez les assiettes traitées dans des piles dans un flux laminaire, jusqu’à ce que les graines soient sèches.
Lorsque les graines sont collées à la surface de l’agar, fermez les couvercles et scellez chaque assiette avec du ruban micropore. Pour le traitement exogène des racines d’Arabidopsis avec un agent d’intérêt, préparez des bandes de papier de soie de 1,5 à 2 centimètres de large, de 10 centimètres de long. Faire tremper le papier de soie dans 10 micromolaires NAA, et utiliser des pinces à épiler pour appliquer une bande de papier de soie à chaque rangée de racines.
Ensuite, appuyez doucement sur les bulles d’air et videz l’excès de liquide de la plaque, avant d’étiqueter la plaque avec le temps. Au point d’extrémité expérimental approprié, utilisez des forceps pour enlever soigneusement les bandes de papier de soie de chaque plaque sans détacher les racines, et utilisez une lame chirurgicale pour couper une fois par rangée le long de la jonction shoot-root, en un seul coup déterminé. Utilisez des pinces à épiler pour glisser le long des racines de chaque rangée, pour recueillir les racines en trois faisceaux.
Et videz les racines dans un tube de 50 millilitres rempli d’azote liquide, pour obtenir un gel instantané. Lorsque tous les échantillons de racines par traitement ont été prélevés, décanter l’excès d’azote liquide à l’aide du couvercle du tube pour empêcher les racines de se renverser. Et placez le tube dans un récipient de faiseur, pour un stockage de 80 degrés Celsius.
Pour le broyage et l’homogénéisation des tissus, portez des gants de coton sous des gants de laboratoire standard et ajoutez le PMSF au tampon d’extraction polysome. Videz l’échantillon de tissu dans un mortier contenant de l’azote liquide et utilisez un pilon refroidi pour moudre soigneusement les tissus jusqu’à ce que tout le matériau apparaisse sous forme de poudre blanche. Lorsque tout le tissu a été broyé, ajouter cinq millilitres de tampon d’extraction polysome à l’échantillon, et mélanger rapidement les fragments de tissu congelé avec la poudre avant que le tampon gèle.
Dès que le mélange peut être transféré, vider le lisier dans un homogénéiseur en verre sur la glace, et utiliser deux millilitres supplémentaires de tampon d’extraction polysome pour rincer le mortier et le pilon. Moudre manuellement le lisier jusqu’à ce que l’extrait soit homogène. Ensuite, versez l’extrait de racine brute dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres sur la glace, et traiter l’échantillon suivant tel que démontré.
Pour la collecte totale de l’ARN, transférez 200 aliquots de microlitres de chaque échantillon brut dans des tubes de microcentrifugeuses propres, pré-refroidis et étiquetés. Pour enlever les parois cellulaires, les débris et les gros organites, centrifugez les échantillons et décantez le surnatant en tubes coniques frais et pré-refroidis pour une deuxième centrifugation. Pendant que les tubes tournent, aliquot 60 microlitres de perles magnétiques GFP par échantillon, dans un tube de 1,5 millilitre.
Et placez le tube sur un support magnétique, pour faciliter l’enlèvement des supernatants. Ensuite, lavez les perles deux fois en un millilitre de tampon de lavage à froid par lavage, et suspendez les perles dans 60 microlitres de tampon de lavage par échantillon. Immédiatement après la centrifugation, décanter le supernatant défriché en tubes étiquetés de 15 millilitres et ajouter 60 microlitres de perles lavées à chaque échantillon.
Ensuite, placez tous les échantillons horizontalement dans un seau à glace, pendant une incubation de deux heures avec basculement. À la fin de l’incubation, recueillir les perles sur un support magnétique sur la glace et ajouter le PMSF au tampon d’extraction du polysome restant. Après avoir jeté les supernatants, ajouter environ cinq millilitres de tampon d’extraction polysome aux échantillons, et re-suspendre les perles dans les échantillons avec inclinaison douce.
Rock les échantillons pendant 15 minutes sur le shaker sur la glace, suivie de deux lavages avec tampon de lavage frais sur l’aimant, comme démontré. Après le dernier lavage, transférer les échantillons dans un millilitre de tampon de lavage, dans un tube de 1,5 millilitre. Et recueillir les perles une fois de plus sur le support magnétique, pour enlever tous les supernatants.
Ensuite, placez les tubes sur la glace jusqu’à ce que tous les échantillons aient été traités. Pour le reconditionnement des fournitures du laboratoire, d’abord, rincer tout l’équipement dans les déchets chimiques. Laver à la main les mortiers, les pilons et les homogénéisants avec du savon, avant de rincer soigneusement chaque instrument.
Ensuite, placez l’équipement dans un contenant sécuritaire pour la chaleur et faites cuire les matériaux toute la nuit à plus de 220 degrés Celsius. Badigeonner tous les tubes de centrifugeuse de détergent, avant de placer les tubes sur un plateau autoclavé avec une jante et une hotte de fumée. Verser un millilitre de pyrocarbonate de diéthyle liquide et un litre de solution d’eau déionisée sur les tubes pendant trois à 18 heures.
Ensuite, recueillir la solution avant de stériliser le plateau de tubes dans l’autoclave. Ici, des plantes représentatives avec des signaux GFP sont affichées. La contre-coloration avec l’iodure de propidium marque les contours de la paroi cellulaire.
Les lignes correspondent au modèle de localisation de l’endoderme et au péricycle xylème-pôle. Dans ces mesures représentatives obtenues à partir de l’ARN polysome, la plupart des échantillons ont montré très peu de dégradation, avec des nombres d’intégrité d’ARN allant de neuf à dix. Dans ces graphiques, des traces de bibliothèques préparées avec succès peuvent être observées, mettant en évidence la robustesse de la procédure, malgré des volumes de réaction réduits.
Avant la production d’un ensemble de données couvrant le génome, l’ARN TRAP d’une expérience pilote peut être sondé par RTPCR quantitatif pour valider le succès du traitement et/ou les conditions expérimentales, ainsi que la spécificité des tissus. Dans cette analyse, l’essai de trois gènes auxin-sensibles a confirmé une induction réussie d’hormone après deux heures de traitement. Les profils génétiques marqueurs spécifiques aux tissus récupérés à partir des données de séquençage ont confirmé la spécificité de type cellulaire.
Suivez les bons conseils de pratique lorsque vous manipulez de l’ARN. Travaillez sur un banc stérile, nettoyez votre équipement avec une solution d’élimination de l’ARN, portez des gants et changez-les immédiatement lorsqu’ils sont contaminés. Assurez-vous de manipuler et de jeter de façon appropriée tous les produits chimiques et gaz toxiques qui ont été utilisés au cours de la procédure, en particulier le chlore phénol-DEPC et l’azote liquide.
Dans le portefeuille des études omiques, TRAP occupe un créneau important, et a déjà été utilisé pour répondre à de nombreuses questions biologiques, en particulier en biologie du développement, TRAP a un énorme potentiel.
