Le travail dans le laboratoire de Montgomery sur les réponses phytochrome dans les plantes est soutenue par la National Science Foundation (subvention aucune. MCB-0919100 au BLM) et les sciences chimiques, sciences de la terre et les sciences biologiques, Bureau des sciences fondamentales de l&#39;énergie, Bureau des sciences, Département américain de Energie (subvention aucune. DE FG02 91ER20021 au BLM). Nous tenons à remercier Melissa Whitaker pour l&#39;assistance technique pendant le tournage et la lecture critique du manuscrit, Stéphanie Costigan à l&#39;aide d&#39;expérimentation, le Dr Louis roi de l&#39;aide pour développer et optimiser Fluorescence-Activated tri cellulaire protocoles pour le tri des protoplastes d&#39;Arabidopsis et le Dr Melinda cadre de l&#39;aide pour confocale microscopie. Nous tenons à remercier Marlene Cameron pour l&#39;assistance de conception graphique et Bird Karen pour son assistance éditoriale.

1. Croissance des végétaux <ol><li> Confirmé UAS-GAL4 BVR X-GFP ligne de trappe enhancer isolée comme décrit 4 (Résumé, voir fig. 1) et les lignes de type sauvage ou parental sont semées sur le sol, soit ~ 2000 graines stérilisées par ligne. </li><li> Les plantes sont cultivées pendant 5 semaines sur le sol sous un éclairage blanc de 100 μmolm -2 s -1 à 22 ° C et une humidité de 70%. </li></ol> 2. Feuille de protoplastes Isolement (adapté de Denecke et Vitale 9) <ol><li> Pour isoler des protoplastes, préparer TEX tampon. Pour 1 litre TEX tampon, pesez les éléments suivants: 3.1 sels g B5 de Gamborg, 0,5 g 2 - (N-morpholino) éthanesulfonique (MES, 2,56 mM), 0,75 dihydraté g de chlorure de calcium (CaCl 2 .2 H 2 O, 6,75 mM), 0,25 g de nitrate d&#39;ammonium (NH 4 NO 3, 3,12 mM), 136,9 g de saccharose (0,4 M). Dissoudre les composants complètement en ~ 900 ml d&#39;déminéralisée, eau distillée (FD 2 O) et amener le pH à 5,7 avec une M KOH. Amener le volume final à 1 litre et stériliser par filtration avec une bouteille de 0,2 um-dessus du filtre relié à une pompe à vide. </li><li> Recueillir vert, feuilles saines à partir de plantes (~ 250 ml de feuilles tassées dans un bécher) et rincer avec ~ 40 ml ddH 2 O 4 fois, suivi d&#39;un rinçage à deux reprises avec deux stériles O. ddH L&#39;utilisation d&#39;un bistouri n ° 20, les feuilles coupées en fines lanières et diviser les tissus également en deux tubes de 50 ml en plastique stérile. Préparer 1x mélange de digestion des feuilles en ajoutant 5 ml de solution aliquote de la feuille d&#39;actions 10x digestion (10x solution stock de feuilles de digestion: dissoudre 2% p / v Macerozyme R-10, 4% p / v cellulase &quot;Onozuka&quot; R-10 dans TEX tampon, stériliser par filtration avec filtre de 0,2 um et congeler des aliquotes de 5 ml à -80 ° C) à 45 ml TEX tampon frais. Ajouter ~ 25 ml de mélange de la digestion 1x feuille par tube de 50 ml de couvrir tous les tissus de la feuille. </li><li> Vide d&#39;infiltrer les tissus foliaires au mélange de digestion dans des tubes ouverts pendant 1 heure à température ambiante en utilisant un dessiccateur à vide reliée à une pompe d&#39;eau suivie de 3 heures d&#39;incubation à température ambiante sur une bascule en agitant doucement. Tubes plafonné aux tissus de la feuille dans le mélange de feuilles de digestion 1x sont conservées enveloppées dans du papier aluminium pendant ce processus pour prévenir l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Après 3 heures, augmenter la vitesse de bascule pour ~ 2 minutes pour libérer protoplastes. Filtrer la suspension de protoplastes brut par deux couches de toile à fromage stérile pour enlever les débris et recueillir le filtrat dans un bécher de verre stérile. Filtrer le filtrat à travers une maille de nylon de 100 um stérile dans une boîte de Pétri stérile. Recueillir le débit à travers et le transférer sur un nouveau tube stérile de 50 ml. Utilisez environ 15-20 ml de tampon frais TEX pour laver les boîtes de Pétri stériles et de recueillir toute protoplastes adhérant à la surface. </li><li> Centrifuger le débit à travers l&#39;aide d&#39;un rotor à godets swing au 100xg à 10 ° C pendant 15 min (accélération 6, la décélération 0). </li><li> Retirer ~ 25 - 30 ml de liquide sous la couche de protoplastes flottant, qui contient des débris résiduels et granulés, avec une solution stérile 9 &quot;pipette Pasteur en verre relié à une pompe péristaltique sans déranger la couche de protoplastes flottant et laissant ~ 10 - volume de 15 ml. </li><li> Ajouter frais de tampon TEX à un volume final de 40 ml tout en douceur remise en suspension des protoplastes. </li><li> Répétez les étapes 2.5 à 2.7 deux fois pour enlever autant de débris cellulaires que possible. Le temps de centrifugation est réduit à 10 minutes dans la première répétition et à 5 minutes dans la répétition finale. </li><li> Aspirer protoplastes flottant avec une coupe, une pipette de transfert stérile ml dans un nouveau tube de 15 ml. Passez directement au tri ou de stocker dans l&#39;obscurité pendant 2 heures à 4 ° C jusqu&#39;à ce que le tri. </li></ol> 3. Tri protoplastes par le tri de cellules à fluorescence (FACS) <ol><li> Avant le tri, d&#39;examiner les protoplastes par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) en utilisant un laser 488-nm pour l&#39;excitation de confirmer l&#39;intégrité des protoplastes et la présence de fluorescence de la GFP dans la piscine de protoplastes. Les débris minimale est nécessaire pour éviter le colmatage de la buse de tri FACS. </li><li> Trier protoplastes isolés dans TEX tampon par FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences) en utilisant une buse de 200 um sur une tête tri macro au taux d&#39;événements entre 6000 et 15000, avec une pression du système d&#39;environ 9 psi suite d&#39;un protocole adapté 10. </li><li> Wild-type non-GFP protoplastes sont utilisés pour déterminer les seuils d&#39;autofluorescence. </li><li> Pour collecter des GFP-positives protoplastes, les cellules de tri en utilisant un refroidissement par air au laser argon (Spectra Physics Modèle 177, Newport Corporation, Irvine, CA) a fonctionné à 100 mW sur une ligne de 488 nm d&#39;argon pour identifier fluorescence de la GFP en utilisant une bande 530/30 Filtre passe. </li><li> Après la collecte de la GFP-positives protoplastes, examiner protoplastes triés par CLSM comme détaillé dans l&#39;étape 3.1. </li><li> Extrait d&#39;ARN total à partir de protoplastes triés en utilisant un Qiagen RNeasy Mini Kit végétales. ADNc peuvent alors être préparés à l&#39;hybridation comme décrit dans Affymetrix GeneChip ExprManuel d&#39;analyse ession Technique puis hybridées à ATH1 Arabidopsis Affymetrix génome entier. </li></ol> Les résultats représentatifs Nous avons détecté un nombre important de cellules positives pour la GFP dans le canal de la GFP par FACS (Fig. 2). Dans des essais d&#39;optimisation utilisant la GFP enhancer-trap les parents, les constitutivement exprimant la GFP en ligne, J0571, affiché ~ 17% à 24% GFP-positives protoplastes, alors que la ligne avec une expression vasculaire et cutanée, J1071, avait ~ 1,4% GFP-positives protoplastes (Tableau 1). Tri de 3 x 500 pi (~ 1,5 ml au total de suspension de protoplastes) de J0571 protoplastes pendant 1 h ~ a donné 100 000 GFP-positives protoplastes. Tri de 3 x 500 pi (~ 1,5 ml de suspension de protoplastes total) de J1071 protoplastes pendant 1,5 h ~ 3000 a donné GFP-positives protoplastes. Images confocale indique un rendement très élevé de protoplastes pour les échantillons à la fois J0571 et J1071 avant le tri a été effectué (Fig. 3C et 3E), et les fractions triées ne contenait que brillante fluorescente GFP-protoplastes (Fig. 3G et données non présentées). Cette constatation confirme que intacte GFP-positives protoplastes peuvent être triées par FACS. Les protoplastes non-GFP peuvent également être triés et collectés dans un canal séparé. Les protoplastes non-GFP servir un contrôle idéal négatif pour des analyses ultérieures puces pour détecter les changements spécifiques dans l&#39;expression des gènes lors de la réduction des niveaux holophytochrome. L&#39;extraction d&#39;ARN à partir de protoplastes isolés (1 ml) d&#39;ARN rendements en quantité suffisante pour la détection par fluorospectrometry (fig. 4). ARN isolé a été évaluée en utilisant un instrument NanoDrop (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) et quantifiés par NanoDrop 3.7.1 logiciel de quantification d&#39;ARN. Rendements d&#39;ARN à partir de pré-triés C24 de type sauvage protoplastes ou FACS-triés, GFP-positives protoplastes piège enhancer dépassé le minimum de 20 ng nécessaires pour une utilisation dans l&#39;ARN-étiquetage des dosages pour biopuces (tableau 2). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Enhancer Piège Ligne </td><td> % De la GFP-positives protoplastes </td><td> Nombre de protoplastes GFP triés </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 17,18% 24,06% ~ </td><td> 26400 ~ 36000 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> ~ 1,43% </td><td> 1000 ~ 1300 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Pourcentage de la GFP-positives protoplastes à partir de deux lignes de trappe Enhancer avant le tri et le nombre de GFP-positives protoplastes collectées en exécutant 500 pl de suspension de protoplastes à travers le trieur de cellules activé par fluorescence (FACSVantage, BD). <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Ligne des végétaux </td><td> ARN rendement (ng) </td></tr><tr><td> C24 WT </td><td> 12486.5 </td></tr><tr><td> J0571 </td><td> 60 </td></tr><tr><td> J1071 </td><td> 71,5 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Rendement de l&#39;isolement d&#39;ARN à partir de protoplastes. L&#39;ARN a été isolé à partir de pré-triés C24 de type sauvage ou triés GFP-positives protoplastes à partir de deux lignes de trappe enhancer et quantifiés. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. GAL4 enhancer-trap à base d&#39;induction de biliverdine réductase (BVR) expression dans des plantes transgéniques d&#39;Arabidopsis thaliana. (A). Une personne choisie parmi une bibliothèque de base de GAL4 lignes de trappe enhancer, qui contiennent un gène GAL4-réactive GFP marqueur, peut être traversé par une ligne contenant un gène cible GAL4-réactive pour induire l&#39;expression du gène cible dans GAL4 contenant les cellules marquées par fluorescence de la GFP. Basé sur un personnage du Dr Jim Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (B) Production de phytochrome chromophore, phytochromobilin (PΦB) et holophytochrome de lignées parentales. (C) A gauche, la réduction de la biliverdine IXα (BV IXα) et par la biliverdine réductase PΦB (BVR) des activités à BR et PΦR, respectivement. Résultats de l&#39;activité dans le BVR épuisement des PΦB et conduit à une réduction de la production de photoactifs holophytochrome. A droite, la réaction catalysée par BVR est montré. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Fluorescence tri cellulaire (FACS) parcelles de points d&#39;acquisition. Comparaison des cellules protoplastes de tri pour C24 de type sauvage (A), J0571 (B) et J1071 (C). (A) dot plot Acquisition de non-GFP fluorescente C24 de type sauvage protoplastes excité par un laser 488-nm argon et utilisé pour déterminer le seuil d&#39;autofluorescence. (B) et (C) l&#39;acquisition des parcelles de points montrent des proportions de protoplastes qui sont GFP-positives en réponse à une excitation par un laser 488-nm. R3 portes de tri dans B et C délimiter les cibles GFP-positives qui ont été triés par trieur de cellules activées par fluorescence (FACSVantage, BD) et collectées. Canal rouge indique valeurs pour autofluorescence chlorophylle à partir de protoplastes et canal vert indique les valeurs pour fluorescence de la GFP. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Microscopie confocale des protoplastes de plantes utilisées pour le tri cellulaire. Confocale laser, les images numérisées avant de protoplastes (A, C, E) et après (G) le tri par trieur de cellules activées par fluorescence (FACS). B, D, F et H sont des images DIC. Protoplastes de C24 de type sauvage (A, B), J1071 (C, D) et J0571 (E, F, G, H) sont représentés. Images C, E et G sont fusionnés images de fluorescence de la GFP (BP 505 nm - 575 nm) et autofluorescence (LP 650 nm) obtenus à partir d&#39;excitation avec un laser 488-nm. A à H sont en moyenne de 4 scans dans l&#39;huile 63x. Barre = 10 um. <img src="/files/ftp_upload/1925/1925fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Quantification de l&#39;ARN isolé à partir de protoplastes par fluorospectrometry. L&#39;ARN extrait à partir de (A) C24 de type sauvage, (B) J0571, et (C) J1071. A indique l&#39;ARN pré-triés de type sauvage protoplastes. B et C indiquent ARN à partir de la GFP-positives protoplastes triés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Un logiciel de quantification d&#39;ARN, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).

<ol>
	<li>Franklin, K. A., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochrome+functions+in+Arabidopsis+development.">Phytochrome functions in Arabidopsis development.</a> J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).</li><li>Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Right+place,+right+time:+Spatiotemporal+light+regulation+of+plant+growth+and+development.">Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development.</a> Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).</li><li>Laplaze, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4-GFP+enhancer+trap+lines+for+genetic+manipulation+of+lateral+root+development+in+Arabidopsis+thaliana.">GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).</li><li>Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root-localized+phytochrome+chromophore+synthesis+is+required+for+tissue-specific+photoregulation+of+root+elongation+and+impacts+sensitivity+to+jasmonic+acid+in+Arabidopsis+thaliana.">Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana.</a> , .</li><li>Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+photomorphogenesis+by+expression+of+mammalian+biliverdin+reductase+in+transgenic+Arabidopsis+plants.">Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants.</a> Plant Cell. , 675-688 (1997).</li><li>Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+distinct+aspects+of+photomorphogenesis+via+targeted+expression+of+mammalian+biliverdin+reductase+in+transgenic+Arabidopsis+plants.">Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants.</a> Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).</li><li>Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+spatial-specific+phytochrome+responses+using+targeted+expression+of+biliverdin+reductase+in+Arabidopsis.">Detection of spatial-specific phytochrome responses using targeted expression of biliverdin reductase in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 149, 424-433 (2009).</li><li>Warnasooriya, S. N., Porter, K. J., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+anthocyanin+accumulation+and+phytochromes+in+Arabidopsis+thaliana.">Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana.</a> , .</li><li>Denecke, J., Vitale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+protoplasts+to+study+protein+synthesis+and+transport+by+the+plant+endomembrane+system.">The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system.</a> Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).</li><li>Birnbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+expression+profiling+in+plants+via+cell+sorting+of+protoplasts+from+fluorescent+reporter+lines.">Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines.</a> Nat. Methods. 2, 615-619 (2005).</li><li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+control+of+Arabidopsis+development+entails+coordinated+regulation+of+genome+expression+and+cellular+pathways.">Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways.</a> Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).</li><li>Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+signal+transduction+in+higher+plants.">Light signal transduction in higher plants.</a> Annu. Rev. Genet. 38, 87-117 (2004).</li><li>Ulm, R., &amp;amp, N. a. g. y., F, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+and+gene+regulation+in+response+to+ultraviolet+light.">Signalling and gene regulation in response to ultraviolet light.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 8, 477-482 (2005).</li><li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+expression+of+Arabidopsis+genome+during+development.">Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development.</a> Plant Physiol. 138, 80-91 (2005).</li><li>Neff, M. M., Fankhauser, C., &amp;amp, C. h. o. r. y., J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light:+an+indicator+of+time+and+place.">Light: an indicator of time and place.</a> Genes Dev. 14, 257-271 (2000).</li><li>Birnbaum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+root.">A gene expression map of the Arabidopsis root.</a> Science. 302, 1956-1960 (2003).</li></ol>

Profilage de l&#39;expression de gènes par puces à ADN (1) a indiqué que plus de 30% des gènes dans des plants d&#39;Arabidopsis sont réglementés et de lumière 11 (2) a identifié un vaste groupe de gènes codant des protéines de transduction du signal lumineux impliqués dans la cascade de signalisation phytochrome 12, 13 . De telles expériences suggèrent que la lumière induit des changements rapides et à long terme dans l&#39;expression des gènes. Chaque pool de phytochromes peut con...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Anti-BVR antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QED Bioscience Inc.</td>
<td>56257-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellulase &#x201C;Onozuka&#x201D; R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company</td>
<td>MSPC 0930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gamborg&#x2019;s B5 basal salt mixture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macerozyme R-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SERVA Electrophoresis GmbH, Crescent Chemical Company</td>
<td>PTC 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MES, low moisture content</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M3671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Murashige and Skoog salts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caisson Laboratories</td>
<td>74904</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phytablend</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caisson Laboratories</td>
<td>28302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy Plant Minikit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>16419</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

investigating tissue- and organ-specific phytochrome responses using facs-assisted cell-type specific expression profiling in arabidopsis thaliana

Médie lumière un éventail de processus de développement et d&#39;adaptation tout au long du cycle de vie d&#39;une plante. Les plantes utilisent la lumière d&#39;absorption des molécules appelées photorécepteurs de détecter et de s&#39;adapter à la lumière. Le rouge / rouge lointain absorbant la lumière photorécepteurs phytochrome ont été largement étudiés. Phytochromes exister comme une famille de protéines ayant des fonctions distinctes et qui se chevauchent dans tous les systèmes de plantes supérieures dans lesquelles ils ont été étudiés<sup&gt; 1</sup&gt;. Réponses lumière phytochrome médiation, qui vont de la germination des graines grâce à la floraison et la sénescence, sont souvent localisées dans les tissus des plantes ou des organes<sup&gt; 2</sup&gt;. Malgré la découverte et l&#39;élucidation de l&#39;individu et redondants fonctions phytochrome par des analyses de mutation, des rapports concluants sur des sites distincts de photoperception et les mécanismes moléculaires de piscines localisées de phytochromes qui interviennent dans l&#39;espace des réponses spécifiques phytochrome sont limitées. Nous avons conçu des expériences basées sur l&#39;hypothèse que des sites spécifiques du phytochrome photoperception réguler les tissus et les organes aspects spécifiques de la photomorphogenèse, et que les piscines localisées phytochrome s&#39;engager sous-ensembles distincts de gènes cibles en aval de la cellule à cellule de signalisation. Nous avons développé une approche biochimique pour réduire sélectivement phytochromes fonctionnelle dans un organe ou un tissu-spécifique de façon sein des plantes transgéniques. Nos études sont basées sur un bipartites enhancer-trap démarche qui aboutit à la transactivation de l&#39;expression d&#39;un gène sous le contrôle de la séquence d&#39;activation en amont (UAS) élément par l&#39;activateur transcriptionnel GAL4<sup&gt; 3</sup&gt;. La biliverdine réductase (<em&gt; BVR</em&gt; Gène) sous le contrôle de la SAMU est silencieusement maintenu en l&#39;absence de transactivation de GAL4 dans la relation parent-UAS BVR<sup&gt; 4</sup&gt;. Croisements génétiques entre une ligne SAMU-BVR transgéniques et un résultat GAL4-GFP enhancer ligne de trappe dans l&#39;expression spécifique de la<em&gt; BVR</emGénique&gt; dans les cellules marquées par<em&gt; GFP</em&gt; Expression<sup&gt; 4</sup&gt;. L&#39;accumulation BVR dans les résultats des plantes d&#39;Arabidopsis en carence chromophore phytochrome<em&gt; In planta</em<sup&gt; 5-7</sup&gt;. Ainsi, les plantes transgéniques que nous avons produit la pièce GAL4-dépendante l&#39;activation de la<em&gt; BVR</emGénique&gt;, ce qui entraîne l&#39;inactivation biochimique du phytochrome, ainsi que GAL4-dépendant<em&gt; GFP</em&gt; Expression. Photobiologiques et des analyses génétiques moléculaires de<em&gt; BVR</em&gt; Lignées transgéniques qui nous donnent des tissus et des organes spécifiques phytochrome réponses à médiation qui ont été associés avec les sites correspondants de photoperception<sup&gt; 4, 7, 8</sup&gt;. Fluorescence tri cellulaire (FACS) de la GFP-positives, enhancer-trap-induite<em&gt; BVR</emProtoplastes végétaux&gt; exprimant couplé avec un type de cellule spécifique profilage de l&#39;expression de gènes par l&#39;analyse des microréseaux est utilisé pour identifier les gènes putatifs cible en aval impliquées dans la médiation spatiale des réponses spécifiques phytochrome. Cette recherche est l&#39;expansion de notre compréhension des sites de perception de la lumière, les mécanismes par lesquels les différents tissus ou d&#39;organes coopèrent dans la croissance des plantes lumière réglementés et le développement, et de faire progresser la dissection moléculaire des complexes phytochrome médiation de cellule à cellule cascades de signalisation.

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

La base moléculaire de l&#39;espace des réponses spécifiques phytochrome est étudiée en utilisant des plantes transgéniques qui présentent des tissus et des organes spécifiques déficiences phytochrome. L&#39;isolement des cellules spécifiques présentant induite par la déplétion chromophore phytochrome Fluorescence-Activated tri cellulaire suivie par des analyses microarray est utilisée pour identifier les gènes impliqués dans les réponses phytochrome spatiale spécifique.

Étude des tissus et des organes spécifiques Réponses phytochrome utilisant FACS assistée type cellulaire profilage expression spécifique dans Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

investigating-tissue-organ-specific-phytochrome-responses-using-facs

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

15.7K vues.  Michigan State University (MSU). La base moléculaire de l'espace des réponses spécifiques phytochrome est étudiée en utilisant des plantes transgéniques qui présentent des tissus et des organes spécifiques déficiences phytochrome. L'isolement des cellules spécifiques présentant induite par la déplétion chromophore phytochrome Fluorescence-Activated tri cellulaire suivie par des analyses microarray est utilisée pour identifier les gènes impliqués dans les réponses phytochrome spat...

Vidéo: Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&amp;#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-pendage de la transformation Arabidopsis thaliana Pour examiner PTSO2:: β-glucuronidase Expression du gène rapporteur

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Recherche

Biologie

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling. These proteins display a diverse array of cellular functions including nuclear import/export of RNA and protein, transcriptional regulation, and apoptosis. Interestingly, major cellular reorganizations including cell division, differentiation and transformation, often involve such activities3,4,8,10. The detailed study of these proteins and their respective regulatory mechanisms can be challenging as the stimulation for these localization changes can be elusive, and the movements themselves can be quite dynamic and difficult to track. Studies involving cellular oncogenesis, for example, continue to benefit from understanding pathways and protein activities that differ between normal primary cells and transformed cells6,7,11,12. As many proteins show altered localization during transformation or as a result of transformation, methods to efficiently characterize these proteins and the pathways in which they participate stand to improve the understanding of oncogenesis and open new areas for drug targeting.
Here we present a method for the analysis of protein trafficking and shuttling activity between primary and transformed mammalian cells. This method combines the generation of heterokaryon fusions with fluorescence microscopy to provide a flexible protocol that can be used to detect steady-state or dynamic protein localizations. As shown in Figure 1, two separate cell types are transiently transfected with plasmid constructs bearing a fluoroprotein gene attached to the gene of interest. After expression, the cells are fused using polyethylene glycol, and protein localizations may then be imaged using a variety of methods. The protocol presented here is a fundamental approach to which specialized techniques may be added.

A flexible and efficient method for the characterization of cell type-specific protein localization and nucleocytoplasmic shuttling is described. This heterokaryon approach uses fluorescently-labeled fusion proteins to image protein localizations after cell fusion. The protocol is amenable to steady-state localizations or more dynamic determinations based on live cell imaging.

Technique d&#39;analyse des hétérocaryon cellulaire spécifique de type localisation

A significant number of proteins are regulated by subcellular trafficking or nucleocytolasmic shuttling.  These proteins display a diverse array of ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

Arabidopsis thaliana profilage glycolipides polaires par chromatographie sur couche mince (CCM) couplée à la chromatographie gaz-liquide (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Résolution Quantification haut de Crystalline Cellulose Accumulation dans<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots pour surveiller cellulaire spécifique d&#39;un tissu mural Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq : Type-spécifiques des cellules épigénome profilage

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

Profilage de l'expression génique spécifique au type cellulaire dans le foie de souris

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

Analyse de l’ARN de microdissection à capture laser pour analyse d’expression génique spécifique aux tissus spatiaux et temporels chez les plantes

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids potential pitfalls caused by the heterogeneity of tissues and unleashes the powerful transcriptome analysis. The protocol described here demonstrates how to use the Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) method to isolate ribosome-bound RNAs from a small amount of EGFP-expressing cells in a complex tissue without cell sorting. This protocol is suitable for isolating cell-type-specific RNAs using the recently available NuTRAP mouse model and could also be used to isolate RNAs from any EGFP-expressing cells.

This protocol aims to isolate cell-type-specific translating ribosomal mRNAs using the NuTRAP mouse model.

Isoler des ARN spécifiques à un type cellulaire à partir d’échantillons de tissus hétérogènes congelés sans tri cellulaire

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Une méthode améliorée pour mesurer les profils d’hydratation du pollen chez Arabidopsis thaliana

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is established between the interacting partners. Studies across a range of species have revealed that a series of molecular checkpoints regulate the pollen-stigma interaction to ensure that only compatible, generally intraspecific pollen is successful in effecting fertilization. In species that possess a 'dry stigma', such as the model plant Arabidopsis thaliana, the first post-pollination, prezygotic compatibility checkpoint is the establishment of pollen hydration. 
This phase of pollination is tightly regulated, whereby signals from the pollen grain elicit the release of water from the stigma, thus permitting pollen hydration. The ability to accurately measure and track pollen hydration over time is key to the design of experiments directed at understanding the regulation of this critical step in reproduction. Published protocols frequently utilize flowers that have been excised from the parent plant, maintained on liquid or solid media, and bulk pollinated. 
This paper describes a noninvasive, in vivo pollination bioassay that permits minute-by-minute hydration tracking of individual A. thaliana pollen grains at high resolution. The assay is highly reproducible, able to detect very subtle variations of pollen hydration profiles, and thus is suitable for the analysis of mutants that affect pathways regulating pollination. Although the protocol is lengthier than those described for bulk pollinations, the precision and reproducibility it provides, along with its in vivo nature, make it ideal for the detailed dissection of pollination phenotypes.

Pleins feux sur l’auteur : Un essai biologique d’hydratation du pollen in vivo à grain unique à haute résolution pour Arabidopsis thaliana  

An improved method to measure pollen hydration profiles in Arabidopsis thaliana is described here. The new method offers higher resolution, is noninvasive, and is highly reproducible. The protocol represents a new tool for a finer dissection of the processes that regulate the early stages of pollination.

Un essai biologique in vivo à haute résolution sur l’hydratation du pollen à grain unique pour Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...