Nous remercions Sacha Reichman et Dominique Santiard-Baron pour leur aide dans l&#39;édition du protocole de purification d&#39;ARN.

1. Journal: Procédure pour récupérer les échantillons du bloc opératoire Dans le laboratoire <ol><li> Obtenez un contrat d&#39;importation de la compagnie de livraison express. </li><li> Remplissez 10 (ou 25) des formulaires d&#39;expédition avec l&#39;adresse postale du laboratoire indiquant la personne de contact dans le laboratoire (numéro de téléphone et adresse e-mail). </li><li> Préparation 10 (ou 25) des formes d&#39;échantillons numérotés de 1 à 10 (ou 25). Ces formulaires comprennent des espaces dédiés à informer sur a) l&#39;identification anonyme du patient, b) la date de la chirurgie et c) des observations complémentaires le chirurgien aimeraient ajouter. Préparez-10 (ou 25) enveloppes matelassées (150 x 210 mm). </li><li> Préparé en utilisant RNAse réactifs 25 (ou 65) ml de chlorure de guanidine 6 M dans de diéthyle (DEPC) traitée H 2 O (GHCl). </li><li> Remplissez 10 ou 25 numéros 5 tubes à fond rond en polyéthylène stériles ml à 2,4 ml de solution GHCl. </li><li> Utilisé du gaz argon pour remplir la partie supérieure de ces tubes, de presse tightly sur le bouchon pour éviter l&#39;oxydation de la solution GHCl sur plusieurs années de stockage dans l&#39;armoire chirurgicale. </li><li> Présentez tous les tubes de 5 ml dans un tube de 50 ml stérile en polypropylène à fond conique avec bouchon à vis. Utilisez un morceau de mouchoir en papier propre pour maintenir le tube de 5 ml dans le tube de 50 ml, fermer le tube. </li><li> Placer les tubes de 50 ml sur un support en polystyrène et la crémaillère dans une boîte en carton avec des enveloppes matelassées, les bordereaux de livraison, les formes d&#39;échantillons. </li><li> Collez les instructions (voir: 1.12 à 1.19) à l&#39;intérieur du couvercle de la boîte en carton pour faciliter leur lecture. </li><li> Envoyez le carton par mail à la personne de contact à l&#39;hôpital. </li></ol> À l&#39;hôpital <ol start="11"><li> Apportez la boîte en carton de l&#39;armoire chirurgicale au bloc opératoire. Remarque Attention: si la procédure implique un patient à risque immunitaire, le carton ne doit pas être porté à la salle d&#39;opération. </li><li> Pendant la chirurgie, placez le spécim rétiniennefr en numérotée 5 ml en polypropylène stérile rempli de solution GHCl. Fermez hermétiquement le tube. </li><li> Retour brièvement le tube. </li><li> Placer le tube sur le tube de bascule de sang pendant 10 min. </li><li> Remplissez le formulaire échantillon numéroté accompagne. </li><li> Signaler le numéro d&#39;identification sur le tube de ml correspondant numéroté 50. </li><li> Introduire le tube de 5 ml avec la pièce opératoire dans le tube 50 ml, remplacer les tissus de papier et visser le tube. </li><li> Introduire le tube et l&#39;exemple de formulaire rempli en elle dans une des enveloppes matelassées accompagnement. Fermez-le. </li><li> Appelez la société de livraison express pour les ramasser. </li></ol> 2. ARN Purification Dans le laboratoire <ol><li> Homogénéiser le spécimen dans sa polypropylène tube de 5 ml avec une solution GHCl avec un homogénéisateur pendant 1 minute tout en déplaçant le tube de haut en bas. </li><li> Ajouter 270 ul de 2 M d&#39;acétate de potassium pH 5,0. Agiter vigoureusement pendant 10 min en plaçant le tube sur un agitateur dans sonposition horizontale (420 min -1). </li><li> Centrifuger 10 min à 5000 tpm (6500 x g) à 20 ° C. </li><li> Aspirer doucement la fraction soluble sans perturber le culot. </li><li> Transférer dans un tube stérile de 14 ml. </li><li> Ajouter 5,3 ml de Tris 100 mM pH 8,0, N-Lauroylsarcosine 1%. </li><li> Ajouter 3,2 g de chlorure de césium (CsCl) et mélanger le tube au vortex. </li><li> Ajouter 1,8 ml d&#39;acide CsCl / éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans un tube de centrifugation ml stérile 11 de polyallomère. </li><li> Avec une pipette Pasteur 10 ml stérile, transférer la solution d&#39;ARN sur 1,8 ml de CsCl / EDTA en glissant doucement sur le bord du tube pour ne pas perturber le coussin de densité. </li><li> Placer les tubes (un second tube contenant les tampons sans rétine si nécessaire) dans le rotor. </li><li> Centrifugeuse 24 h à 32.000 tours par minute (225,000 xg) à 20 ° C. </li><li> Retirez la partie supérieure de la solution avec une pipette Pasteur stérile, et jetez-le. </li><li> Retirer progressivement tout en vérifiant l&#39;moment où l&#39;ADN (visqueuse) est aspiré avec une seconde pipette Pasteur stérile, et jetez-le. </li><li> Retirer la solution restante en prenant soin de ne pas libérer le culot d&#39;ARN avec un troisième pipette Pasteur stérile. </li><li> L&#39;article de la base du tube avec un scalpel flamme stérilisé, puis mettre la partie restante du tube à l&#39;envers sur une gaze stérile. </li><li> Inverser le tube et rincer délicatement avec 160 pi de GHCl. </li><li> Laisser sécher le culot pendant 10 min. </li><li> Reprendre le culot dans 150 ul d&#39;(10 mM Tris pH 7,5 à 1 mM EDTA - 0,1% SDS). </li><li> Transférer la solution dans un ml microtube stérile 2, puis récolter le culot résiduel avec 30 pl d&#39;(10 mM Tris pH 7,5 à 1 mM EDTA - 0,1% SDS). </li><li> Ajouter 150 pi de (10 mM Tris pH 7,5 à 1 mM EDTA). </li><li> Ajouter 30 ul de 3 M d&#39;acétate de sodium pH 5,0, vortex le tube. </li><li> Ajouter 900 ul d&#39;éthanol à 100% (-20 ° C), le tube vortex. </li><li> Placez le tube 30 min dans la glace fondante. </li><li> Centrifuge le tube 30 min à 15000 rpm à 4 ° C. </li><li> Aspirer délicatement la fraction soluble, et jetez-le. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;éthanol à 70% (RT), vortex le tube. </li><li> Centrifuger le tube 20 min à 15000 rpm (18,000 xg) à 4 ° C. </li><li> Répétez l&#39;étape de rinçage (70% d&#39;éthanol). </li><li> Centrifuger brièvement et éliminer le reste d&#39;éthanol avec une pipette P200. </li><li> Laissez-le sécher à l&#39;air granulés pendant 10 min. </li><li> Reprendre le culot dans 50 ul traitée par DEPC H 2 O. </li><li> Mélanger vigoureusement au vortex. </li><li> Incuber 15 minutes à 45 ° C dans un bain d&#39;eau. </li></ol> 3. Analyse des ARN par électrophorèse sur gel <ol><li> Verser un gel d&#39;agarose à l&#39;intérieur d&#39;une hotte chimique. </li><li> Dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 ml, ajouter 2 ul d&#39;ARN à analyser et 6,4 pi de tampon de préparation de l&#39;échantillon. </li><li> Dans un second tube de 1,5 ml, ajouter 3 pi de normes d&#39;ARN et 9,6 pi de tampon de préparation de l&#39;échantillon. </li><li> Chauffer les tubes 15 min à 65 ° C, Les mettre sur la glace. </li><li> Ajouter 1 ul de bromure d&#39;éthidium (EB) d&#39;un tampon de charge sans colorant dans le tube d&#39;échantillon d&#39;ARN et 1 ul de tampon de charge EB avec le colorant dans le tube normes ARN. </li><li> Exécuter le gel sous 80 - 100 V dans une hotte chimique en fonctionnement tampon, jusqu&#39;à ce que l&#39;un des colorants (bleu de bromophénol) atteint les 2/3 de la partie inférieure du gel. </li><li> Rincer le gel deux fois 15 min avec 250 ml de traitée au DEPC 2x SSC. </li><li> Prendre une image numérisée sous illumination UV. </li><li> On calcule le rapport entre la bande supérieure (ARNr 23S) et la bande inférieure (ARNr 16S). </li></ol> 4. La purification finale de l&#39;ARN <ol><li> Réglez le volume de l&#39;échantillon d&#39;ARN à 100 pi avec traitée par DEPC H 2 O (si nécessaire). </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;acide phénol (1 ml de phénol saturé en traitée par DEPC H 2 O + 130 ul de 50 mM d&#39;acétate de sodium, pH 5,2), vortex vigoureusement. </li><li> Centrifuger le 10 min à 13000 rpm (15.000 xg) à température ambiante. </li><li> Recover soigneusement et transférer la phase aqueuse (phase supérieure) dans un roman, un tube à centrifuger stérile de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 10 ul de 3 M d&#39;acétate de sodium, pH 5,2 et 250 pi d&#39;éthanol à 100% (-20 ° C). </li><li> Incuber le tube 30 min dans la fonte des glaces. </li><li> Centrifuger le tube 30 min à 14000 rpm (18,000 xg) à 4 ° C. </li><li> Aspirer soigneusement la fraction soluble, et jetez-le. </li><li> Ajouter 500 ul d&#39;éthanol à 70% (à température ambiante), et le tube vortex. </li><li> Centrifuger le tube 20 min à 14000 rpm (18,000 xg) à 4 ° C. </li><li> Répétez l&#39;étape de rinçage (70% d&#39;éthanol). </li><li> Centrifuger brièvement et éliminer le reste d&#39;éthanol avec une pipette P200. </li><li> Laissez sécher à l&#39;air le culot pendant 10 min. </li><li> Reprendre le culot dans 50 ul d&#39;traitée par DEPC H 2 O. </li><li> Incuber le tube puis 15 min à 45 ° C. </li><li> Mesurer l&#39;absorbance (Abs) à 260 nm et 280 nm sur 2 pi de l&#39;échantillon d&#39;ARN. Calculé le Abs260/Abs280 de ratio. </li> &lt;li&gt; Magasin l&#39;échantillon d&#39;ARN à -80 ° C (stable depuis plusieurs années). </li></ol> 5. Les solutions et les procédures de nettoyage <ol><li> Acétate de potassium 2 M, pH 5.0: Dissoudre 19,6 g d&#39;acétate de potassium dans 70 ml de DEPC traitées H 2 O. Nettoyez la sonde de pH-mètre en le trempant dans de 1M NaOH pendant 15 min, suivi de 5 rinçages avec traitée par DEPC H 2 O. Ajuster le pH à 5,0 avec de l&#39;acide acétique puis régler le volume à 100 ml avec DEPC traitées H 2 O. </li><li> Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, N-Lauroylsarcosine 1%: Dissoudre 2 g de N-Lauroylsarcosine (sous une hotte) dans 40 ml de Tris-base 0,5 M pH 8,0. Réglez le volume à 200 ml avec DEPC traitées H 2 O.) CsCl / EDTA: 96 g de CsCl dans 50 ml 10 mM EDTA pH 7,5 préparé avec DEPC traitées H 2 O. Autoclave et ajuster le volume à 100 ml avec traitée par DEPC H 2 O. Vérifiez pH &lt;7,5. </li><li> Gel d&#39;agarose 1%: Mettre 1 g d&#39;agarose dans 62 ml traitée au DEPC H 2 O. Faire bouillir dans un four à micro-ondes. Ajouter 18 ml de 12,3 Mformaldéhyde, 20 ml de MOPS 5x. Verser l&#39;intérieur d&#39;une hotte chimique. </li><li> Préparation d&#39;échantillons Tampon: Pour être improvisé préparé. Mélanger dans une hotte 8 ul chimique de MOPS 5x, 16 pl de 12,3 M formaldéhyde et 40 pi de formamide. </li><li> Chargement tampon EB (sans colorant): Pour être improvisé préparé. Ajouter 4 pi 10 mg / ml de bromure d&#39;éthidium dans 20 ul de 80% de glycérol préparé avec traitée par DEPC H 2 O. </li><li> Chargement tampon EB (avec colorant): Pour être improvisé préparé. Ajouter 2 ul 10 mg / ml de bromure d&#39;éthidium dans 10 ul de 80% de glycérol contenant 0,25% de xylène cyanol, 0,25% bleu de bromophénol avec DEPC traitées H 2 O. </li><li> Courir tampon: à 60 ml MOPS 5x, ajouter 54 ml de 12,3 M formaldéhyde et 186 ml d&#39;traitée par DEPC H 2 O. </li><li> DEPC traitées H 2 O: eau distillée incuber avec 0,1% v / v diéthylpyrocarbonate pendant 2 heures à 37 ° C avec agitation. Stériliser à l&#39;autoclave. </li><li> Nettoyage de l&#39;homogénéisation: Ajouter 25 ml de solution de nettoyage (RBS) à 1 L d&#39;DEPCtraitée H 2 O, et plonger l&#39;axe 1 min en remuant. Incuber 2 heures à 60 ° C. Rincez abondamment à l&#39;traitée par DEPC H 2 O Wrap l&#39;instrument en aluminium et mis dans la boîte de l&#39;instrument. Enveloppez la boîte. Stériliser à l&#39;autoclave. </li><li> Nettoyage de l&#39;appareil d&#39;électrophorèse: Laver l&#39;appareil, le plateau et le peigne 15 puits. Incuber 15 minutes à 3% de peroxyde d&#39;hydrogène. Rincer une fois avec de l&#39;éthanol à 100%. Air sec. </li><li> Nettoyage des plats en verre: Nettoyer la vaisselle en verre RBS 2% de toute la nuit, puis rincer avec de l&#39;eau distillée avant la stérilisation à 200 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Mitry, D., Charteris, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+rhegmatogenous+retinal+detachment:+geographical+variation+and+clinical+associations.">The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations.</a> The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).</li><li>Green, R. E., Krause, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+sequence+of+the+Neandertal+genome.">A draft sequence of the Neandertal genome.</a> Science. 328 (5979), 710 (2010).</li><li>Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleic+acid+isolated+by+cesium+chloride+centrifugation.">Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation.</a> Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).</li><li>Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coli+tRNAs+as+inhibitors+of+viral+reverse+transcription+in+vitro.">coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).</li><li>Sawadogo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+inhibition+of+yeast+RNA+polymerases+A+and+B+by+tRNA+and+alpha-amanitin.">On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin.</a> Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).</li><li>Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+detachment+reveals+both+inflammatory+response+and+photoreceptor+death.">Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death.</a> PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).</li><li>Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RETINOBASE:+a+web+database,+data+mining+and+analysis+platform+for+gene+expression+data+on+retina.">RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina.</a> BMC Genomics. 9, 208 (2008).</li><li>Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis.">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).</li><li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases:+from+clinic+to+redox+signaling.">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).</li><li>Chalmel, F., Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à révéler.

L&#39;élaboration d&#39;une procédure de recouvrement de tissu du bloc opératoire a été essentielle à l&#39;analyse du transcriptome de décollement de la rétine. Il faut remarquer que ce type de chirurgie est pratiquée en urgence et que les ophtalmologistes exploitation ont peu de temps pour participer à un programme de recherche biologique quand ils opèrent. Cette rétinectomie est également effectuée stochastique dans chaque service, de sorte que le plus simple pour atteindre le nombre statistiques est de...

L&#39;objectif thérapeutique principal de décollement de la rétine (RD) est de trouver un moyen de limiter les dommages aux cellules des photorécepteurs et inflammation de la rétine résultant de la séparation des photorécepteurs à partir des cellules épithéliales pigmentées de la rétine. Au cours de RD, les cellules RPE sont activés, migrer, dédifférencier et prolifèrent à la surface de la rétine décollée, exerçant des forces contractiles conduisant à des complications. Analyse transcriptomique de la RD est un moyen d&#39;identifier les gènes cibles avec une expression modifiée suite RD et donc futures molécules thérapeutiques qui pourraient améliorer le résultat visuel final association avec la chirurgie. Il est bien connu d&#39;acide ribonucléique (ARN) n&#39;est pas stable comme l&#39;acide désoxyribonucléique (ADN), ce dernier étant largement utilisé pour des études génétiques, sa stabilité avait permis le séquençage du génome de Neandertal à partir d&#39;échantillons paléontologiques de plus de 30.000 ans 2. Transcription de l&#39;ADN des gènes du génome en ARN messager est l&#39;processus important dans l&#39;expression du gène, et l&#39;ARNm est labile en vue de constituer un signal. ARN sont très rapidement dégradés par les enzymes RNAse qui se terminent le signal. Lorsque les tissus sont isolés d&#39;un organisme, les ARN sont très souvent dégradés avant l&#39;expression est étudiée dans un laboratoire de recherche. ARN dégradé n&#39;est pas adapté pour l&#39;expression du gène de l&#39;analyse. Parce que le personnel du laboratoire ne peut pas participer à la chirurgie, nous avons développé une procédure qui est simple et ne requiert que le chirurgien de récupérer les tissus dans une solution RNAse approprié. Les ARN des tissus est stable et peuvent être analysées sans aucun signe de dégradation après 72 heures à la température ambiante dans cette solution. Les ARN à partir d&#39;échantillons sont purifiés par une méthode standardisée comportant une ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium, après avoir été transféré au laboratoire 3. Ensuite, la qualité des ARN est évaluée par électrophorèse sur gel d&#39;agarose et par RT-PCR. Le protocole de purification d&#39;ARN a leavantage de séparer les molécules en fonction de leur densité qui est différente de l&#39;ADN et de l&#39;ARN et qui donne à l&#39;ARN n&#39;est pas contaminé par une molécule d&#39;ADN qui vont générer des signaux d&#39;artefact dans des études d&#39;expression génique. En outre, les ARN de transfert (ARNt), qui sont quantitativement ARN les plus abondants dans une cellule, sont séparés selon la même propriété physique de l&#39;ARN ribosomal (ARNr) et les ARN messagers (ARNm), ces deux derniers étant l&#39; produit final du procédé de purification. La suppression de l&#39;ARNt de la préparation est utile car la plupart des protocoles d&#39;analyse microarray impliqué l&#39;utilisation de transcriptases inverses et ARN polymérases qui sont inhibées par l&#39;ARNt 4-6. L&#39;ARN purifié à partir de prélèvements chirurgicaux sont étiquetés en utilisant le protocole standard et hybridées à une biopuce et les résultats sont analysés par deux méthodes complémentaires, la méthode du taux de fausses découvertes, et en utilisant une nouvelle méthode basée sur l&#39;information mutuelle et visualisation enzed sur le serveur Web Retinobase 7,8.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Aventi J-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JS-5.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>LE 80K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>SW41</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Power supply</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>Pac 3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PolytronTM</td>
 <td>Kinematica</td>
 <td>PT 2100</td>
 <td>Supplied with PT-DA 2105:2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose gel electrophoresis device</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>MiniGel Cell GT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imaging System </td>
 <td>Biorad</td>
 <td>GelDoc-It Imager</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml sterile polyethylene tube</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>115261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile polyallomer centrifuge tube </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>331372</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemical reagents</td>
 <td>Sigma</td>
 <td></td>
 <td>Molecular biology grade (RNase and DNase free products)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cleaning Solution </td>
 <td>VWR </td>
 <td>RBS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microarray chip</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>Human U133 plus 2 array</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal

Décollement de la rétine (RD) décrit une séparation de la rétine neurosensorielle de l&#39;épithélium pigmentaire rétinien (EPR). L&#39;EPR est essentiel pour la fonction normale des neurones sensibles à la lumière, les photorécepteurs. Détachement de la rétine de l&#39;EPR crée un espace physique qui est rempli de fluide extracellulaire. RD initie événements indésirables cellulaires et moléculaires qui affectent à la fois la rétine neurosensorielle et l&#39;EPR depuis l&#39;échange physiologique des ions et des métabolites est gravement perturbé. La conséquence de vision est liée à la durée du détachement depuis un réapposition rapide des deux tissus entraîne la restauration de la vision 1. Le traitement de la RD est exclusivement chirurgical. L&#39;élimination du corps vitré (vitrectomie) est suivie de l&#39;enlèvement partie non essentielle de la rétine autour de la zone individuelle de favoriser un décollement de rétine. Les spécimens rétiniennes enlevées sont res nullius (rien) et, normalement, par conséquent rejetées.Pour récupérer l&#39;ARN à partir de ces prélèvements chirurgicaux, nous avons développé la procédure Journal qui permet la conservation d&#39;ARN pendant le transfert du bloc opératoire au laboratoire. Nous avons également un protocole standardisé pour purifier l&#39;ARN par ultracentrifugation de chlorure de césium pour s&#39;assurer que les ARN purifiés sont adaptés à l&#39;analyse de l&#39;expression génique globale. La qualité de l&#39;ARN a été validé à la fois par RT-PCR et l&#39;analyse des microréseaux. L&#39;analyse des données montre une implication simultanée de l&#39;inflammation et la dégénérescence des photorécepteurs au cours de RD.

La procédure Journal (Figure 1) nous permet de récupérer des échantillons de rétine du bloc opératoire à l&#39;ARN purifié, et d&#39;analyser le transcriptome de décollement de la rétine. Résultats de décollement de la rétine dans la régulation positive de la MCP1 chimiotactique des monocytes gène CCL2, et dans la diminution de l&#39;expression de la tige photorécepteur transduction gène GNAT1, le cône ondes courtes opsin OPN1SW, et le homéogène CRX</em...

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Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Nous avons utilisé des échantillons de la rétine rétinectomie pour une analyse transcriptomique de décollement de la rétine. Nous avons développé une procédure qui permet la conservation d&#39;ARN entre les blocs opératoires et les laboratoires. Nous avons standardisé un protocole pour purifier l&#39;ARN par ultracentrifugation de chlorure de césium pour s&#39;assurer que les ARN purifiés sont adaptés à l&#39;analyse des microréseaux.

L&#39;analyse transcriptomique de prélèvements rétine humaine en utilisant Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

transcriptomic-analysis-human-retinal-surgical-specimens-using

Research

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Medicine

7.7K vues.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. Nous avons utilisé des échantillons de la rétine rétinectomie pour une analyse transcriptomique de décollement de la rétine. Nous avons développé une procédure qui permet la conservation d'ARN entre les blocs opératoires et les laboratoires. Nous avons standardisé un protocole pour purifier l'ARN par ultracentrifugation de chlorure de césium pour s'assurer que les ARN purifiés sont adaptés à l'analyse des microréseaux.

Vidéo: Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Méthode pour le développement de nouveaux médicaments anti-cancer en utilisant des explants des tumeurs des spécimens chirurgicaux


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Recherche

Médecine

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocole amélioré pour la microdissection laser d&#39;îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

Deux méthodes de fixation des cellules humaines de l&#39;endomètre stromales primaires de spécimens hystérectomie

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

A l&#39;étape par le protocole de l&#39;étape pour la chirurgie sous-rétinienne chez les lapins

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Génération d&#39;un humanisée foie de souris Utilisation hépatique humaine Cellules souches

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

La microscopie intravitale du système vasculaire associées à la tumeur en utilisant Advanced dorsale pli fenêtre Chambers sur des souris transgéniques fluorescents

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

À l’aide de In Vitro imagerie de cellules vivantes pour explorer les agents chimiothérapeutiques livré par nanoparticules à base de lipides

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Surgical Training for the Implantation of Neocortical Microelectrode Arrays Using a Formaldehyde-fixed Human Cadaver Model

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. Recent technological progress has enabled the fabrication of microelectrode arrays that allow recording the activity of multiple individual neurons in the neocortex of the human brain. These arrays have the potential to bring unique insight onto the neuronal correlates of cerebral function in health and disease. Furthermore, the identification and decoding of volitional neuronal activity opens the possibility to establish brain-computer interfaces, and thus might help restore lost neurological functions. The implantation of neocortical microelectrode arrays is an invasive procedure requiring a supra-centimetric craniotomy and the exposure of the cortical surface; thus, the procedure must be performed by an adequately trained neurosurgeon. In order to provide an opportunity for surgical training, we designed a procedure based on a human cadaver model. The use of a formaldehyde-fixed human cadaver bypasses the practical, ethical and financial difficulties of surgical practice on animals (especially non-human primates) while preserving the macroscopic structure of the head, skull, meninges and cerebral surface and allowing realistic, operating room-like positioning and instrumentation. Furthermore, the use of a human cadaver is closer to clinical daily practice than any non-human model. The major drawbacks of the cadaveric simulation are the absence of cerebral pulsation and of blood and cerebrospinal fluid circulation. We suggest that a formaldehyde-fixed human cadaver model is an adequate, practical and cost-effective approach to ensure proper surgical training before implanting microelectrode arrays in the living human neocortex.

We designed a procedure in which a formaldehyde-fixed human cadaver is used to assist neurosurgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain.

Formation en chirurgie pour l’Implantation de la microélectrode néocorticales tableaux en utilisant un modèle de cadavre humain formaldéhyde-corrigé

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

Diagnostic et traitement chirurgical de la spondylodiscite humaine de Brucellar

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

Induction et analyse du stress oxydatif dans les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes transfectées par transposon de la belle endormie

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...