L&#39;American Cancer Society (MRSG-08-108-01), Vincent J. Sgro / L&#39;Association américaine du cerveau tumeur, et la famille Khan Foundation car je Nakano.

1. Préparation des supports <ol><li> Les médias ont été préparés en utilisant 10% de FBS (16140-071 - GIBCO) dans DMEM/F-12 (1X), Liquid 01:01 (10565-042 - Invitrogen) avec une solution Agar 0,6% purifiée, granulé (1.01614.1000-EMD ). Des conditions stériles ont été maintenus tout au long de l&#39;expérience. </li><li> Pour la préparation des supports 5mL de FBS (16140-071 - GIBCO) a été ajouté à 45 ml d&#39;DMEM/F-12 (1X), Liquid 01:01 (10565-042 - Invitrogen) faisant volume final de 50 ml. Les médias préparée a été maintenu au bain-marie à 37 ° C de température. </li><li> La solution d&#39;agar a été préparé en utilisant la méthode micro-ondes de chaleur. 0,3 grammes d&#39;agar granulé a été dissous dans 50 ml d&#39;eau distillée en utilisant micro-ondes. La solution d&#39;agar était refroidir à 37 ° C de température en gardant l&#39;eau dans le bain. </li><li> Nous avons utilisé un volume égal de presse de l&#39;étape 1.2 et 1.3 et la solution mère préparée. Le ratio d&#39;agar 0,6% (0,5 ml) et 10% FBS-D-MEM/F-12 médias (0,5 ml) était de 1:1, ce qui rend le volume total de 1 ml dans chaque puits de plaque de 6 puits. </li></ol> 2. Le traitement des tissus <ol><li> Glioblastome multiforme (GBM) les tissus ont été reçus immédiatement après la chirurgie du Département de pathologie. Le tissu a été classé comme GBM du Département de pathologie. </li><li> Le tissu a été transféré à Patri-plaque à l&#39;aide des pinces soin et lavé avec 5 mL 1XPBS glacée pour 3 fois. </li><li> Des coupes sériées des spécimens ont été coupés à partir des échantillons disséqués pour créer des blocs de tumeur (environ 10 mm de diamètre) avec une lame chirurgicale (Plume-2976 n ° 10) et pince (Fisher Scientific). </li><li> Les blocs ont été transférés dans une plaque à 6 puits. Chaque puits a été 1ml contenant des médias mentionnent à l&#39;étape 1.4. Le tissu était suffisamment exposés à l&#39;air de garder les tissus viables. </li><li> Tumeur blocs ont ensuite été injectées avec soit du DMSO (5%) ou TMZ (2,5 nM) et incubées pendant 16 heures à 37 ° C dans l&#39;air humidifié contenant 5% de CO2. 0,1 ml de DMSO (5%) ou TMZ a été injecté 3 fois dans des blocs de tumeurs à différents endroits pour un traitement cohérent. Le médicament a été injecté à l&#39;aide de 1 ml seringue à insuline 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Confort 26027 points). </li><li> Après 16 heures de blocs ont été lavées avec 5 ml pour 1XPBS 3 fois. Après le lavage des blocs ont été fixées avec 10 ml de 10% v / v de formol pendant 24 heures (Ricca Chemical Company) dans des tubes de 50 ml (Basix-5539802) et traitées pour paraffine 4μm sections. </li><li> La section du formol fixe a été placé dans le bécher sur la plaque de remuer avec &quot;Pas de Chaleur&quot; et traitées par les solutions suivantes pendant 30 minutes dans chaque solution. 30% d&#39;éthanol, 50% d&#39;éthanol, éthanol à 75%, 80% d&#39;éthanol, 95% d&#39;éthanol, l&#39;éthanol à 100%, et le xylène. </li><li> Le tissu a été effacé sur du papier absorbant et placés dans de la paraffine fondue (58 à 60 ° C, Fisher Paraplast paraffine) pendant 30 minutes. </li><li> Le tissu a été embarqué dans des moules à l&#39;aide de paraffine Surgipath Blue Ribbon, a été embarqué tissus refroidi à température ambiante. </li><li> Paraffine des coupes de tissus ont été prélevés et 4μm placées sur des lames plus Fisher. </li></ol> 3. L&#39;immunohistochimie L&#39;immunohistochimie a été réalisée comme décrit précédemment. 1 <ol><li> Déparaffinage et de la Place de réhydratation des lames dans un rack et exécutez les étapes suivantes. Xylène pour 3x5 minutes (3 fois pendant 5 minutes), l&#39;éthanol à 100% pour les minutes 3x5, 95% d&#39;éthanol pour les minutes 1x5, 70% d&#39;éthanol pour les minutes 1x5, rincer à l&#39;eau courante pendant 3 minutes. </li><li> Démasquage des antigènes avec la chaleur induite diapositives épitope Plongez dans un tampon citrate de récupération 1X (Thermo Scientific-AP9003-500) dilué dans de l&#39;eau distillée dans un bécher de verre. Faire bouillir pendant 15 minutes sur une plaque chauffante (assurez-sections Don &quot;t tomber la lame). Refroidir la solution pendant 30 minutes à température ambiante. Rincer les lames avec du PBS 1X pour les 3x5 minutes. </li><li> L&#39;inhibition de peroxyde internes Immerger les lames dans du méthanol (Fisher Scientific-A-452-4) avec du peroxyde d&#39;hydrogène de 0,3% (Fisher Scientific-BP2633-500-dilué dans l&#39;eau distillée) dans un récipient en verre pendant 15 minutes. Rincer dans du PBS 1X pour les 3x5 minutes. </li><li> Blocage Couvrir les tissus avec du sérum de chèvre normal à 10%. Placer les lames dans une boîte humide et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Laver les lames avec du PBS 1X pour les 3x5 minutes. </li><li> Les sections ont été incubées anticorps primaire nuit à 4 ° C avec l&#39;anticorps primaire à des concentrations suivantes: humain de la Caspase-3 spécifiques (1:1000, la R &amp; D Systems, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15626), dilué avec du PBS 1X. Rincer les lames dans du PBS 1X 3x10 minutes le jour suivant. </li><li> Réaction d&#39;anticorps secondaire Couvrir les tissus avec 2-3 gouttes d&#39;anticorps secondaire marqué HRP (imaginer des systèmes). Mettez diapositives dans une boîte humide et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Laver avec du PBS 1X pour le 3x10 minutes. </li><li> Détection Développer pour le kit de chromogène DAB (Vector Laboratories-SK-4100) pour la détection des anticorps primaire selon le protocole du fabricant. </li><li> Contre coloration Plonger les diapositives à l&#39;hématoxyline (10-15 s<html> econdes, assurez-Don &quot;t dépassement signal DAB). Rincer à l&#39;eau du robinet pendant 3 minutes. </li><li> Plongez Déshydratation les diapositives dans l&#39;ordre suivant, l&#39;éthanol à 70% pendant 5 minutes, l&#39;éthanol à 95% pendant 5 minutes, l&#39;éthanol à 100% pour les minutes 3x5, 3x5 pour les Xylène minutes. </li><li> Lamelle les diapositives avec le réactif de montage Permount (Fisher Scientific-SP-15-100). </li><li> Les images ont été prises à l&#39;aide Olympus microscope à fluorescence (DP-72) .3.11). Dans toutes les expériences, un étiquetage spécifique a été confirmée par le contrôle négatif sans anticorps primaire. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Nous avons recueilli des spécimens chirurgicaux du glioblastome multiforme (GBM). Les patients ont subi la première intervention chirurgicale sans chimiothérapies antérieures, y compris le témozolomide (TMZ). L&#39;image pondérées en T1 de l&#39;IRM avec gadolinium dans la figure 1a démontré une tumeur renforcée dans le lobe frontal droit avant la chirurgie. L&#39;image post-opératoire (figure 1b-) a confirmé l&#39;enlèvement subtotale de la lésion après la chirurgie. Les tissus chirurgicaux ont été envoyées au Département de pathologie à des fins de diagnostic clinique, et les échantillons restants ont été traités pour l&#39;obtention des tissus sous l&#39;Institutional Review Board a approuvé (CISR) du protocole à l&#39;Ohio State University Medical Center. Hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E) coloration démontré la présence de nécrose, les cellules pseudopallisading, et la prolifération microvasculaire (figure 1-c). Ainsi, ces tumeurs ont été diagnostiquées comme histopathologiquement GBM. Fait à noter, les explants tumoraux suivants incubation sans TMZ jusqu&#39;à 48 heures maintenu la cytoarchitecture du GBM. En revanche, avec une incubation pendant 72 heures ou plus, nous avons remarqué l&#39;augmentation du nombre de noyaux de condensation dans les échantillons, ce qui suggère quelques-unes des cellules tumorales commencent à apoptose. En conséquence, les tissus tumoraux suivants incubation plus longue contenues régions inégales qui ont perdu les cellules tumorales, qui ont été préférentiellement observée à et autour des zones nécrotiques (données non présentées). Afin d&#39;étudier si ces échantillons explant tumoral peut être utilisée de manière fiable dans le but de tester l&#39;efficacité des médicaments, nous avons testé l&#39;effet du traitement TMZ. Figure-2 représente le flux des expériences dans cette étude. Une étude récente a montré que l&#39;injection intratumorale de TMZ a un effet plus puissant sur ​​le contrôle de la croissance des gliomes malins que celle de l&#39;administration systémique de ce médicament 2. Après incubation pendant 16 heures, ces explants ont été intégrées à la paraffine et des coupes sériées ont été préparés pour la coloration. Immunohistochimie des tissus GBM TMZ-traités ont montré une réduction substantielle des cellules tumorales Ki-67-positifs en comparaison avec les échantillons de contrôle. À son tour, l&#39;immunohistochimie avec un marqueur apoptose, la caspase-3, n&#39;a pas donné aucune différence significative entre les échantillons de gliome TMZ-traitées et les échantillons de contrôle (Figure 3). L&#39;effet du traitement avec Temodal a été en outre caractérisé en combinant cette analyse avec explant soit en culture in vitro ou par cytométrie en flux. Plus précisément, nous avons cherché à déterminer l&#39;effet sur les cellules souches, comme les cellules tumorales (SCLTC). Par conséquent, après un traitement avec Temodal intratumorale, nous avons effectué d&#39;essai sphère formant et cytométrie de flux de ces explants tumoraux. Les spécimens ont été traitées à TMZ dissociées en cellules individuelles unique et ces cellules simples ont été ensemencées dans une faible densité (1 cellule par microlitre ou moins) dans des plaques de 96 puits dans un milieu sans sérum complété avec bFGF et EGF. Dans le groupe contrôle, la formation de tumeurs sphères de la tumeur a été observée explants après une incubation de 7 jours. Étant donné que la formation de la sphère est une propriété de SCLTC 3 4, des altérations dans le nombre de sphères de tumeurs par un traitement médicamenteux indique l&#39;effet sur ​​SCLTC. De même, la cytométrie en flux des explants tumoral dissocié avec un marqueur de surface cellulaire, CD133, a été réalisée afin de vérifier l&#39;effet sur SCLTC. Si SCLTC dans les cellules tumorales hétérogènes dans le GBM sont sélectivement éliminées par un traitement médicamenteux, on peut prédire que la cytométrie en flux devrait détecter diminution de la fraction CD133-positif par un traitement (données non présentées). <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure.1 images par résonance magnétique (IRM) d&#39;un GBM patient. Représentant de chiffres pré-opération figure 1a et post-opératoire Figure 1b. Figure-1c est coloration H &amp; E de l&#39;échantillon GBM tissu frais. Grossissement original, 40X. <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure. 2 Le flux expérimentaux de l&#39;expérience de la culture du bloc. Figure-2a. Image du GBM chirurgicale frais reçus du département de pathologie. Figure 2b montre dissection du bloc tumorales dans 10mm petits morceaux avec l&#39;aide de la lame chirurgicale. Figure-2c est la drogue (TMZ) le traitement des tumeurs à l&#39;aide de blocs seringue à insuline. e 3 &quot;/&gt; Figure. 3 immunohistochimie. Immunohistochimie des blocs de tissus GBM injecté avec du DMSO ou TMZ avec activé la caspase-3 et Ki67. Hématoxyline a été utilisé pour la coloration nucléaire. Grossissement original, 40X.

<ol>
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Il ya un écart entre l&#39;efficacité du médicament dans le courant pré-clinique des modèles expérimentaux et l&#39;efficacité chez les patients. Plus précisément, dans le domaine de la recherche de tumeurs cérébrales, de nouvelles méthodes et fiables sont nécessaires qui permette de combler le fossé existant entre l&#39;évaluation des médicaments avec les méthodes actuelles et l&#39;efficacité chez les patients. L&#39;essai décrit dans cette étude est un atout supplémentaire, sinon une solution, afin de faciliter le remplissage de la divergence des données expérimentales et les résultats des patients affectés. Dans les cultures de cellules in vitro préférentiellement d&#39;élargir certains types de cellules tumorales indépendamment des conditions de culture, et ne représentent qu&#39;une sous-population de toute la tumeur. 5 De plus, la transformation génétique et phénotypique de l&#39;expansion des cellules artificielles se produit et qu&#39;elle est inévitable avec les cultures cellulaires à long terme . Un des obstacles majeurs pour traiter les gliomes malins est l&#39;hétérogénéité des cellules tumorales, tant au sein d&#39;une tumeur unique et entre les échantillons tumoraux 6, 7. Par conséquent, l&#39;enrichissement sélectif d&#39;une certaine population de cellules tumorales, indépendamment d&#39;un type ou un autre, peut-être pas un moyen approprié pour déterminer l&#39;efficacité de toute agents chimiothérapeutiques sur les cellules tumorales hétérogènes. 8 9 Tout modèle animal de tumeurs cérébrales provenant d&#39;une sous-population de cellules tumorales versé lumières sur l&#39;efficacité des médicaments sur une sous-population, mais pas toute la tumeur. Plusieurs limites, d&#39;autre part, restent dans cette méthode des explants tumoraux. Une telle limitation est la période relativement courte de traitement. Depuis cellules tumorales malignes sont considérés à acquérir une résistance à la plupart, sinon tous, les thérapies au fil du temps, le contrôle initial de la croissance à court terme des cellules tumorales ne peut être reflétée par le pronostic du patient à long terme, comme l&#39;a récemment rapporté avec un anti- agent angiogénique, le bevacizumab 10. Ainsi, l&#39;amélioration du protocole pour ce dosage explant de préserver les tissus pour une plus longue période est nécessaire avec d&#39;autres investigations. Une autre question est un effet spécifique d&#39;un médicament testé sur SCLTC dans la tumeur. Étant donné que SCLTC sont relativement résistantes aux thérapies actuelles pour gliome malin, l&#39;identification de nouveaux médicaments anti-cancéreux qui puissamment éradiquer SCLTC est justifiée. À cet égard, nous cherchons actuellement à combiner ce test explant avec la suite des expériences in vitro, tels que le dosage formant Neurosphère (données non présentées). Nous nous attendons à en apprendre davantage sur les effets, le cas échéant, d&#39;un candidat médicament sur SCLTC travers ces tests combinés. Enfin, à l&#39;aide de petits blocs d&#39;échantillons de tumeur peut ne pas refléter l&#39;ensemble des populations de cellules tumorales, comme c&#39;est le cas avec les lignes classiques des cellules tumorales ou des cultures primaires à partir de spécimens chirurgicaux. Ces questions de côté, la préservation du stroma tumoral, y compris la niche vasculaire, est utile dans la caractérisation des facteurs environnementaux pour les cellules tumorales. Par conséquent, ce test peut avoir un potentiel pour évaluer les stratégies thérapeutiques dans une condition plus physiologiquement pertinents. Ici, nous avons établi un essai pour tester l&#39;efficacité des médicaments avec des explants de prélèvements du GBM. En fait, avec les échantillons testés chirurgicale, nous avons constaté que d&#39;une injection directe de TMZ réduit la prolifération dans les échantillons de glioblastome. Cette méthode explant tissulaire est théoriquement applicable à d&#39;autres cancers solides et fournit des actifs afin de déterminer l&#39;efficacité des médicaments sur la tumeur d&#39;un patient, qui nous l&#39;espérons, de nous aider à éviter un nouvel échec dans les essais cliniques pour le cancer.

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal, qualifié, inactivé par la chaleur </td><td> GIBCO </td><td> 16140-071 </td></tr><tr><td> D-MEM/F-12 liquides (1X) 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-042 </td></tr><tr><td> Agar-Agar purifié, cristallisé </td><td> EMD </td><td> 1.01614.1000 </td></tr><tr><td> DPBS pour la coloration </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> Hematoxyllin </td><td> Richalrd Allan science </td><td> 7211 </td></tr><tr><td> 10% p / v Caspase-3 du formol </td><td> Ricca Chemical Company </td><td> 3810 </td></tr><tr><td> Caspase-3 </td><td> R &amp; D de systèmes </td><td> AF835 </td></tr><tr><td> Ki67 </td><td> Dako </td><td> 15626 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td></tr><tr><td> Envision système anti-souris </td><td> Dako </td><td> 2012-07 </td></tr><tr><td> Envision système anti-lapin </td><td> Dako </td><td> 2011-12 </td></tr><tr><td> DAB-Kit </td><td> Vecteur Lab. </td><td> SK-4100 </td></tr></table> Tableau 1. Matériaux. <table border="1"><tr><td> Nom de l&#39;équipement </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> 6 plaques à puits </td><td> Greiner Bio-une </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Boîte de Petri </td><td> VWR </td><td> 25384-302 </td></tr><tr><td> Pipette sérologique </td><td> Axygen </td><td></td></tr><tr><td> Pointes à filtre </td><td> USA Scientific </td><td></td></tr><tr><td> 500 um filet de polyester Netwell insérez </td><td> Costar </td><td> 3480 </td></tr><tr><td> Matrigel Matrice </td><td> BD Biosciences </td><td> 354230 </td></tr><tr><td> BD seringue de 10 mL </td><td> BD Biosciences </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Moyeu en aluminium aiguille hypodermique. </td><td> Tyco Health Care </td><td> 2000029 </td></tr><tr><td> Flacon de culture tissulaire </td><td> Corning </td><td></td></tr><tr><td> Tubes à centrifuger </td><td> Basix </td><td> 5539800 </td></tr><tr><td> Mince tubes à paroi </td><td> Eton </td><td> 1107A </td></tr><tr><td> Lame en acier inoxydable chirurgical </td><td> Plume </td><td> 2976 # 10 </td></tr><tr><td> Seringue à insuline </td><td> Point de Confort </td><td> 26027 </td></tr><tr><td> 50mL plate top tube bouchon à vis </td><td> Basix </td><td> 5539802 </td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td> Tritech </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à fluorescence </td><td> Olympus </td><td> DP-72 </td></tr><tr><td> Pince </td><td> Fisher Sci </td><td></td></tr></table> Tableau 2. Équipement.

method for novel anti-cancer drug development using tumor explants of surgical specimens

Les thérapies actuelles pour gliome malin ont effet palliatif seulement. Pour le développement de thérapeutiques, un obstacle est l&#39;écart d&#39;efficacité déterminée par les tests d&#39;efficacité des médicaments et l&#39;efficacité sur des patients. Ainsi, de nouvelles méthodes et fiable pour évaluer l&#39;efficacité des médicaments sont garantis dans la phase pré-clinique. La culture in vitro de tissus tumoraux, y compris les lignées cellulaires, a d&#39;importantes modifications phénotypiques, génétiques et épigénétiques des cellules cancéreuses causées par l&#39;environnement artificiel de culture cellulaire, qui peuvent ne pas refléter la biologie des tumeurs d&#39;origine in situ. Modèles de xénogreffe avec la souris immunodéficientes ont aussi leurs limites, à savoir le manque de système immunitaire et interspécifiques divergences génétiques et épigénétiques dans le micro. Ici, nous démontrons une nouvelle méthode utilisant les spécimens chirurgicaux des gliomes malins comme des blocs de tumeurs non dissocié pour évaluer les effets du traitement. Pour valider cette méthode, les données avec le courant de première ligne agent chimiothérapeutique, le témozolomide (TMZ), sont décrits. Nous avons utilisé l&#39;échantillon fraîchement retiré chirurgicale de gliome malin pour nos expériences. Nous avons effectué injection intratumorale de TMZ ou d&#39;autres médicaments candidats, suivie d&#39;une incubation et des analyses sur les prélèvements chirurgicaux. Ici, nous avons cherché à établir une méthode tissu tumoral explant comme une plateforme pour déterminer l&#39;efficacité du roman de thérapies anti-cancéreuses afin que nous puissions être en mesure de surmonter, au moins, certaines des limites actuelles et combler le fossé existant entre le groupe expérimental en cours données et l&#39;efficacité sur la tumeur d&#39;un patient est réelle. Cette méthode peut avoir le potentiel d&#39;accélérer l&#39;identification de nouveaux agents chimiothérapeutiques pour le traitement de cancers solides.

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Ici, nous avons établi une méthode pour tester l&#39;efficacité des médicaments avec des spécimens chirurgicaux de tumeurs du cerveau, appelée «méthode des explants tumoraux». Avec cette méthode, nous pouvons évaluer l&#39;efficacité des médicaments sans casser le microenvironnement des tumeurs solides. Afin de valider la fiabilité de cette méthode, nous décrivons les données représentatives de notre échantillon de gliome traités avec le courant de première ligne agent chimiothérapeutique, le témozolomide.

Méthode pour le développement de nouveaux médicaments anti-cancer en utilisant des explants des tumeurs des spécimens chirurgicaux


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

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16.5K vues.  The Ohio State University Medical Center. Ici, nous avons établi une méthode pour tester l'efficacité des médicaments avec des spécimens chirurgicaux de tumeurs du cerveau, appelée «méthode des explants tumoraux». Avec cette méthode, nous pouvons évaluer l'efficacité des médicaments sans casser le microenvironnement des tumeurs solides. Afin de valider la fiabilité de cette méthode, nous décrivons les données représentatives de notre échantillon de gliome traités avec le courant de pre...

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Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocole amélioré pour la microdissection laser d&#39;îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Recherche

Médecine

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel haute résolution<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal function of the light sensitive neurons, the photoreceptors. Detachment of the retina from the RPE creates a physical gap that is filled with extracellular fluid. RD initiates cellular and molecular adverse events that affect both the neurosensory retina and the RPE since the physiological exchange of ions and metabolites is severely perturbed. The consequence for vision is related to the duration of the detachment since a rapid reapposition of the two tissues results in the restoration of vision 1. The treatment of RD is exclusively surgical. Removal of vitreous gel (vitrectomy) is followed by the removal non essential part of the retina around the detached area to favor retinal detachment. The removed retinal specimens are res nullius (nothing) and consequently normally discarded. To recover RNA from these surgical specimens, we developed the procedure jouRNAl that allows RNA conservation during the transfer from the surgical block to the laboratory. We also standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for global gene expression analysis. The quality of the RNA was validated both by RT-PCR and microarray analysis. Analysis of the data shows a simultaneous involvement of inflammation and photoreceptor degeneration during RD.

We used retinal samples from retinectomy for a transcriptomic analysis of retinal detachment. We developed a procedure that allows RNA conservation between the surgical blocks and the laboratory. We standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for microarray analysis.

L&#39;analyse transcriptomique de prélèvements rétine humaine en utilisant Journal

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

Une méthode de surveillance abordable VIH-1 pour la résistance aux médicaments à ressources limitées

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to the development of metastatic disease in animal models and in cancer patients. Preclinical work from our group and others has demonstrated a profound suppression of innate immune function, specifically NK cells in the postoperative period and this plays a major role in the enhanced development of metastases following surgery. Relatively few animal studies and clinical trials have focused on characterizing and reversing the detrimental effects of cancer surgery. Using a rigorous animal model of spontaneously metastasizing tumors and surgical stress, the enhancement of cancer surgery on the development of lung metastases was demonstrated. In this model, 4T1 breast cancer cells are implanted in the mouse mammary fat pad. At day 14 post tumor implantation, a complete resection of the primary mammary tumor is performed in all animals. A subset of animals receives additional surgical stress in the form of an abdominal nephrectomy. At day 28, lung tumor nodules are quantified. When immunotherapy was given immediately preoperatively, a profound activation of immune cells which prevented the development of metastases following surgery was detected. While the 4T1 breast tumor surgery model allows for the simulation of the effects of abdominal surgical stress on tumor metastases, its applicability to other tumor types needs to be tested. The current challenge is to identify safe and promising immunotherapies in preclinical mouse models and to translate them into viable perioperative therapies to be given to cancer surgery patients to prevent the recurrence of metastatic disease.

A mouse tumor model of surgical stress is used to explore how postoperative immune suppression promotes metastatic disease and to evaluate immunostimulatory perioperative therapies.

Une tumeur modèle murin de stress chirurgical à explorer les mécanismes de l&#39;immunosuppression postopératoire et évaluer de nouvelles immunothérapies périopératoires

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Méthode pour l&#39;obtention de cellules cancéreuses ovariennes primaires à partir d&#39;échantillons solides

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United States. Tacrolimus is a narrow therapeutic index drug and as such requires therapeutic drug monitoring and dose adjustment based on its whole blood trough concentrations. To facilitate home therapeutic drug and adherence monitoring, the collection of dried blood spots is an attractive concept. After a finger stick, the patient collects a blood drop on filter paper at home. After the blood is dried, it is mailed to the analytical laboratory where tacrolimus is quantified using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in combination with a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
For tacrolimus analysis, a 6-mm disc is punched from the saturated center of the blood spot. The blood spot is homogenized using a bullet blender and then proteins are precipitated with methanol/0.2 M ZnSO4 containing the internal standard D2,13C-tacrolimus. After vortexing and centrifugation, 100 &#181;l of supernatant is injected into an online extraction column and washed with 5 ml/min of 0.1 formic acid/acetonitrile (7:3, v:v) for 1 min. Hereafter, the switching valve is activated and the analytes are back-flushed onto the analytical column (and separated using a 0.1% formic acid/acetonitrile gradient). Tacrolimus is quantified in the positive multi reaction mode (MRM) using a tandem mass spectrometer.
The assay is linear from 1 to 50 ng/ml. Inter-assay variability (3.6%-6.1%) and accuracy (91.7%-101.6%) as assessed over 20 days meet acceptance criteria. Average extraction recovery is 95.5%. There are no relevant carry-over, matrix interferences and matrix effects. Tacrolimus is stable in dried blood spots at RT and at +4 &#176;C for 1 week. Extracted samples in the autosampler are stable at +4 &#176;C for at least 72 hr.

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

Quantification de l&#39;immunosuppresseur tacrolimus sur des taches de sang séché en utilisant LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

A Novel Murine Model of Arteriovenous Fistula Failure: The Surgical Procedure in Detail

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the exact pathophysiology remains unknown. In order to unravel the pathophysiology a murine model of AVF-failure was developed in which the configuration of the anastomosis resembles the preferred situation in the clinical setting. A model was described in which an AVF is created by connecting the venous end of the branch of the external jugular vein to the side of the common carotid artery using interrupted sutures. At a histological level, we observed progressive stenotic intimal lesions in the venous outflow tract that is also seen in failed human AVFs. Although this procedure can be technically challenging due to the small dimensions of the animal, we were able to achieve a surgical success rate of 97% after sufficient training. The key advantage of a murine model is the availability of transgenic animals. In view of the different proposed mechanisms that are responsible for AVF failure, disabling genes that might play a role in vascular remodeling can help us to unravel the complex pathophysiology of AVF failure.

Here we present a murine model of arteriovenous fistula (AVF) failure in which a clinically relevant anastomotic configuration is incorporated. This model can be used to study the pathophysiology and to test possible therapeutic interventions.

A Novel modèle murin de la fistule artério-veineuse échec: la procédure chirurgicale en détail

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

Une tumeur au cerveau / organotypiques Slice système de co-culture pour l&#39;étude des tumeurs Microenvironnement et ciblée Thérapies de drogue

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

La microscopie intravitale du système vasculaire associées à la tumeur en utilisant Advanced dorsale pli fenêtre Chambers sur des souris transgéniques fluorescents