Nous sommes reconnaissants à Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, et Kourosh Honarmand Ebrahimi pour des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par un financement de démarrage de l&#39;Université de Technologie de Delft.

1. Dps Expression et purification L&#39;obtention d&#39;une protéine de haute pureté est une première étape essentielle pour le dosage de l&#39;ADN-protection. Purification de la protéine Dps peut être réalisée dans 4 à 5 jours. <ol><li> Transformer une souche déficiente en protéase de E. coli (comme BL21 (DE3) pLysS) avec un vecteur pET (tels que pET17) dans lequel la séquence codant pour la protéine Dps a été cloné. </li><li> Morts les cellules transformées en bouillon sur des plaques d&#39;agar Luria (LB) contenant des antibiotiques appropriés (comme l&#39;ampicilline et le chloramphénicol pour les exemples fournis dans 1.1). Incuber une nuit à 37 ° C. </li><li> Inoculer une seule colonie de la plaque dans 30 ml de milieu LB contenant les antibiotiques appropriés. Incuber une nuit à 37 ° C tout en agitant à 200-250 rpm. </li><li> Inoculer 2 x 1 de milieu LB L contenant les antibiotiques appropriés avec 10 ml de la culture de la nuit. Croître à 37 ° C, tout en agitant, à 600 OD </sub&gt; d&#39;environ 0,6. (Culture de cellules à OD augmente le rendement en protéines plus élevée, sans compromettre sensiblement la pureté du produit final.) Induire l&#39;expression de Dps en ajoutant IPTG à une concentration de 0,3 mM, et incuber à 37 ° C pendant 3-4 heures tout en agitant. </li><li> Récolte des cellules par centrifugation à 6000 g pendant 15 min. Reprendre les culots de cellules dans 7,5 ml de DEAE tampon A (50 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 0,1 mM EDTA) par litre de culture cellulaire induite. Les échantillons peuvent être congelés dans l&#39;azote liquide et conservés à -80 ° C, si désiré. La procédure peut ensuite être poursuivie par décongélation les échantillons dans un bain d&#39;eau à 4 ° C. </li><li> Ajouter un mélange d&#39;inhibiteurs de la protéase (tels que les inhibiteurs de protéase ensemble Calbiochem III, à 0,167 pi par ml de suspension cellulaire) à la suspension de cellules à prévenir la dégradation de Dps surexprimés. </li><li> Préparer extrait acellulaire en utilisant une presse française. Premier de la presse française avec 20 ml de DEAE tampon A (si vous utilisez un modèle à flux continu), puis perturbationst l&#39;échantillon deux fois à 20 kpsi. Centrifuger le lysat à 30.000 g pendant 35 min à 4 ° C pour clarifier des particules insolubles, et récupérer le surnageant. Le surnageant peut ensuite être congelé à l&#39;azote liquide et stockés à -80 ° C, si on le désire. </li><li> Equilibrer un ml de DEAE Sepharose 30 CL-6B avec DEAE tampon A, en utilisant une FPLC. Exécuter un tampon à travers la colonne de 1-2 ml / min avec une pression maximale de 0,2 MPa-dessus du fond. Charger l&#39;extrait acellulaire sur la colonne, et de commencer à recueillir le flux continu une fois le signal OD 280 commence à augmenter au-dessus de base. Laver la colonne avec DEAE tampon A jusqu&#39;à ce que la valeur de DO 280 retourne à la normale, tandis que la collecte en permanence le flux continu. Le flux continu devrait contenir la majorité de la protéine Dps, sans trace d&#39;ADN lié. Laver la colonne avec 100% de tampon B (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 M de NaCl, 0,1 mM EDTA). Cet éluat contient complexes Dps-ADN ainsi que d&#39;autres protéines et peut être jeté. </li><li> Retirer annoncecontaminant conditionnelle protéines par précipitation au sulfate d&#39;ammonium. Déterminer le volume de mise en commun accréditives. Lentement (pendant une période de 10 à 20 min) ajouter du sulfate d&#39;ammonium petit-grain sec à 62% de saturation (390 mg par ml de solution) à 4 ° C, sous bonne agitation. Agiter le mélange pendant 20 à 30 min de plus un après l&#39;ajout de la dernière partie du sulfate d&#39;ammonium afin d&#39;assurer l&#39;équilibrage complet. Dps restent solubles, tandis que les protéines contaminantes se précipiter hors de la solution. </li><li> Éliminer les protéines précipitées par centrifugation à 20.000 g pendant 30 min à 4 ° C et sauver le surnageant. </li><li> Lentement, ajouter un 227 mg de sulfate d&#39;ammonium supplémentaire par ml de surnageant pour atteindre 94% de saturation et remuer pendant 20-30 min pour assurer l&#39;équilibrage complet. Dps précipités à cette concentration élevée en sel et peuvent être collectées par centrifugation à 20.000 g pendant 30 min à 4 ° C. Dps seront dans le culot, le surnageant peut être jeté. Le culot peut être conservé à -80 ° C si desIRED. </li><li> Reprendre le Dps culot contenant en Resuspension Buffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,1 mM EDTA). Réglez le volume de l&#39;échantillon à 2,5 ml. </li><li> Échange tampon pour éliminer le sulfate d&#39;ammonium en utilisant une colonne de filtration sur gel PD-10. Equilibrer le lit de gel avec 25 ml Resuspension Buffer. Appliquer le 2,5 ml de Dps échantillon au sommet de la colonne PD-10 et laisser tremper po Jeter l&#39;effluent à travers. Recueillir Dps en éluant avec 3,5 ml Resuspension Buffer. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon de tampon échangé à 16.000 g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les composants insolubles et diluer avec 6-10 ml de tampon de dilution (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 0,1 mM EDTA) pour s&#39;assurer que le concentration en sel est suffisamment faible pour Dps de se lier à la colonne de Sepharose SP. Échantillons particulièrement concentrées de Dps peuvent devenir moins soluble lors de la dilution dans un tampon inférieur sel, comme en témoigne trouble du liquide, mais peuvent être complètement resolubilisé par l&#39;ajout d&#39;un petit Amount de 5 solution de NaCl M (un 10-20 mm supplémentaire). </li><li> Equilibrer une colonne de 30 ml SP Sepharose Fast Flow avec SP tampon A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 50 mM, 0,1 mM EDTA). Exécuter un tampon à travers la colonne à 1,5-2 ml / min avec une limite de pression de 0,3 MPa-dessus du fond. Charger l&#39;échantillon sur la colonne. Laver avec SP tampon A jusqu&#39;à ce que la DO 280 déclarations de traces à l&#39;état initial, et jeter le accréditives. Exécuter un gradient linéaire de 150 ml de 0 à 100% de tampon B, tout en collectant des fractions de 2 ml. PDD élution dans un pic aigu à environ 50% de B, si variation de 10% est possible. </li><li> Exécutez les fractions d&#39;élution sur un gel à 15% SDS-PAGE, et vérifier la contamination de l&#39;ADN en mesurant le rapport DO 260 / DO 280 à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre. Le gel ne doit montrer une bande autour de 19 kDa, et la DO 260 / DO 280 est généralement autour de 0,7. Piscine fractions les plus pures dps. Utilisez un filtre centrifuge (comme l&#39;unité de filtration Ultra Amicon) avec un10K poids moléculaire de coupure de concentrer les Dps et échanger dans un tampon de stockage (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 50 mM). Aliquote les Dps purifiés, et congeler dans l&#39;azote liquide pour le stockage à -80 ° C. </li></ol> 2. Essai de protection de l&#39;ADN Le test implique plusieurs étapes sensibles au facteur temps et doit être chronométré à la seconde pour obtenir des résultats reproductibles. Beaucoup d&#39;ingrédients et les étapes de pipetage sont impliqués, donc une table de pipetage (voir tableau 1) est conseillé de garder une trace des étapes et des volumes. Le temps total nécessaire pour le dosage est de pas plus de 3 heures. <ol><li> Mesurer 30 ml d&#39;eau dans un flacon étanche à l&#39;air; rincer l&#39;eau avec du N 2 pendant 10 minutes (à l&#39;aide de deux aiguilles de seringue, une dans le fluide, l&#39;une au-dessus de celle-ci) pour éliminer l&#39;oxygène de la solution. Ajouter 0.0168 g FeSO4 • 7H 2 O à l&#39;eau pour obtenir une solution mère de 2 mm. Sceller le flacon et rincer avec de l&#39;azote pendant 5 minutes de plus, puis mélanger. La solution doit êtreclair, si tout soupçon de jaune est détectable, préparer une nouvelle solution de fer. </li><li> Faire une solution 100 mM H 2 O 2 (10,87 pi de 9.2MH 2 O 2 dans 1 ml d&#39;eau); garder sur la glace et à l&#39;abri de la lumière en l&#39;enveloppant dans du papier d&#39;aluminium. Utilisez uniquement pendant environ 1-2 heures après la préparation raison de la désintégration spontanée. Le stock de peroxyde d&#39;hydrogène est également soumis à une panne, qui peut être partiellement atténué par un stockage approprié (dans l&#39;obscurité, à 4 ° C). Des contrôles réguliers de la concentration des actions en mesurant les 240 OD sont recommandés. </li><li> Dégeler une aliquote de Dps purifiée rapidement dans un bain d&#39;eau à température ambiante et garder sur la glace. Centrifuger pendant 10 secondes à 4000 g dans une table picocentrifuge aux agrégats de précipité. Mesurer la concentration après centrifugation à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre (DO 280 = 1,547 indique une concentration de 100 Dps monomères pM). </li><li> Diluer l&#39;ADN linéaire à partir du stock de haute concentration en utilisant 12x tampon de réaction (1M MOPS-KOH pH 7,0, NaCl 1 M) à une concentration de 100 ng / ul. ADN linéaire est utilisée pour rendre plus facile la quantification, mais l&#39;ADN plasmidique peut être utilisé aussi bien. </li><li> 1 ul du mélange ADN-tampon dans un tube PCR. Ajouter suffisamment d&#39;eau dans le mélange réactionnel de telle sorte que le volume final de la réaction (moins SDS) sera de 12 ul. Ce montant doit être calculé à l&#39;avance en utilisant le tableau de pipetage. Ajouter Dps à une concentration de dodécamère finale de 3 um. Incuber pendant 15 min à température ambiante pour permettre Dps de se lier à l&#39;ADN. </li><li> Ajouter suffisamment de solution à 2 mM FeSO4 pour atteindre la concentration souhaitée. Une expérience typique utilise une gamme de concentrations de 0 à 1 mM FeSO4. Des concentrations plus élevées provoqueront plus grande dégradation de l&#39;ADN mais peuvent également conduire à la formation de fer précipite dans le mélange réactionnel. Rapidement ajouter 1 pl de la solution à 100 mm H 2 O 2 (à une concentration finale de 10 mM), et incuber à température ambiante pendant 5 min pour permettre à l&#39;FentonMédiée par réaction de dégradation à prendre place. </li><li> Ajouter 0,8 l de 20% de SDS (dodécylsulfate de sodium). Mélanger et incuber à 85 ° C pendant 5 min à perturber les complexes Dps-ADN. Le SDS déstabilise le complexe Dps-ADN et empêche des changements de gel indésirables pour l&#39;ADN, ce qui améliore la facilité de quantification. Une étape facultative consiste à arrêter la réaction par voie catalytique dégradant le peroxyde d&#39;hydrogène en produits non toxiques. Pour les conditions décrites dans le présent protocole, cette étape n&#39;est pas nécessaire d&#39;obtenir un large éventail de dégradation de l&#39;ADN. </li><li> Incuber sur de la glace pendant 1 min, ajouter le colorant de charge, et charger sur un gel d&#39;agarose. Exécutez le gel, et tacher de l&#39;ADN en utilisant le bromure d&#39;éthidium. Le gel doit être teinté post-électrophorèse plutôt qu&#39;avant électrophorèse, pour empêcher le SDS d&#39;interférer avec la distribution de bromure d&#39;éthidium dans le gel. </li></ol>

<ol>
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J., Furlong, D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+DNA-binding+protein+with+regulatory+and+protective+roles+in+starved+Escherichia+coli.">A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli.</a> Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).</li><li>Chiancone, E., Ceci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multifaceted+capacity+of+Dps+proteins+to+combat+bacterial+stress+conditions:+Detoxification+of+iron+and+hydrogen+peroxide+and+DNA+binding.">The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding.</a> Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).</li><li>Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase-dependent+variation+in+protein+composition+of+the+Escherichia+coli+nucleoid.">Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid.</a> J. 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Nous n&#39;avons rien à révéler.

Le procédé de purification de Dps comme décrit dans cet article est très robuste. Pureté a toujours été élevé (&gt; 99%); pas d&#39;autres protéines apparaissent sur gels SDS-PAGE que des bandes visibles. Malgré cela, certains lots de Dps purifiés semblent avoir une activité nucléase, comme en témoigne la dégradation de l&#39;ADN partielle lorsqu&#39;ils sont incubés avec des concentrations très élevées de Dps. Cela pourrait indiquer la présence d&#39;DNases très actifs à faible concentration que ...

Les organismes aérobies doivent constamment composer avec les espèces réactives de l&#39;oxygène qui peuvent endommager leur ADN ainsi que d&#39;autres macromolécules biologiques cruciales. Un outil puissant pour contrer les effets toxiques du stress oxydatif est la protéine de liaison d&#39;ADN à partir de cellules privées (DPS). Depuis sa découverte en 1992 du affamé E. coli culture 1, Dps a été identifié dans plus de 300 espèces de bactéries et archéobactéries 2. Régulation à la hausse massive des Dps pendant la phase stationnaire rend la protéine nucleoid associée plus fortement exprimé de E. coli dans des conditions de famine 3, 4. En outre, Dps a été montré pour préserver à la fois la viabilité bactérienne et l&#39;intégrité de l&#39;ADN pendant de nombreuses diverses contraintes, notamment la famine, la concentration élevée en fer, exposition à la lumière UV, le choc thermique, et le stress oxydatif 5, 6. Structurellement, Dps auto-associés dans un complexe homo-oligomères stable de 12 monomères, which assembler en une coquille creuse sphérique. La cavité interne ~ 4,5 nm à l&#39;échelle est accessible au solvant par des pores qui permettent le passage de petites molécules 7 extérieur, et il peut séquestrer les métaux tels que le fer minéralisées 8. L&#39;effet protecteur de Dps tire de ses différentes activités biochimiques, qui comprennent les liaisons non spécifiques ADN 1, l&#39;activité ferroxydase et stockage du fer 8. Une étude détaillée des activités biochimiques bénéfiques de Dps exige d&#39;abord sa purification. Dps purification est une procédure complexe, comme Dps doivent être séparés non seulement d&#39;autres protéines, mais aussi de tout ADN lié 7. Notre processus de purification optimisé utilise de nombreuses techniques communes, composé de deux colonnes échangeuses d&#39;ions et une étape de précipitation de sulfate d&#39;ammonium. Plusieurs échanges tampons sont nécessaires, comme Dps très concentrés peuvent précipiter hors de la solution dans de faibles conditions de sel. Une fois la protéine Dps a été purifiée, Il peut être appliqué à des tests qui mesurent directement son activité ferroxydase 8, stoechiométrie DNA-binding 9, et les mécanismes de fixation du fer 10. Dps purifiées a également d&#39;autres applications potentielles. La structure sphérique creuse du Dps a été utilisé comme échafaudage pour stocker des particules hydrophobes à l&#39;intérieur de la cavité de la protéine 11 et même comme une chambre de réaction pour synthétiser de nouveaux nanoparticules magnétiques 12. La capacité de protection de Dps à la médiation dommages causés par les espèces réactives de l&#39;oxygène peut être clairement et directement démontré en utilisant le test de protection de l&#39;ADN 13, 14. Dans cette procédure in vitro, les espèces radicalaires sont produites lorsque le fer catalyse H 2 O 2 à la dégradation par la chimie de Fenton. Ces radicaux endommager directement l&#39;ADN présent dans la réaction et peuvent complètement se dégrader à des concentrations élevées. Deux activités DPS clés peuvent aussi contrer directement les effets de Fentla production de radicaux sur-médiatisée. Dps abaisse la concentration en fer catalytique par minéralisation, consommant du peroxyde d&#39;hydrogène disponible dans le procédé. En outre, Dps liaison à l&#39;ADN peut potentiellement protéger physiquement les dommages des radicaux et se condense en un petit volume avec une surface moins réactif. La combinaison de ces deux propriétés rend le dosage de la protection de l&#39;ADN bien adapté dans le but de mesurer l&#39;activité Dps protection. L&#39;essai de protection de l&#39;ADN est très polyvalent et peut être utilisé pour une variété d&#39;applications au-delà Dps caractérisation. Les dommages des radicaux est une forme courante de stress dans les cellules, et de nombreuses protéines et de produits chimiques sont utilisés pour la contrecarrer. Le principe général de l&#39;épreuve, en utilisant l&#39;intégrité de l&#39;ADN comme marqueur pour les dommages des radicaux, peut être utilisé en combinaison avec presque aucune réaction produisant des radicaux ou agent de contrecarrer. Entre autres, le test a été utilisé avec succès pour déterminer les propriétés anti-oxydantesde K. Extrait paniculata pour une utilisation dans l&#39;industrie alimentaire 15, pour caractériser les effets de l&#39;acide urique sur les dommages hydroxyle médiation 16, et d&#39;acquérir de nouvelles connaissances sur la fonction de la fourrure de la transcription des protéines de régulation 17. Malgré les nombreuses utilisations de l&#39;analyse dans les documents publiés, nous avons constaté que beaucoup d&#39;optimisation et de dépannage sont nécessaires, ce qui rend la mise en place du dosage pour la première fois un processus inutilement laborieux pour de nombreux chercheurs. Le protocole que nous présentons dans cet article vise à supprimer cette barrière à l&#39;entrée.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21(DE3)pLysS competent cells</td>
 <td>Promega</td>
 <td>L1195</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pET-17b DNA</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>69663-3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB broth powder</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>L3022</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ampicillin sodium salt</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A0166</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C0378</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>I6758</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>BDH</td>
 <td>441476L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium hydroxide</td>
 <td>Merck</td>
 <td>105033</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium chloride</td>
 <td>VWR</td>
 <td>443824T</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E9884</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease Inhibitor Cocktail Set III</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>539134</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEAE-Sepharose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>DFF100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium sulphate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A4418</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PD-10 Desalting Columns</td>
 <td>GE Healthcare LS</td>
 <td>17-0851-01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SP-Sepharose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S1799</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO)</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC901024</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ferrous Sulphate heptahydrate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F8048</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>216763</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MOPS</td>
 <td>Calbiochem</td>
 <td>475898</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SDS solution</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>161-0418</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethidium bromide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E1510</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Model</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Static incubator</td>
 <td>Hettich</td>
 <td>INE500</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Shaking Incubator </td>
 <td>New Brunswick Sc.</td>
 <td>Inova 44</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cooled centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Avanti J-E</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top centrifuge</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5424</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell disrupter</td>
 <td>Constant Systems Ltd.</td>
 <td>TS2/40/AA/AA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FPLC Purifier</td>
 <td>General Electric</td>
 <td>AKTA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Airtight vials</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>EW-08918-85</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe needles</td>
 <td>BD</td>
 <td>305128</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipettes</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>Z683779-1EA, Z683795-1EA</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

application of an in vitro dna protection assay to visualize stress mediation properties of the dps protein

Le stress oxydatif est un sous-produit inévitable de la vie aérobie. L&#39;oxygène moléculaire est essentielle pour le métabolisme terrestre, mais elle participe également à de nombreuses réactions néfastes au sein des organismes vivants. La combinaison du métabolisme aérobie et de fer, qui est un autre composé essentiel pour la vie, est suffisant pour produire des radicaux grâce à la chimie de Fenton et dégrader les composants cellulaires. dégradation de l&#39;ADN est sans doute le processus le plus dommageable impliquant radicaux intracellulaires, comme la réparation de l&#39;ADN est loin d&#39;être trivial. L&#39;analyse présentée dans cet article propose une technique quantitative de mesurer et de visualiser l&#39;effet des molécules et enzymes sur lésions de l&#39;ADN induites par des radicaux. L&#39;essai de protection de l&#39;ADN est un outil simple, rapide et robuste pour la caractérisation in vitro des propriétés protectrices de protéines ou de produits chimiques. Elle consiste à exposer l&#39;ADN à une réaction d&#39;oxydation nuisible et en ajoutant des concentrations variables du composé d&#39;intérêt. La réduction ou l&#39;augmentation de l&#39;altération de l&#39;ADN en fonction de la concentration du composé est ensuite visualisées par électrophorèse sur gel. Dans cet article, nous démontrons la technique du test de protection de l&#39;ADN en mesurant les propriétés protectrices de la protéine de liaison d&#39;ADN à partir de cellules privées (DPS). Le DPS est un mini-ferritine qui est utilisé par plus de 300 espèces de bactéries pour lutter puissamment facteurs de stress environnementaux. Ici, nous présentons le protocole de purification Dps et les conditions de dosage optimisé pour évaluer la protection de l&#39;ADN par Dps.

Le procédé de purification pour Dps décrits ici est très reproductible. Dps purification selon le protocole décrit, en utilisant 2 L de E. culture coli comme point de départ, va typiquement donner 2,5 ml de protéine contenant Dps 12 à des concentrations comprises entre 5 et 12 um. Temps d&#39;induction plus longue (4 heures) semblent réduire cette variabilité. la pureté des protéines est constamment au-dessus de 99%, comme en témoignent les gels SDS-PAGE (Figure 1).</str...

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Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

La protéine de liaison à l&#39;ADN des cellules privées (DPS) joue un rôle crucial dans la lutte contre le stress bactérienne. Cet article traite de la purification de l&#39;<em&gt; E. coli</em&gt; Dps et le protocole pour une<em&gt; In vitro</em&gt; Essai démontrant protection Dps médiée par de l&#39;ADN de la dégradation par les espèces réactives de l&#39;oxygène.

Application d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; DNA Assay Protection de bien visualiser les propriétés de médiation du stress de la protéine Dps

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

11.1K vues.  Delft University of Technology. La protéine de liaison à l'ADN des cellules privées (DPS) joue un rôle crucial dans la lutte contre le stress bactérienne. Cet article traite de la purification de l' E. coli Dps et le protocole pour une In vitro Essai démontrant protection Dps médiée par de l'ADN de la dégradation par les espèces réactives de l'oxygène.

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An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

Une In vitro Essai FluoroBlok invasion tumorale

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Recherche

Biologie

Application of Stopped-flow Kinetics Methods to Investigate the Mechanism of Action of a DNA Repair Protein

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic information including active site concentrations and intrinsic rate constants that govern macromolecular function. In case of enzymes, for example, transient or pre-steady state measurements identify and characterize individual events in the reaction pathway, whereas steady state measurements only yield overall catalytic efficiency and specificity. Individual events such as protein-protein or protein-ligand interactions and rate-limiting conformational changes often occur in the millisecond timescale, and can be measured directly by stopped-flow and chemical-quench flow methods. Given an optical signal such as fluorescence, stopped-flow serves as a powerful and accessible tool for monitoring reaction progress from substrate binding to product release and catalytic turnover1,2.
Here, we report application of stopped-flow kinetics to probe the mechanism of action of Msh2-Msh6, a eukaryotic DNA repair protein that recognizes base-pair mismatches and insertion/deletion loops in DNA and signals mismatch repair (MMR)3-5. In doing so, Msh2-Msh6 increases the accuracy of DNA replication by three orders of magnitude (error frequency decreases from ~10-6 to10-9 bases), and thus helps preserve genomic integrity. Not surprisingly, defective human Msh2-Msh6 function is associated with hereditary non-polyposis colon cancer and other sporadic cancers6-8. In order to understand the mechanism of action of this critical DNA metabolic protein, we are probing the dynamics of Msh2-Msh6 interaction with mismatched DNA as well as the ATPase activity that fuels its actions in MMR. DNA binding is measured by rapidly mixing Msh2-Msh6 with DNA containing a 2-aminopurine (2-Ap) fluorophore adjacent to a G:T mismatch and monitoring the resulting increase in 2-aminopurine fluorescence in real time. DNA dissociation is measured by mixing pre-formed Msh2-Msh6 G:T(2-Ap) mismatch complex with unlabeled trap DNA and monitoring decrease in fluorescence over time9. Pre-steady state ATPase kinetics are measured by the change in fluorescence of 7-diethylamino-3-((((2-maleimidyl)ethyl)amino)carbonyl) coumarin)-labeled Phosphate Binding Protein (MDCC-PBP) on binding phosphate (Pi) released by Msh2-Msh6 following ATP hydrolysis9,10.
The data reveal rapid binding of Msh2-Msh6 to a G:T mismatch and formation of a long-lived Msh2-Msh6 G:T complex, which in turn results in suppression of ATP hydrolysis and stabilization of the protein in an ATP-bound form. The reaction kinetics provide clear support for the hypothesis that ATP-bound Msh2-Msh6 signals DNA repair on binding a mismatched base pair in the double helix.
F. Noah Biro and Jie Zhai contributed to this paper equally.

Msh2-Msh6 is responsible for initiating repair of replication errors in DNA. Here we present a transient kinetics approach towards understanding how this critical protein works. The report illustrates stopped-flow experiments for measuring the coupled DNA binding and ATPase kinetics underlying Msh2-Msh6 mechanism of action in DNA repair.

Application des méthodes Kinetics stopped-flow pour étudier le mécanisme d&#39;action d&#39;une protéine réparation de l&#39;ADN

Transient kinetic analysis is indispensable for understanding the workings of biological macromolecules, since this approach yields mechanistic ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the physical properties of the nucleus contribute significantly to the overall biomechanical behavior of cells under physiological and pathological conditions. For example, in migrating neutrophils and invading cancer cells, nuclear stiffness can pose a major obstacle during extravasation or passage through narrow spaces within tissues.1 On the other hand, the nucleus of cells in mechanically active tissue such as muscle requires sufficient structural support to withstand repetitive mechanical stress. Importantly, the nucleus is tightly integrated into the cellular architecture; it is physically connected to the surrounding cytoskeleton, which is a critical requirement for the intracellular movement and positioning of the nucleus, for example, in polarized cells, synaptic nuclei at neuromuscular junctions, or in migrating cells.2 Not surprisingly, mutations in nuclear envelope proteins such as lamins and nesprins, which play a critical role in determining nuclear stiffness and nucleo-cytoskeletal coupling, have been shown recently to result in a number of human diseases, including Emery-Dreifuss muscular dystrophy, limb-girdle muscular dystrophy, and dilated cardiomyopathy.3 To investigate the biophysical function of diverse nuclear envelope proteins and the effect of specific mutations, we have developed experimental methods to study the physical properties of the nucleus in single, living cells subjected to global or localized mechanical perturbation. Measuring induced nuclear deformations in response to precisely applied substrate strain application yields important information on the deformability of the nucleus and allows quantitative comparison between different mutations or cell lines deficient for specific nuclear envelope proteins. Localized cytoskeletal strain application with a microneedle is used to complement this assay and can yield additional information on intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton. Studying nuclear mechanics in intact living cells preserves the normal intracellular architecture and avoids potential artifacts that can arise when working with isolated nuclei. Furthermore, substrate strain application presents a good model for the physiological stress experienced by cells in muscle or other tissues (e.g., vascular smooth muscle cells exposed to vessel strain). Lastly, while these tools have been developed primarily to study nuclear mechanics, they can also be applied to investigate the function of cytoskeletal proteins and mechanotransduction signaling.

We present two independent, microscope-based tools to measure the induced nuclear and cytoskeletal deformations in single, living adherent cells in response to global or localized strain application. These techniques are used to determine nuclear stiffness (i.e., deformability) and to probe intracellular force transmission between the nucleus and the cytoskeleton.

Tests biophysiques pour sonder les propriétés mécaniques du noyau cellulaire interphase: Application Strain Substrat et manipulation Microneedle

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

À long terme des essais de toxicité létale avec le Crustacé Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro test de Méthylation à étudier des protéines méthylation de l&#39;arginine

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Comet Assay comme une mesure indirecte de stress oxydatif systémique

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

Mesure de dommages et réparation de l&#39;ADN dans les splénocytes de souris Après chronique<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;exposition à de très faibles doses de bêta et gamma Rayonnement

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Immunoprécipitation de la chromatine test pour l&#39;identification de Arabidopsis interactions protéine-ADN<em&gt; In Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

L&#39;Assemblée et l&#39;application des «Shear Anneaux»: A Novel Endothelial Modèle pour Orbital, unidirectionnel et périodique Fluid débit et contrainte de cisaillement

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. To improve the mating efficiency of B. Xylophilus and to increase the chances of mating observation, virgin adults were cultured and used for the investigation. Eggs were obtained by keeping the nematodes in water and allowing the females to lay eggs for 10 min. The second-stage juveniles (J2) were synchronized by incubating the eggs for 24 h at 25 &#176;C in the dark, and the early J4 were obtained by culturing the J2 with grey mold, Botrytis cinerea, for another 52 h. At this time point, most J4 nematodes could be clearly distinguished as being male or female using their genital morphology. The male and female J4 were collected and cultured separately in two different Petri dishes for 24 h to get virgin adult nematodes. A virgin male and a virgin female were paired in a drop of water in the well of a concave slide. The mating behavior was filmed with a video recorder under a stereomicroscope. The whole period of the mating process was 82.8 &#177;3.91 min (mean &#177;SE) and could be divided into 4 different phases: searching, contacting, copulating, and lingering. The mean minutes of duration were 21.8 &#177; 2.0, 28.0 &#177; 1.9, 25.8 &#177; 0.7 and 7.2 &#177; 0.5, respectively. Eleven sub-behaviors were described: cruising, approaching, encountering, touching, hooping, locating, attaching, ejaculating, separating, quiescence, and roaming. Interestingly, obvious intra-sexual competition was observed when one female was grouped with 3 males or one male with 3 females. This protocol is useful and valuable, not only in investigating the mating behavior of B. xylophilus, but also in acting as a reference for ethological studies of other nematodes.

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

Observation et Quantification de Mating Comportement dans le nématode,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...