Ce travail a été financé en partie par des fonds de l&#39;Institut Pasteur et par des subventions de la Ligue Nationale contre le Cancer (subventions R05/75-129 et RS07/75-75), l&#39;Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC subventions A09 / 1/5031 et 4867), et l&#39;Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 et 026 01 ANR09 MIEN). MM a été récipiendaire d&#39;une bourse MENRT.

1. Levures Examens double-hybride <ol><li> Faire les solutions requises suivantes: <ol><li> Complete Out Drop synthétique (SD): dissoudre 26,7 g de la base minimale SD avec du glucose dans 1 litre d&#39;eau. Ajouter 2 g de mélange d&#39;acide aminé préparée comme suit: 2 g hemisulfate Adénine, 2 HCl arginine g, 2 HCl histidine g, 2 g Isoleucine, 4 g de leucine, 2 HCl lysine g, 2 g de méthionine, 3 g phénylalanine, 2 g L -sérine, 2 g de L-thréonine, le tryptophane 3 g, 2 g Tyrosine, 1,2 g uracile, 9 g de valine. </li><li> Baisse sélective Out SD-L/-W/-H: SD contenant tous les acides aminés essentiels, sauf celles spécifié (-L:-leucine;-W:-tryptophane;-H:-histidine). </li><li> YPGlu: Pour 1 L, poids 10 g d&#39;extrait de levure, 10 g de Bactopeptone et 20 g de glucose. Complet avec 25 g Bacto agar pour un milieu solide. </li><li> YCM: Idem YPGlu, mais le pH ajusté à 4,5. </li></ol></li><li> L&#39;accouplement et la diffusion <ol><li> Utilisez portions congelées de pré-transformationed Y187 souche de levure (mating type α) contenant une banque d&#39;ADNc cloné dans pACT2. Vérifier la viabilité des cellules en étalant des dilutions en série sur des plaques SD-L. </li><li> Clonage de l&#39;ORF pathogène dans pGBKT7 vecteur, et de transformer le plasmide recombinant utilisant une procédure standard dans AH109 souche de levure (mating type a). </li><li> Propagation pGBKT7 transformées AH109 levure sur des plaques SD-W. Incuber deux jours au moins 30 ° C dans un incubateur humidifié. Les plaques peuvent être conservés à 4 ° C jusqu&#39;à ce que le dépistage du double hybride. </li><li> Utilisation 3-aminotriazole (3-AT), un inhibiteur compétitif de l&#39;enzyme HIS3, pour contrer le potentiel d&#39;auto-transactivation du gène rapporteur HIS3 par les protéines de l&#39;pathogènes. Effectuer un test d&#39;auto-activation par la détermination de la concentration de 3-AT, ce qui empêche la croissance de la levure transformée pGBKT7 sur des plaques SD-W/-H. </li><li> Seed 30 ml de SD-W avec quelques colonies de pGBKT7 transformé AH109. Incuber 30 heures à 30 ° C avec rotation. </li><li> Seed 200 ml de SD-W avec les 30 mldes AH109 cultures. Incuber avec rotation autour de 20 heures à 30 ° C. </li><li> Incuber décongelé ADNc bibliothèque transformée Y187 dans 20 ml YPGlu, incuber 10 min à 30 ° C avec rotation. </li><li> Centrifugeuse un volume de pGBKT7 transformé AH109 culture correspondant à une quantité équivalente de Y187 cellules de levure viables pendant 5 min à 3500 rpm à 20 ° C. Retirer délicatement le surnageant et remettre le culot dans 10 ml YPGlu. </li><li> Mélanger la levure AH109 remis en suspension avec Y187 bibliothèque contenant. Transférer dans un tube de 50 ml. Centrifuger 5 min à 3500 rpm à 20 ° C, retirer soigneusement le surnageant (fragile granulés). </li><li> Remettre le culot en YPGlu pour obtenir un total de 1,5 ml. </li><li> levure de propagation à 3 YCM-Agar plaques de 150 mm, 0,5 ml / plaque. Incuber 4,5 heures à 30 ° C. </li><li> Recueillir levure accouplé à partir de plaques YCM en grattant avec un verre de râteau dans 10 ml de SD-L/-W/-H. Rincer les plaques deux fois avec 5 ml de milieu SD-L/-W/-H et la piscine. </li><li> Centrifuger 5 min à 3500 rpm, 20° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 levure moyen SD-L/-W/-H ml. </li><li> Étaler la levure accouplé à 10 plaques (0,5 ml / plaque) d&#39;agar SD-L/-W/-H complétées avec la concentration appropriée de 3-aminotriazole (3-AT) déterminé dans le test d&#39;auto-activation. Incuber à 30 ° C dans une atmosphère humidifiée pour 6-10 jours. </li><li> Déterminer le taux de diploïdes (2n), afin d&#39;évaluer l&#39;efficacité de l&#39;accouplement en étalant 250 ul de dilutions en série (10 -4 à 10 -6) de la suspension de levure accouplées sur des plaques de SD-L/-W. Incuber les plaques à 30 ° C pendant deux jours. Compter les colonies cultivées sur SD-L/-W, et en déduire le nombre diploïde totale présente dans le volume initial de levure accouplés. Signaler ce nombre diploïde de viable nombre de levure bibliothèque contenant de calculer le taux diploïde. Il devrait se situer autour de 10-25%. </li><li> 6-10 jours après incubation à 30 ° C, prélever des colonies de levures accouplées à SD-L/-W/-H frais + 3-AT plaques. [Astuce: pour la levure dans un schéma de 8voies de 12 puits reproduisant une plaque de 96 puits de sorte qu&#39;il sera plus facile ensuite pour le séquençage]. Laissez colonies de levures se développent pendant 4-5 jours à 30 ° C dans une atmosphère humidifiée. </li></ol></li><li> Dépistage de his3 clones positifs par PCR et séquençage L&#39;objectif est d&#39;amplifier par PCR l&#39;ORF contenue dans les pACT2 vecteurs de colonies de levures cultivées sur des plaques de SD-L/-H/-W sélectifs. <ol><li> Mettez une plaque à 96 puits PCR sur la glace. </li><li> Pour lyse des cellules de levure, ajouter 50 ul par puits d&#39;une solution 20T zymolase (2,5 mg / ml dans 10 mM de tampon HEPES pH 7,7). </li><li> Resuspendre doucement une colonie par puits. </li><li> Incuber 15 minutes à 37 ° C et 15 min à 95 ° C. </li><li> Mettez la plaque arrière sur la glace. Ajouter 50 ul d&#39;eau distillée par puits. Bien mélanger par pipetage de haut en bas. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 3500 rpm et 4 ° C. </li><li> Amplifier par PCR de 10 ul de détecter une insertion en utilisant des amorces de recuit les deux côtés de l&#39;ORF dérivés d&#39;ADNc dans des vecteurs PACT2. Le protocole est gompte tenu de l&#39;amplification de 96 colonies de levures lysées avec le ExTaq polymérase. Préparer le mélange suivant: 525 pi de tampon 10X ExTaq, 420 pl dNTP mix (2,5 mM), 10,5 ul Forward Primer (1 pg / pl), 10,5 ul amorce inverse (1 pg / pl), 31,5 ul ExTaq (5 U / pl ) et 3202,5 ​​pi H 2 0. Distribuer 40 ul du mélange par puits dans une plaque PCR 96 puits. Ajouter 10 ul de levure lysée par puits. Effectuer une amplification comme suit: 94 ° C pendant 3 min, puis 35 cycles à 94 ° C pendant 30 sec, 60 ° C pendant 1 min, 72 ° C pendant 4 min, et se terminent par 72 ° C pendant 7 min. Exécuter 3 ul des produits de PCR sur un gel d&#39;agarose à 1,2% pour détecter des clones positifs à la PCR. Notez que l&#39;utilisation préfabriqué 96 et des gels d&#39;agarose est recommandé. [Astuce: plaque peut être conservé à -20 ° C pendant quelques mois et réutilisée pour une nouvelle PCR] </li><li> Séquencer les fragments amplifiés par PCR isolés de HIS3 clones positifs. Effectuer une analyse de BLAST pour identifier cellulaire ORF. Alignements faible confiance (E &amp; valeurgt; 10 -10, identité &lt;80%, longueur peptide &lt;20 acides aminés) sont rejetés ainsi que frameshifted et codon stop prématuré contenant des séquences. </li></ol></li></ol> 2. Bâtiment matrice pour HT-ACPG HT-ACPG est un test basé sur des cellules de mammifères où les deux protéines pathogènes et l&#39;hôte sont exprimés transitoirement fusionné avec des fragments complémentaires de la scission Gaussia princeps luciférase. Lors de l&#39;interaction des partenaires, cette enzyme est reconstitué en permettant la mesure de son activité enzymatique. L&#39;intensité de l&#39;interaction est donc déduit un ratio de Luminescence normalisé (voir ci-dessous et la figure 1) <ol start="4"><li> Sélection des partenaires de la cellule hôte <ol><li> Sélectionnez protéines qui sont identifiés plus de trois fois dans les projections Y2H pour une validation supplémentaire dans les cellules de mammifères pour augmenter la confiance des données 9. </li><li> Ajouter partenaires d&#39;interaction connues des protéines pathogènes comme positive contrôles. </li></ol></li><li> Transférer dans des vecteurs compatibles HT-ACPG <ol><li> Cloner chaque protéine ORF pathogène dans un vecteur pSPICA-N2 pour générer des protéines pathogènes avec des acides aminés 110 à 185 des princeps Gaussia humanisés luciférase soudés à leur extrémité N-terminale (fusions de protéines GL2-pathogène). </li><li> Amplifier par PCR protéine cellulaire ORF directement à partir des clones positifs Y2H ou de l&#39;ORF autres ressources (ORFéome humain <a href="http://horfdb.dfci.harvard.edu/" target="_blank">http://horfdb.dfci.harvard.edu/</a> ) et de les transférer dans des vecteurs pSPICA-N1 pour générer des protéines fusionnés à l&#39;extrémité N-terminale avec les acides aminés 18-109 de humanisé Gaussia princeps luciférase (fusions de protéines GL1-hôte). [Astuce: Pour le clonage à grande échelle, le système de clonage Gateway est recommandé. Dans ce cas, pour l&#39;amplification PCR, utiliser des amorces conçues pour contenir des sites compatibles Gateway]. </li><li> Séquence tous les vecteurs d&#39;expression. Séquences de la pSPICA-N1-N2 et pSPICApeut être trouvée dans la référence 8. </li></ol></li></ol> Notez que les constructions de plasmide peut être inversée, c&#39;est à dire les protéines pathogènes dans pSPICA-N1 et accueil protéine dans pSPICA-N2. 3. High-Throughput Gaussia princeps luciférase-Based Assay de complémentation protéique (HT-ACPG) <ol start="6"><li> La transfection cellulaire <ol><li> cellules 293T de semences à 350.000 cellules / ml de DMEM avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), sans antibiotique. Distribuer 100 pl / puits dans des plaques de culture stériles blanches. Ne pas dépasser 10 plaques en une seule expérience. Laissez cellules se développent pendant 24 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2. [Astuce:. Depuis les plasmides pSPICA contiennent une origine SV40, l&#39;utilisation de cellules 293T permet leur réplication dans les cellules transfectées et donc conduit à la surexpression des deux fragments de luciférase] </li><li> Le lendemain, transfecter des cellules à l&#39;aide de n&#39;importe quel protocole de transfection approprié. Notez que pour certains réactifs de transfection, le numbre de cellules ensemencées peut être adapté. Utilisez 100 ng par puits à la fois l&#39;agent pathogène et hôte ORF des constructions plasmidiques. Co-transfect 10 ng par puits d&#39;une de CMV-luciférase Firefly plasmide pour normaliser l&#39;efficacité de la transfection. Chaque point est testé en triple. [Astuce:. Mélanges d&#39;ADN peuvent être effectuées la veille de la transfection et conservés à -20 ° C avec des joints adhésifs] </li><li> Transfert mélange de transfection pour les plaques de cellules 293T culture. Attention à déposer délicatement le mélange de l&#39;ADN sur les cellules, comme 293T ne sont pas fortement adhérent et se détachent facilement du fond du puits. Incuber dans un incubateur de culture cellulaire pour 24-30 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol></li></ol><ol start="7"><li> La lyse des cellules et Gaussia dosage de la luciférase <ol><li> Laver les cellules avec du PBS (100 pl / puits). Ajouter 40 tampon de lyse 1X Rénilla ul. Incuber pendant 30 min à température ambiante sous agitation. </li><li> Économisez 10 pi de lysats de cellules dans un autre plat blance pour le dosage ultérieur de l&#39;activité de la luciférase de luciole. Conserver à 4 ° C ou bien à -20 ° C avec joint d&#39;étanchéité. </li><li> Mesurer l&#39;activité Gaussia sur les 30 pi restants de lysats de cellules en ajoutant 100 ul de réactif de dosage de la luciférase Renilla et de comptage luminescence pendant 10 secondes avec un luminomètre. Dosage d&#39;une plaque de 96 puits prend environ une demi-heure. Effectuer la mesure avec des extraits de cellules fraîches depuis la congélation ou à long terme peut affecter l&#39;activité Gaussia interaction médiée. </li></ol></li></ol><ol start="8"><li> Mesure de l&#39;activité Firefly <ol><li> Mesurer l&#39;activité Firefly sur le économisé 10 pi de lysats de cellules en ajoutant 50 pl de Firefly réactif de dosage de la luciférase et de comptage luminescence pendant 10 sec. Dosage d&#39;une plaque de 96 puits prend environ une demi-heure. [Astuce: Le dosage de la luciférase Firefly peut être effectuée le lendemain sur les lysats congelés.] </li></ol></li></ol><ol start="9"><li> Calculs de NLR <ol><li&gt; A chaque interaction, calculer le rapport entre l&#39;activité de luciférase de luciole et de Gaussia activité luciférase pour obtenir une valeur de luminescence Gaussia normalisée en tenant compte de l&#39;efficacité de transfection et de la viabilité des cellules. Calculer la moyenne des trois exemplaires. </li><li> Pour surveiller l&#39;interaction, estimer un rapport de Luminescence normalisé (NLR) pour chaque paire pathogène-hôte. Pour ce faire, il faut diviser l&#39;activité de luminescence Gaussia normalisée détectée en présence de l&#39;agent pathogène et les deux protéines de l&#39;hôte par la somme des activités mesurées dans les puits de contrôle (figure 1 d&#39;après la référence 8). Le NLR valeur seuil pour les interactions positives a été estimée à environ 3,5 8. </li></ol></li></ol><ol start="10"><li> L&#39;analyse des données <ol><li> Effectuer classification hiérarchique utilisant le paquet statistique R. Tout d&#39;abord, grouper les données de NLR dans des catégories, puis calculer un dendrogramme d&#39;interaction en utilisant la méthode de liaison complète. Visualiser cettedendrogramme avec JavaTreeView 10. Calculez la distance entre dendrogramme de l&#39;interaction et de l&#39;arbre phylogénétique en utilisant un coefficient de corrélation de Pearson. </li><li> Pour générer des réseaux d&#39;interaction, sélectionnez les interactions positives de l&#39;ensemble de données HT-ACPG et utiliser le logiciel Cytoscape 1. Extraire les degrés des protéines de l&#39;hôte et tracer leur distribution pour accéder aux dynamiques locales réseau. Réseaux pathogènes hôte peuvent être superposées à la Interactome hôte de fournir une évaluation de l&#39;impact global des protéines pathogènes dans le réseau cellulaire de l&#39;hôte. </li><li> Extraire le GO (Gene Ontology) termes associés aux facteurs cellulaires ciblés avec la base de données bioinformatiques DAVID 12 pour évaluer l&#39;enrichissement fonctionnel de l&#39;ensemble de données. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Protoc. 4, 44-57 (2009).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genotype+comparison+of+human+papillomavirus+E2-host+interaction+networks+provides+new+insights+for+e2+molecular+functions.">Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions.</a> PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).</li><li>Neveu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+virus-host+interactomes+with+a+mammalian+high-throughput+protein+complementation+assay+based+on+Gaussia+princeps+luciferase.">Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase.</a> Methods. , (2012).</li><li>Braun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimentally+derived+confidence+score+for+binary+protein-protein+interactions.">An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions.</a> Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Indépendamment, la levure deux essais d&#39;interaction hybrides et les mammifères, comme la TPS déroulant, LUMIER ou MAPPIT, se sont avérés être des outils efficaces pour détecter les interactions protéine-protéine, mais sont limitées par le taux élevé de faux positifs et de faux négatifs interactions associés à ces techniques 15. En outre, les preuves sont de plus en plus que la combinaison de méthodes orthogonales augmente la fiabilité de l&#39;ensemble de données d&#39;interaction obtenu...

La quantité croissante de données recueillies pour produire des cartes d&#39;interaction protéine-protéine ouvre des perspectives pour mieux comprendre les infections pathogènes. Comme compréhension globale des infections pathogènes commence à émerger, il donne accès à la gamme des perturbations induites par les protéines pathogènes lors de la connexion du protéome humain 1. Il offre ainsi un moyen de comprendre comment les agents pathogènes manipuler la machinerie de la cellule hôte. En particulier, la cartographie de plusieurs réseaux d&#39;interactions virus-hôte a révélé que les protéines virales cibler préférentiellement les protéines hôtes qui sont fortement connectés dans le réseau cellulaire (hubs), ou qui sont au cœur de nombreux chemins dans un réseau (protéines goulets d&#39;étranglement) 2-4. Ces interactions permettent virus de manipuler les processus cellulaires importants, ce qui est essentiel à reproduire et produire une descendance infectieuse. Interactions cartographie comparée ont été récemment menées sur des virus apparentés dans le but d&#39;extraire des informations relatives àpathogenèse 4. En outre, des études sur la relation hôte-pathogènes interactions paysage ont été étendues à de nombreux agents pathogènes 5. L&#39;identification des facteurs de cellule ciblée donne un aperçu des stratégies utilisées par les agents pathogènes pour infecter les cellules et permet la détection de marqueurs potentiels pathogènes. Le système double-hybride en levure est la méthode la plus populaire pour identifier les interactions binaires depuis le dépistage génétique est un outil efficace et sensible pour la cartographie à haut débit des interactions protéine-protéine. L&#39;approche proposée ici améliore encore des projections de Y2H individuelles en évaluant une protéine de multiples variantes de souches de pathogènes, offrant ainsi l&#39;accès à une vue d&#39;ensemble comparative des interactions protéine-protéine pathogène-hôte. En outre, une limitation majeure de la levure dépistage double-hybride réside dans un taux de faux négatifs élevés, car il récupère environ 20% du total des interactions 6. Cela implique que les interactions détectées avec seulement un sous-ensemble de pathoGens variantes auraient échappé à la détection avec les autres. Par conséquent, chacun des partenaires issus de toutes les projections de deux hybrides sont rendues encore plus difficiles pour l&#39;interaction avec la gamme complète des souches étudiées, en fournissant des ensembles de données d&#39;interaction comparatifs. Comme il a été démontré que la combinaison de différentes méthodes augmente fortement la robustesse des ensembles de données d&#39;interaction protéine-protéine 7, cette validation est effectuée dans des cellules de mammifères par un essai de complémentation protéique fragment nouvellement développé appelé HT-ACPG 8. Ce système à base de cellules permet la détection des interactions protéine par complémentation de la Gaussia princeps divisé luciférase et a été conçu pour être compatible avec un format à haut débit. Merci à sa technologie luminescence basée et son faible bruit de fond par rapport à d&#39;autres test basé sur la fluorescence, HT-ACPG montre une grande sensibilité frappante. Dans l&#39;ensemble, cette approche constitue un moyen efficaceoutil pour générer une cartographie complète des imbrications hôte-pathogène, ce qui représente la première étape vers une compréhension globale de la cellule hôte détournement.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strains</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal SD base</td>
			<td>US biological</td>
			<td>D9500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>264571000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase</td>
			<td>Seikagaku</td>
			<td>120491</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>31966</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>14190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>15140</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renilla luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2820</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655083</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-wellPCR plates</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4t-i0730/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (30 &deg;C)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &deg;C)</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>Centro XS-LB 960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comparative approach to characterize the landscape of host-pathogen protein-protein interactions

Des efforts importants ont été recueillies pour produire des cartes réseau interactions à grande échelle globale protéine-protéine. Cela est essentiel à comprendre les relations pathogène-hôte et a été essentiellement réalisée par des projections génétiques dans la levure de systèmes à deux hybrides. La récente amélioration de la détection des interactions protéine-protéine par un test de complémentation de fragment luciférase basé Gaussia offre maintenant la possibilité de développer des approches interactomic comparatives d&#39;intégration nécessaires pour comparer rigoureusement les profils d&#39;interaction des protéines de différentes variantes de la souche pathogène contre un ensemble commun de facteurs cellulaires. Ce document se concentre spécifiquement sur ​​l&#39;utilité de la combinaison de deux méthodes orthogonaux pour générer des ensembles de données d&#39;interaction protéine-protéine: deux hybrides de levure (Y2H) et un nouveau test, test à haut débit Gaussia princeps protéines complémentation (HT-ACPG) réalisée dans les cellules de mammifères. nt &quot;&gt; Une identification à grande échelle des partenaires cellulaires d&#39;une protéine pathogène est effectuée par base de levure accouplement projections de deux hybrides de banques d&#39;ADNc en utilisant de multiples variantes de souches de pathogènes. Un sous-ensemble de partenaires d&#39;interaction sélectionnés sur un score de haute fiabilité statistique est plus validé dans les cellules de mammifères pour les interactions par paire avec l&#39;ensemble des agents pathogènes les protéines variantes utilisant HT-ACPG. Cette combinaison de deux méthodes complémentaires améliore la robustesse de l&#39;ensemble de données d&#39;interaction, et permet l&#39;exécution d&#39;une analyse de l&#39;interaction comparatifs rigoureux. Ces interactomique comparatifs constituer une stratégie fiable et puissant pour décrypter toute les imbrications pathogène-hôte.

Une des grandes forces de HT-ACPG réside dans sa sensibilité élevée, comme en témoigne l&#39;évaluation des taux négatifs faux positifs et faux pour la protéine E2 du VPH dans la figure 2 (adapté de la référence 13). Pour déterminer le taux de faux négatifs, les interactions connues de E2 de HPV16 ont été évalués par HT-ACPG (figure 2A). Quatre des 18 interactions n&#39;ont pas été récupérés (correspondant à un taux de faux négatifs de 22%). Les interactions faux...

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A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Cet article se concentre sur l&#39;identification des ensembles de données d&#39;interaction de haut confiantes entre l&#39;hôte et les protéines pathogènes en utilisant une combinaison des deux méthodes orthogonales: deux hybrides de levure suivie d&#39;un test d&#39;interaction à haut débit dans les cellules de mammifères appelé HT-ACPG.

Approche comparative caractérisent le paysage des interactions hôte-pathogène protéine-protéine

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

a-comparative-approach-to-characterize-landscape-host-pathogen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.1K vues.  Institut Pasteur. Cet article se concentre sur l'identification des ensembles de données d'interaction de haut confiantes entre l'hôte et les protéines pathogènes en utilisant une combinaison des deux méthodes orthogonales: deux hybrides de levure suivie d'un test d'interaction à haut débit dans les cellules de mammifères appelé HT-ACPG.

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Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to facilitate cross-presentation of chaperoned antigens and elicit innate and adaptive T cell responses. Xenopus skin graft rejection provides an excellent platform to study the ability of gp96 to elicit classical MHC class Ia (class Ia) restricted T cell responses. Additionally, the Xenopus model system also provides an attractive alternative to mice for exploring the ability of gp96 to generate responses against tumors that have down-regulated their class Ia molecules thereby escaping immune surveillance. Recently, we have developed an adoptive cell transfer assay in Xenopus clones using peritoneal leukocytes as antigen presenting cells (APCs), and shown that gp96 can prime CD8 T cell responses in vivo against minor histocompatibility skin antigens as well as against the Xenopus thymic tumor 15/0 that does not express class Ia molecules. We describe here the methodology involved to perform these assays including the elicitation, pulsing and adoptive transfer of peritoneal leukocytes, as well as the skin graft and tumor transplantation assays. Additionally we are also describing the harvesting and separation of peripheral blood leukocytes used for flow cytometry and proliferation assays which allow for further characterization of the effector populations involved in skin rejection and anti-tumor responses.

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

The frog Xenopus laevis provides an attractive alternative non-mammalian model for exploring the ability of heat shock protein such as gp96 to promote antigen-specific CD8 T cell responses. We present methods to study in vivo facilitation of cross-presentation of skin and tumor antigens by gp96.

Comparative In vivo Etude de gp96 adjuvanticité de la grenouille Xenopus laevis</em

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

Recherche

Immunologie et infection

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

L&#39;utilisation d&#39;un piège optique pour l&#39;étude des interactions hôtes pathogènes pour l&#39;imagerie cellulaire dynamique en direct

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

L&#39;utilisation du modèle EpiAirway pour Caractériser long terme Interactions hôte-pathogène

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics de phages: approches physiologiques à caractériser de nouvelles protéines virales

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Matériaux biomimétiques à caractériser les interactions bactéries-hôtes

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Rétrovirale transduction des cellules T auxiliaires comme une approche génétique pour étudier les mécanismes contrôlant leur différenciation et la fonction

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Un protocole pour caractériser les changements morphologiques de<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En réponse au traitement antibiotique

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infection des larves de poisson zèbre par des spores d’Aspergillus pour l’analyse des interactions hôte-pathogène

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

Flux de travail quantitatif protéomique sans étiquette pour les interactions hôte-pathogène axées sur la découverte

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...