Nous remercions S. Burkhart, C. Hofmann et Simone Gräßle pour une excellente assistance technique et nous sommes reconnaissants à M. Ferg de l&#39;aide à l&#39;analyse des données. Nous remercions également S. Rastegar des commentaires critiques sur le manuscrit. Nous reconnaissons le financement par le Studienstiftung des deutschen Volkes (à MW), la DFG (DI913/4-1) et les Biointerfaces Programme Helmholtz à KIT.

Une. Préparer la dilution de travail de la bibliothèque chimique Prédiluer les composés de la bibliothèque de médicaments à tester (par exemple, la FDA a approuvé la drogue, ENZO Life Science) en E3 (mM de NaCl 5 mM, KCl 0,17, 0,33 mM de CaCl 2) avec un poste de manipulation de liquide robotisé (par exemple Multiprobe II, 8 aiguilles avec adaptateur de pointe d&#39;élimination, PerkinElmer). Des concentrations appropriées sont par exemple 40 pg / ml dans le DMSO à 3%, mais cela dépend du type de bibliothèque utilisée. Les paramètres Multiprobe II correspondant aux étapes décrites ci-dessous sont indiqués dans le tableau 1. Le protocole décrit dans le tableau permet la préparation de quatre plaques d&#39;aliquotes en parallèle. <ol><li> Pipette 10 aliquotes de la bibliothèque de supports (2 mg / ml dans le DMSO) dans des plaques à puits profonds (par exemple, plaque de 96 puits de stockage, ronde Eh bien, 0,8 ml, ABgene). Les colonnes 1 et 12 doivent être laissés vides - ceux-ci reçoivent les contrôles positifs et négatifs au sein de la plaque. </li><l<html> i&gt; Distribuer 490 ul de l&#39;E3 avec 1% de DMSO dans les aliquotes préparés de la bibliothèque avec le Multiprobe II. La dilution est effectuée avec des aiguilles fixes sans conseils d&#39;élimination. </li><li> Ajouter 10 ul de DMSO dans la colonne 1 et 10 pi d&#39;une solution 5 mM de dexaméthasone (dans du DMSO) à la colonne 12 en tant que contrôles au sein de la plaque. La concentration de DMSO dans tous les puits est à présent de 3%, la concentration de la dexaméthasone dans les puits de contrôle positif est de 100 uM dans E3 / 3% de DMSO. </li><li> Sceller la plaque avec résistant DMSO feuilles d&#39;étanchéité adhésives. Stocker les plaques à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 2. Elevage de poissons Reporter Recueillir des embryons de reproduction naturelle des accouplements de groupe entre GRE: poissons Luc transgénique. Levez embryons (pas plus de 60) dans 9 cm des boîtes de Pétri contenant du milieu E3 additionné de 1 mg / ml de bleu de méthylène fongicide jusqu&#39;à 4 jours après la fécondation (DPF) dans un incubateur à 28 ° C. Changer le milieu E3 régulièrement. titre &quot;&gt; 3. Préparation de la luciférase moyenne (E3L) Préparer une solution aqueuse luciférine du stock de 50 mM en ajoutant dH 2 O dans le flacon contenant la poudre de luciférine. Cette solution stock peut être conservé à -80 ° C pendant plusieurs mois. Diluer la luciférine actions dans le milieu E3 à une concentration finale de 0,5 mM pour obtenir milieu E3L. 4. Distribuer larves en plaques à 96 puits <ol><li> Préparer une conseils ml de pipette à large trou en coupant environ 5 mm de la pointe et brièvement enflammé les bords tranchants. </li><li> Piscine larves de plusieurs croisements en les versant avec précaution dans les boîtes de Pétri dans un bécher. Récolte environ 50 larves à la fois en les versant doucement sur un tamis (taille de pore de diamètre 0,25 mm) et placer immédiatement le tamis dans une petite boîte de Pétri (diamètre 5,5 cm) remplie avec du milieu E3L. </li><li> Avec une pointe de pipette alésage large, transférer 225 pi de milieu contenant une larve chacun des puits d&#39;une blanchePlaque de 96 puits (OptiPlate, PerkinElmer). </li><li> Sceller les plaques avec des feuilles d&#39;étanchéité adhésif (par exemple TopSeal-A, PerkinElmer) et incuber à 28 ° C pendant la nuit. Cette pré-incubation empêche l&#39;enregistrement des changements transitoires de la bioluminescence immédiatement après l&#39;addition de luciférine, un phénomène qui se produit également dans des cellules cultivées 19. </li></ol> 5. Traitement de la toxicomanie <ol><li> Retirer la plaque contenant la dilution de travail de la bibliothèque de l&#39;-80 ° C congélateur environ 4 heures avant de l&#39;utiliser. Vortexer doucement la plaque et la faire tourner dans une centrifugeuse pour collecter le liquide au bas de la plaque brièvement. </li><li> Retirer feuilles adhésives d&#39;étanchéité des plaques de larves. </li><li> Avec un dispositif de pipetage à 96 canaux à commande manuelle (par exemple, liquidateur, Steinbrenner) pipette la solution de drogue de haut en bas 3 fois. Puis aliquote de 25 ul de la dilution de travail de la bibliothèque chimique dans les puits contenant les larves (à l&#39;exemple ci-dessus, cettese traduit par une concentration finale de 4 ug / ml dans E3 avec 0,3% de DMSO). Préparer 10 (minimum: 5) plaques de réplique de larves par boîte bibliothèque. </li><li> Sceller les plaques avec les feuilles d&#39;étanchéité adhésifs et étiqueter chaque plaque avec une étiquette code à barres. </li></ol> 6. Luminescence enregistrement <ol><li> Mettez les plaques contenant les larves dans les unités d&#39;empilage d&#39;un lecteur de bioluminescence EnVision avec une sensibilité accrue de luminescence (PerkinElmer). Vous pouvez également utiliser un système d&#39;incubateur robotisée tels que ceux utilisés pour les systèmes de dépistage de culture de cellules de mammifères en combinaison avec le lecteur. </li><li> bioluminescence d&#39;enregistrement pendant deux jours à l&#39;aide de paramètres du lecteur analogues à ceux décrits dans le tableau 2 pour le lecteur EnVision. Adapter le nombre de répétitions de l&#39;essai pour le nombre de plaques dans la course pour correspondre à la durée de fonctionnement requis. </li><li> Après la fin de la course, vérifier les plaques de la présence de larves mortes pour évaluer la toxicité générale de l&#39;échantillonles plaies. </li></ol> 7. Analyse des données Tout l&#39;analyse des données est réalisée dans l&#39;environnement de programmation statistique R en utilisant des scripts. <ol><li> Calcul ASC Afin d&#39;identifier des composés d&#39;activation de signalisation indépendamment de leurs propriétés cinétiques GC, déterminer l&#39;aire sous la courbe (ASC) des traces de luminescence enregistrés (bioluminescence des chiffres bruts en fonction du temps) que le paramètre de dépistage. ASC sont estimés avec la règle du trapèze (voir les figures 2a et a &#39;). </li><li> Normalisation Connectez-vous transformer les valeurs de l&#39;ASC afin d&#39;assurer une normalité plus élevé des données (figures 2b et b &#39;). Puis normaliser les journaux transformé les valeurs d&#39;AUC pour chaque plaque bibliothèque avec la méthode Z-score robuste (voir 20). Cette normalisation résulte en des valeurs représentant le nombre d&#39;écarts types à partir de la médiane de tous les points de données. De cette manière,des erreurs systématiques, tels que la variabilité inter-exécution, sont retirées des données. Les données peuvent maintenant être visualisées en traçant la robuste Z-score moyen des répliques pour chaque puits (figures 2c et c &#39;). </li><li> indicateurs de qualité <ol><li> Heatmap Afin de visualiser les effets de plaque liées, tracer les données de chaque plaque comme une carte thermique, par exemple en utilisant la fonction de heatmap.2 du paquet de GPLOT 21. De cette manière, les effets de bord ou composé report peuvent être facilement détectées (par exemple comparer la figure 3a avec 3b). Exclure plaques sous-optimales de l&#39;analyse. </li><li> Courbe ROC Pour déterminer la sensibilité et la spécificité du test, calculer un receiver operating characteristic (ROC), par exemple avec l&#39;aide de l&#39;ensemble de bioconductor ROC 22 en utilisant les valeurs des Z-scores déterminés à 7,2 (figure 3c). Par la suite, déterminer l&#39;ASC de ce curve. Une valeur proche de 1 ASC est un gage de sensibilité et la spécificité du test. </li></ol></li><li> Hit identification Pour optimiser la valeur limite pour l&#39;identification des composés actifs, déterminer l&#39;indice de Youden. Pour calculer l&#39;indice, il faut soustraire le taux de vrais positifs estimée (TPR) à partir du taux de faux positifs (FPR) de la courbe ROC pour augmenter Z-scores valeurs seuil robustes. Prenez le robuste Z-score de l&#39;indice de Youden plus élevé (TPR moins FPR) comme le point de coupure. La TPR / FPR peut être estimée par la détection de puits témoins positifs ou des substances actives connues au sein de la bibliothèque. Lorsque vous utilisez le contrôle positif puits s&#39;assurer qu&#39;ils correspondent à la force de succès attendu. </li></ol> 8. Un nouvel essai <ol><li> Réévaluer les composés de vie positifs en traitant les larves avec des dilutions en série des composés obtenus à partir d&#39;un fournisseur différent, en utilisant le même enregistrement mis en place décrite ci-dessus. Les vrais résultats devraient induire une luminescencelso dans cet essai, idéalement d&#39;une manière dépendante de la dose. </li></ol>

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Nous n&#39;avons rien à communiquer.

Nous présentons ici le flux de travail et l&#39;analyse de données pour un écran chimique mesurer l&#39;activité de GC in vivo en utilisant le test de grizly 18. Le test a des caractéristiques de contrôle de la qualité et des mesures de rendement qui sont comparables avec des écrans à base de cellules classiques, un avantage important pour son utilisation dans des contextes à haut débit. En outre, cependant, le test in vivo détecte également des composés qui ne sont pas accessibles aux écrans in vitro. Ceci est illustré par la présence de la prégnénolone de prohormone parmi les résultats. Ainsi, le dosage grizly étend le champ d&#39;écrans destinés à l&#39;activité de signalisation de GC. L&#39;importance de la détection des effets in vivo avec notre test est également illustré par les résultats que nous avons obtenus avec l&#39;polluants organostanniques DBT et TBT 18. DBT, mais pas OTC, a été montré pour inhiber la signalisation en GC dans la culture de cellules de mammifères, et on observe la même dans les cultures de cellules de poisson zèbre exprimerment le GRE: Luc journaliste. Fait important, toutefois, dans le dosage Grizly, OTC a montré une activité inhibitrice sur la voie de GC, comme il peut être converti en DBT par le métabolisme des larves. Cette inhibition a déjà été observée à des concentrations dans l&#39;environnement de TBT. Ces résultats illustrent le potentiel du dosage Grizly à détecter des effets de composés à base de inter-organes de diaphonie et métaboliques des modifications des composés à l&#39;animal vivant. Ils mettent également en évidence le potentiel du test grizly surveillance de l&#39;environnement de l&#39;application. Ainsi, les effets perturbateurs endocriniens peuvent être étudiées au niveau de la signalisation du récepteur, où le dispositif disruptif interfère avec l&#39;activité de signalisation de GC induite par un agoniste de GR tel que la dexaméthasone. Une autre possibilité est d&#39;étudier les effets de composés sur la synthèse de prégnénolone GC-stimulé. La qualité à haut débit de l&#39;essai doit permettre le criblage rapide des bibliothèques d&#39;échantillons de l&#39;environnement. L&#39;utilisation de la luciférase comme argène eporter permet une gamme dynamique élevée de détection de l&#39;activité de signalisation 23. En effet, la sensibilité du test permet de détecter osmotique production de GC induite par le stress de larves unique 18. La haute résolution temporelle obtenue avec le rapporteur de la luciférase nous permet de suivre les activités de signalisation au cours du temps, ce qui permet d&#39;analyser la cinétique des données. Un inconvénient potentiel pour certaines applications est l&#39;aptitude limitée à la surveillance spatiale de ce système rapporteur. Systèmes rapporteurs fluorescents pourraient être mieux adaptés pour les tests qui nécessitent une surveillance de certaines régions de la larve. Cependant, de tels dosages peuvent souffrir de sensibilités plus faibles en raison des effets de fond provoqués par la lumière d&#39;excitation, ce qui pose également des limites à la détection de composés fluorescents. En outre, ils peuvent fournir une résolution inférieure en raison de la cinétique de la stabilité généralement supérieure de 23 protéines fluorescentes.En outre, ils présentent des défis en termes de matériel d&#39;imagerie, l&#39;analyse des données et le stockage de données qui pourraient limiter leur utilisation à des laboratoires de recherche plus petits. La mise en place de l&#39;essai grizly comme un test basé sur microplaque permet une intégration facile dans les workflows de dépistage typiques. Le dosage est facilement applicable également dans les petits laboratoires de recherche en raison de sa manipulation simple et l&#39;analyse des données. Dans le même temps, il permet d&#39;une part importante de l&#39;automatisation, par exemple automatisée application du médicament par pipetage ou la distribution automatique des robots d&#39;embryons d&#39;embryons par des dispositifs de tri 24,25. La lecture simple ne nécessite pas de microscopes automatisés de dépistage ou des logiciels d&#39;analyse d&#39;image sophistiqué, mais fournit un riche ensemble de données sur les aspects temporels et quantitatifs de la voie de signalisation de l&#39;étude. En résumé, nous présentons un protocole étape par étape pour un test de criblage chimique relativement peu coûteux, robuste et facile à manipuler pour GCsignalisation de l&#39;activité in vivo et en temps réel. Le test permet de déterminer in vivo les effets des composés sur la GC signalisation non détectable dans la culture de cellules sur la base des dosages. Parmi les nombreuses applications pour l&#39;analyse sont par exemple la détermination des effets génétiques sur la signalisation des glucocorticoïdes, le suivi environnemental des effets des perturbateurs endocriniens sur la synthèse des glucocorticoïdes et de l&#39;activité de signalisation, et le criblage de composés pour des effets indésirables sur la signalisation de GC ou de roman dans modulateurs in vivo de cette voie de signalisation importante.

Les glucocorticoïdes (GCS) sont des hormones stéroïdes produites par les glandes surrénales qui jouent un rôle important au cours de la réponse au stress et à la régulation du métabolisme 1. GC lier les récepteurs glucocorticoïdes cytoplasmiques (GRS) de la superfamille des récepteurs nucléaires qui, lors de la liaison, la translocation dans le noyau 2. Ici, ils peuvent par exemple réprimer la transcription en interférant avec d&#39;autres facteurs de transcription (de transrépression) ou activer la transcription des gènes par des éléments de réponse aux glucocorticoïdes (grès, transactivation). En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les GC à la fois naturels et artificiels sont largement utilisés médicaments dans le traitement de nombreuses maladies telles que l&#39;asthme ou l&#39;arthrite 3. Toutefois, en particulier l&#39;utilisation à long terme de GC peut conduire à des effets secondaires graves, y compris le diabète et le glaucome 4. Par conséquent, de nouveaux composés ciblant la signalisation avec l&#39;efficacité du traitement potentiellement plus bénéfique et la tolérabilité GC sont très recherchés à l&#39;arrièreer. Surtout, les effets observés ligand dans les cellules cultivées peuvent différer de celles observées in vivo 5. De tels effets peuvent fausser les résultats obtenus avec la culture de cellules classique à base des essais de criblage pharmaceutique. Chimique criblage in vivo comme activée par le modèle de poisson zèbre est récemment entré en discussion, car elle permet la détermination des effets non détectables en culture cellulaire 6,7. Voies de signalisation hormonales peuvent également être affectés par les polluants environnementaux. Dits perturbateurs endocriniens (PE) affectent divers processus d&#39;hormones réglementé 8. Ainsi, la reproduction et de la différenciation sexuelle d&#39;organismes aquatiques peuvent être modulées par des substances ayant des activités semblables à l&#39;œstrogène. Récemment, des inquiétudes ont été soulevées que les troubles métaboliques peuvent être liés aux perturbateurs endocriniens dans l&#39;environnement 9. Une voie visé par cette &quot;perturbation métabolique&quot; est la voie des glucocorticoïdes, qui a également été impliqué dans la xénotransplantationbiotiques effets sur le développement et la fonction immunitaire 10,11. Cependant, par rapport à la grande quantité d&#39;informations disponibles sur les composés interférant avec stéroïdes sexuels action des hormones, on sait relativement peu sur les effets de perturbation du système endocrinien médiation par le GR. Par conséquent, il faut des outils qui permettent la surveillance des effets des polluants sur la signalisation de GC in vivo. Le poisson zèbre a longtemps été un modèle populaire en biologie du développement et a plus récemment attiré des chercheurs d&#39;autres domaines, y compris l&#39;endocrinologie 12. En comparaison avec d&#39;autres poissons téléostéens, le système de signalisation de GC de poisson-zèbre est plus semblable à celle des mammifères, puisque le génome du poisson zèbre ne contient qu&#39;un seul gène GR par opposition aux récepteurs dupliqués dans de nombreuses autres espèces de poisson de 13 à 15. En outre, l&#39;axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien est déjà fonctionnel dans 5 jours vieux larves de poisson zèbre, qui augmentent la production de GC endogène en réponse à des facteurs de stress 14,16-18. Récemment, nous avons généré une lignée transgénique du poisson zèbre, GRE: Luc, ce qui permet la surveillance de l&#39;activité de signalisation de GC in vivo et en temps réel 18. La ligne porte un gène rapporteur luciférase construction sous le contrôle d&#39;une boîte TATA promoteur minimal et quatre GRE concatemerized (figure 1a). GC bioluminescence induite peut être mesurée à partir seul GRE: Luc larves dans des plaques à 96 puits de la microplaque in vivo sur des périodes de temps prolongées. Ce test de grizly (pour &quot;glucocorticoïdes sensible in vivo poisson zèbre luciférase activité&quot;) peut être utilisé dans un certain nombre de domaines de recherche différents, tels que la recherche de stress, surveillance de l&#39;environnement, et les écrans pharmacologiques 18. Nous avons pu détecter l&#39;augmentation endogène de cortisol après un stress osmotique de larves unique et pourrions suivre la maturation de la réponse au cours du développement. En outre, nous pourrions surveiller les effets sur la signalisation de GC de organostanniquess qui nécessitent métabolisation par la larve. Surtout, la ligne a été en mesure de détecter ces effets à des concentrations dans l&#39;environnement. Enfin, dans un écran de pilote du dosage sensible et spécifique détectée composés ayant une activité de GC à partir d&#39;une bibliothèque de produits chimiques, y compris un composé qui stimule la production de cortisol endogène chez les larves. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour les écrans chimiques en utilisant le test grizly.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Buffer composition + reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co KG</td>
			<td>A994.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDA approved drug library</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-2841-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiprobe II</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>8 channel, equipped with disposable tip adaptor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquidator 96</td>
			<td>Steinbrenner Laborsysteme</td>
 <td></td>
			<td>hand-operated 96-channel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision XCite Multilabel Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with stacker automation, temperature control, barcode reader and enhanced luminescence detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plasticware + consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Storage Plate</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-0765</td>
			<td>round well, 0.8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover films,</td>
			<td>ratiolab</td>
			<td>6018412</td>
			<td>self adhesive, DMSO resistent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Steinbrenner Laborsysteme</td>
			<td>LRF-200L</td>
			<td>for liquidator 96, 200 &#956;l, low retention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TopSeal-A</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPlate-96</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005299</td>
			<td>white opaque 96-well microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barcode Labels</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1608182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filtered polypropylene IsoTip pipette tips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>S058.4809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRE:Luc fish</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ZDB-TGCONSTRCT-120920-1</td>
			<td>available at the European Zebrafish Resource Centre EZRC, Karlsruhe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a chemical screening procedure for glucocorticoid signaling with a zebrafish larva luciferase reporter system

Glucocorticoïdes hormones de stress et leurs dérivés artificiels sont largement utilisés des médicaments pour traiter l&#39;inflammation, mais le traitement à long terme par des glucocorticoïdes peuvent entraîner des effets secondaires graves. Les systèmes d&#39;essai sont nécessaires à la recherche de nouveaux composés qui influencent la signalisation des glucocorticoïdes in vivo ou pour déterminer les effets indésirables des composés sur la voie de signalisation des glucocorticoïdes. Nous avons mis en place un test de poisson zèbre transgénique qui permet la mesure de l&#39;activité de signalisation des glucocorticoïdes in vivo et en temps réel, l&#39;analyse grizly (glucocorticoïdes sensible in vivo poisson zèbre luciférase activité). Le dosage à base de luciférase détecte effets sur la signalisation des glucocorticoïdes avec une grande sensibilité et spécificité, y compris les effets de composés qui nécessitent métabolisation ou affectent la production de glucocorticoïdes endogènes. Nous présentons ici un protocole détaillé pour la réalisation d&#39;écrans chimiques avec ce dosage. Nous décrivons l&#39;acquisition de données, la normalisation, etanalyse, en plaçant l&#39;accent sur le contrôle de la qualité et de visualisation de données. Le test fournit une lecture simple, résolue dans le temps, et quantitative. Il peut être utilisé comme une plate-forme autonome, mais est également facile à intégrer dans les flux de travail de criblage à haut débit. Il permet en outre de nombreuses applications au-delà de criblage chimique, telles que la surveillance de l&#39;environnement des perturbateurs endocriniens ou recherche sur le stress.

Dans une publication précédente 18, nous avons criblé une bibliothèque de 640 médicaments approuvés par la FDA dans un écran de pilote pour évaluer la performance de l&#39;essai grizly. Cette bibliothèque contient 12 bona fide GC, permettant ainsi de déterminer les mesures de qualité pour la sensibilité et la spécificité du test. La figure 2 montre des exemples typiques de l&#39;analyse des données brutes et la normalisation prise depuis cet écran. Un résultat typique à partir d&#39;un contrôle de la dexaméthasone et est représenté sur la figure 2a, illustrant les informations temporelles fournies par les données. Un pic de bioluminescence qui se produit à environ 12 heures après le traitement diminue lentement au cours de la suite de 36 h de mesure. Figure 2a &#39;met en évidence l&#39;approximation de la valeur AUC moyen de la méthode trapézoïdale. Ce calcul est effectué pour tous les puits et chaque répétition technique. Le résultat de la transformation logarithmique est représenté sur les figures 2b &lt;/ Strong&gt; et b &#39;. Voici la moyenne des contrôles positifs sont tracés dans un complot de QQ normal. Identifiant transformation conduit à un plus grand rapprochement des points de données à des valeurs théoriques normalement distribuées indiquées par les diagonales rouges. Une transformation d&#39;atteindre la normalité des données augmente la puissance statistique des analyses ultérieures. Enfin, les figures 2c et 2c &#39;montrent l&#39;effet de robuste Z-score normalisation sur la variabilité de plaque à plaque: Les différentes valeurs de référence obtenues avec différentes plaques (figure 2c) sont normalisés dans l&#39;intrigue robuste Z-score à la figure 2c. Les valeurs des Z-scores robustes peuvent être utilisés pour identifier les erreurs systématiques dans les données en visualisant la distribution des résultats à travers les plaques. Figure 3a montre un exemple d&#39;une carte thermique d&#39;une plaque bibliothèque, dans laquelle le solide Z-score values sont tracées code couleur dans les positions de puits. On identifie facilement la colonne 12 avec les contrôles positifs dans la plaque. Composés de la banque de pointage positifs sont observés dans F8 et ainsi, bien que plus faible, E2. Figure 3b montre une plaque dans laquelle une erreur systématique est présent. On observe une série de composés avec des valeurs décroissantes Z-score dans les rangées A et E sur plusieurs colonnes. Aucun des composés dans ces puits a été testé positif dans la ré-essai. Etant donné que les puits avec cette activité de test Grizly décroissante sont placés le long du trajet du robot de pipetage prend aliquotage lorsque les plaques de la bibliothèque, ce modèle est indicative d&#39;un transfert à un composé de positif pendant le processus de pipetage automatique. Le robuste Z-score normalisation ainsi que la présence de GC connus dans la bibliothèque nous a également permis de calculer un récepteur fonctionnant (ROC) courbe caractéristique pour l&#39;écran 18. Figure 3c montre un graphique de la estiaccouplés taux de vrais positifs contre le taux de faux positifs estimé pour les différents Z-scores valeurs seuil robustes. Le taux de vrais positifs estimé est défini comme le pourcentage de vrais résultats positifs (en l&#39;occurrence, les glucocorticoïdes connus présents dans la bibliothèque) qui se trouvent à un Z-score valeur de coupure robuste donnée. Le taux de faux positifs estimé correspondant indique le pourcentage de composés non-positifs frappé à cette valeur seuil. L&#39;AUC de cette courbe est de 0,95, ce qui indique une haute sensibilité et la spécificité de l&#39;écran et une excellente performance du test. La courbe AUC a également été utilisé pour estimer la valeur de seuil optimal pour l&#39;identification de toucher de calcul de l&#39;indice de Youden pour différents Z-scores solides. Nous avons identifié le robuste Z-score de 1,49 comme ayant l&#39;indice le plus élevé Youden. Cette valeur seuil est indiqué sur la figure 2c &#39;comme une ligne noire séparant les résultats de la majeure partie des composés. Dans notre écran18, nous avons été en mesure d&#39;identifier GC presque tous connus présents dans la bibliothèque. Seulement trois des 12 GC de bonne foi n&#39;ont pas été détectés. Dans le cas de l&#39;acétate de mélengestrol, il s&#39;agissait d&#39;un résultat négatif faux, car ce composé a été testé positif dans la ré-essai, à une concentration plus élevée que celle utilisée dans la bibliothèque. Les deux autres GC étaient négatifs aussi dans le re-test. Corticostérone est le principal GC chez les rongeurs, mais pas chez les poissons ou les humains 1, tandis que la prednisone promédicament pourrait pas être ainsi transformé par métabolisme par le système larvaire. Il est intéressant, également deux médicaments non annotées comme CG ont été identifiés dans l&#39;écran, dont on ne pouvait pas être confirmée dans le re-test (spironolactone, un antagoniste du récepteur minéralocorticoïde). L&#39;autre composé, la prégnénolone, est un précurseur dans la biosynthèse des stéroïdes, qui est converti en cortisol par la glande surrénale. En effet, le traitement par la prégnénolone stimule la production de cortisol chez les larves 18. Tous ces résultats confirment la grande performance de l&#39;essai: un seul faux négatif et un composé de faux positifs ont été parmi les résultats de l&#39;écran principal, et 10 des 11 composés confirmés avec signalisation de GC activité de stimulation ont été déjà identifiée dans l&#39;écran principal. <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50439/50439fig1.jpg" /> Figure 1. Principe général de l&#39;essai et le flux de travail de la procédure de dépistage. A) Schéma de l&#39;essai grizly construction de rapporteur. Luciférase (jaune) l&#39;expression est contrôlée par un promoteur minimal (P min, orange) et quatre éléments GRE concatemerized ((GRE) 4, blanc), qui sont liés par des homodimères GR activés par des ligands (GR, bleu). Les cases rouges indiquent les sites de transposase Tol2 qui facilitent l&#39;intégration de la construction dans le génome. La boîte rose représente un site de polyadénylation (pA). Larves transgénique portant ce contextestruct sont placés dans des plaques opaques à 96 puits de la microplaque pour les mesures de bioluminescence. b) Schéma de la réaction de la luciférase. La luciférase catalyse l&#39;oxydation de la luciférine à oxyluciférine, ce qui conduit à l&#39;émission de lumière (de hv). La réaction nécessite également de l&#39;ATP et de Mg 2 +, qui est fourni par la larve. PP i, pyrophosphate. C) Flux de travail de l&#39;écran. Travail d&#39;dilutions sont préparées à partir d&#39;une bibliothèque approuvé par la FDA des médicaments plaques à 96 puits, une colonne contenant un négatif dans la plaque de contrôle (DMSO seulement, vert) et une colonne contenant un contrôle positif (dexaméthasone, rouge) (conception bibliothèque). GRE: larves Luc sont répartis dans des plaques 96 puits (5-11 répétitions) et traitée avec les composés de la banque (application de la drogue). traces de bioluminescence sont enregistrés avec un lecteur de bioluminescence pour deux jours (collecte de données). traces de bioluminescence sont intégrés (calculs AUC), une transformation logarithmique et robuste Z-score normalisé (normalition). Les données normalisées sont utilisées pour déterminer des métriques de qualité et pour l&#39;identification de toucher (analyse de données). Résultats choisis sont testés de nouveau pour l&#39;activité dépendante de la dose dans l&#39;essai (retest). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50439/50439fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50439/50439fig2.jpg" /> Figure 2. L&#39;analyse des données illustré par les données d&#39;un écran d&#39;un approuvé par la FDA bibliothèque de médicaments. a) trace représentative d&#39;un contrôle positif bien. a &#39;) L&#39;aire sous la courbe (AUC) est calculée selon la règle du trapèze. Les trapèzes utilisés pour le calcul sont présentés dans différentes nuances de rouge. B) QQ plot normale des valeurs premières de l&#39;ASC de puits de contrôle positif (axe des y) vs une population axe x standard normal () avant transformation logarithmique. B &#39; )<html> QQ plot normale des valeurs de l&#39;ASC après transformation logarithmique. Une distribution normale est indiquée par la linéarité des points de données de transformation logarithmique. C) Terrain de transformation logarithmique des données brutes pour tous les composés testés dans l&#39;écran. Bleu, de bonne foi glucocorticoïdes;. Gris, tous les autres composés c &#39;) Terrain de données d&#39;écran après robuste Z-score normalisation. Les erreurs systématiques tels que les variations inter-plaques ont été retirées des données. Les lignes rouges indiquent la moyenne ± sem des contrôles positifs au sein de la plaque. La ligne noire: frapper valeur de coupure identification tel que déterminé par Youden indice optimisation (Figure 3). Reproduit avec la permission de 14, 2012 ACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50439/50439fig2large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . 0439fig3.jpg &quot;/&gt; Résultats Figure 3. D&#39;écran. a) Zone de jeu de résultats à l&#39;écran. Valeurs des Z-scores solides de composés de la banque sont tracées dans les positions respectives ainsi. Les contrôles positifs dans la colonne 12 ainsi que les deux composés de vie dans les puits positifs F8 et E2 sont visibles. B) Zone de jeu d&#39;une plaque montrant report d&#39;un composé positive au cours de la préparation de bibliothèque avec un robot de pipetage. Un gradient d&#39;activité est visible le long du trajet de pipetage pris par le robot. C) Récepteur d&#39;exploitation ROC) la courbe caractéristique (pour l&#39;écran. Les taux réels estimés positifs (axe des y gauche) et taux de faux positifs (axe des x) sont tracées pour des valeurs croissantes de coupure des Z-scores robustes (code couleur, l&#39;axe y de droite). La valeur AUC de la courbe obtenue est proche de 1, ce qui indique une bonne performance du test. Composés reproduit avec la permission de 14, 2012 ACS. D) Tableau montrant actif (Yellow) ou inactif (bleu) dans l&#39;écran principal (prim.) ou dans le retest. glucocorticoïdes de bonne foi n&#39;ont pas toujours été à nouveau testés (blanc). Redessiné avec la permission de 14, 2012 ACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50439/50439fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4"> Paramètres généraux: </td></tr><tr><td colspan="4"> Etape 1.1 </td></tr><tr><td> Procédure </td><td> Type: </td><td colspan="2"> liquide unique </td></tr><tr><td></td><td> Mode: </td><td colspan="2"> éteindre </td></tr><tr><td></td><td> dispense par aspiration: </td><td colspan="2"> 1 </td></tr><tr><td></td><td> optimiser la vitesse: </td><td colspan="2"> Oui </td></tr><tr><td></td><td> entrefers système: </td><td colspan="2"> 10 pl </td></tr><tr><td></td><td> transports: </td><td colspan="2"> 0 </td></tr><tr><td> Rincer / Wash </td><td colspan="3" width="426"> Aucun </td></tr><tr><td> Aspirer </td><td> Type d&#39;établissement </td><td> Valeur </td><td> remarques </td></tr><tr><td></td><td> Position </td><td> B7, B10, B13, B16 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Aspirer Vol. </td><td> 10 pl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Vitesse </td><td> 200 pl / s </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Suivi liquide </td><td> 60% </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Aspirer Hauteur </td><td> Labware défaut </td><td> 22.28 </td></tr><tr><td> Dispenser </td><td> Type d&#39;établissement </td><td> Valeur </td><td> remarques </td></tr><tr><td></td><td> Positions </td><td> D7, D10, D13, D16 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Distribuer Vol. </td><td> 10 pl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Vitesse </td><td> 200 pl / s </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Suivi liquide </td><td> 100 pl </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Distribuer Hauteur </td><td> Labware défaut </td><td> 17.01 </td></tr><tr><td colspan="4"> Etape 1.2 </td></tr><tr><td> Procédure </td><td> Type: </td><td colspan="2"> réactif </td></tr><tr><td></td><td> Mode: </td><td colspan="2"> déchets </td></tr><tr><td></td><td> dispense par aspiration: </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td></td><td> optimiser la vitesse: </td><td colspan="2"> Oui </td></tr><tr><td></td><td> entrefers système: </td><td colspan= &quot;2&quot;&gt; 15 pi </td></tr><tr><td></td><td> transports: </td><td colspan="2"> 0 </td></tr><tr><td colspan="2"> Rincer / Wash </td><td colspan="2"> Aucun </td></tr><tr><td> Aspirer </td><td> Type d&#39;établissement </td><td> Valeur </td><td> remarques </td></tr><tr><td></td><td> Position </td><td> A4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Aspirer Vol. </td><td> 3 x 490 pi </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Surverses </td><td> 15 et 0 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Vitesse </td><td> 200 pl / s </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Suivi liquide </td><td> 400% </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Aspirer Hauteur </td><td> Surface du liquide </td><td></td></tr><tr><td> Dispenser </td><td> Type de s<html> ise </td><td> Valeur </td><td> remarques </td></tr><tr><td></td><td> Position </td><td> D7, D10, D13, D16 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Distribuer Vol. </td><td> 490 pi </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Surverses </td><td> 15 et 0 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Vitesse </td><td> 200 pl / s </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Suivi liquide </td><td> 100% </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Distribuer Hauteur </td><td> Labware défaut </td><td> 17.01 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Réglages pour Multiprobe II. L&#39;protocole dans le tableau 1 décrit la préparation de 4 plaques (chacune 96 puits). Les plaques sont situées sur des adaptateurs de plaque dans la zone de travail à des positions spécifiées par le robot (par exemple, B7, B10, B13, B16). <html> 1 &quot;fo: keep-together.within page =&quot; always &quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="4"> Paramètres généraux: </td></tr><tr><td colspan="2"> Nombre de répétitions de l&#39;essai </td><td colspan="2"> dépend de la longueur de la course </td></tr><tr><td colspan="2"> Nombre de plaques </td><td colspan="2"> illimité </td></tr><tr><td colspan="2"> Contrôle de la température </td><td colspan="2"> 28 ° C </td></tr><tr><td colspan="2"> Protocole </td><td colspan="2"> Calculs </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> US Lum 96 (cps) lire </td></tr><tr><td></td><td> Mesure du temps </td><td> 2,5 sec </td><td rowspan="3"> correction de diaphonie </td></tr><tr><td></td><td> Distance entre la plaque et le détecteur </td><td> 0 mm </td></tr><tr><td></td><td> Glow (CT2) facteur de correction </td><td> 0% </td></tr></tbody></table>contenu »&gt; Tableau 2. paramètres de Envision utilisés pour l&#39;écran.

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A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System | Biology  | Video

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Nous décrivons la procédure et l&#39;analyse des données d&#39;un système de criblage chimique pour glucocorticoïdes signalisation de l&#39;hormone du stress en utilisant des larves de poisson zèbre: le Responsive essai glucocorticoïdes in vivo poisson zèbre luciférase activité (grizly). Le test sensible et spécifique détecte effets sur la signalisation des glucocorticoïdes par des composés qui nécessitent métabolisation ou affectent la production de glucocorticoïdes endogènes.

Une procédure de dépistage chimique pour les glucocorticoïdes de signalisation avec un système de Reporter poisson zèbre Larve luciférase

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

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11.8K vues.  Karlsruhe Institute of Technology - Campus North.  Nous décrivons la procédure et l'analyse des données d'un système de criblage chimique pour glucocorticoïdes signalisation de l'hormone du stress en utilisant des larves de poisson zèbre: le Responsive essai glucocorticoïdes in vivo poisson zèbre luciférase activité (grizly). Le test sensible et spécifique détecte effets sur la signalisation des glucocorticoïdes par des composés qui nécessitent métabolisation ou affectent la productio...

Vidéo: A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Etudier biogenèse des membranes avec un Luciferase Assay-Based gène rapporteur

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Recherche

Biologie

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

Développement de l&#39;imagerie automatisée et d&#39;analyse pour les écrans chimiques du poisson zèbre.

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Étiquetage des cellules Lineage Zebrafish avec laser Uncagable dextran fluorescéine

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes. More than 700 human miRNAs have been identified so far with each having up to hundreds of unique target mRNAs. Computational tools, expression and proteomics assays, and chromatin-immunoprecipitation-based techniques provide important clues for identifying mRNAs that are direct targets of a particular miRNA. In addition, 3'UTR-reporter assays have become an important component of thorough miRNA target studies because they provide functional evidence for and quantitate the effects of specific miRNA-3'UTR interactions in a cell-based system. To enable more researchers to leverage 3'UTR-reporter assays and to support the scale-up of such assays to high-throughput levels, we have created a genome-wide collection of human 3'UTR luciferase reporters in the highly-optimized LightSwitch Luciferase Assay System. The system also includes synthetic miRNA target reporter constructs for use as positive controls, various endogenous 3'UTR reporter constructs, and a series of standardized experimental protocols.
Here we describe a method for co-transfection of individual 3'UTR-reporter constructs along with a miRNA mimic that is efficient, reproducible, and amenable to high-throughput analysis.

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3&#039;UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and have been shown to play a role in numerous biological processes. To better understand miRNA-UTR interactions, we have created a genome-wide collection of 3 UTR luciferase reporters paired with a novel luciferase gene and assay reagent, the LightSwitch system.

L&#39;identification des cibles de microARN humaine avec le système LightSwitch Luciferase Assay utilisant 3&#39;UTR-reporter Construit et un microARN dans les cellules adhérentes Mimic

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Dépistage ARNi pour identifier les phénotypes postembryonnaires dans C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Criblage à haut débit fonctionnelle utilisant une maison double lueur de dosage de luciférase

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been made in identifying the components of the editosome complex that catalyze RNA editing. However, it is still not clear how those proteins work together. Chemical compounds obtained from a high-throughput screen against the editosome may block or affect one or more steps in the editing cycle. Therefore, the identification of new chemical compounds will generate valuable molecular probes for dissecting the editosome function and assembly. In previous studies, in vitro editing assays were carried out using radio-labeled RNA. These assays are time consuming, inefficient and unsuitable for high-throughput purposes. Here, a homogenous fluorescence-based &#8220;mix and measure&#8221; hammerhead ribozyme in vitro reporter assay to monitor RNA editing, is presented. Only as a consequence of RNA editing of the hammerhead ribozyme a fluorescence resonance energy transfer (FRET) oligoribonucleotide substrate undergoes cleavage. This in turn results in separation of the fluorophore from the quencher thereby producing a signal. In contrast, when the editosome function is inhibited, the fluorescence signal will be quenched. This is a highly sensitive and simple assay that should be generally applicable to monitor in vitro RNA editing or high throughput screening of chemicals that can inhibit the editosome function.

A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.

ARN catalyseur en tant que reporter pour le criblage de médicaments contre l&#39;ARN Édition dans trypanosomes

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell&#8217;s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Transfecter des cellules RAW264.7 avec un gène rapporteur de la luciférase

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Multi-enzyme préalable au moyen d&#39;un système de criblage enzymatique génétique à haut débit

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...