This work was funded by a Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellowship to Y. F. 100104/Z/12/Z.
We would like to thank Dr. Carl Tucker and the team of the fish facility at the Queen&#8217;s Medical Research Institute, University of Edinburgh. We like to thank Michael Millar of the immunohistology and imaging facility of the MRC Centre for Reproductive Medicine, University of Edinburgh for support.
We thank Prof. Dr. Matthias Hammerschmidt and Dr. Heiko Loehr of the Institute of Developmental Biology, University of Cologne for providing the p5E-krt4 entry vector. We also would like to thank Dr. Dirk Sieger of the Centre of Neuroregeneration, Univerity of Edinburgh for providing the pDestTol2CG destination vector.

Les procédures expérimentales suivantes ont été effectuées en stricte conformité avec la loi de 1986 animaux (Scientific Procedures). 1. Préparation d&#39;ADN plasmidique pour la microinjection <ol><li> Purifier le plasmide pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP avec un kit de purification d&#39;ADN plasmidique commerciale selon les instructions du fabricant et diluer l&#39;ADN plasmidique à une concentration finale de solution stock de 100 ng / ul. </li><li> Linéariser la transposase contenant pT3TS plasmidiques / Tol2 14 par digestion de restriction BamHI, en suivant le protocole du fabricant. Cette étape peut être prolongé pendant une nuit. Précipiter l&#39;ADN linéarisé par une extraction au phénol / chloroforme, selon le protocole standard. </li><li> Transcrire in vitro l&#39;ARNm de transposase à partir du plasmide linéarisé avec un kit de transcription commercial pour de grandes quantités d&#39;ARN coiffée selon les instructions du fabricant, et diluer à aliquoteune concentration finale de solution stock de 100 ng / ul dans l&#39;eau sans nucléase. Assurer la qualité de l&#39;ARN purifié avec un natif 2.1% TAE (Tris 40 mM, acide acétique 20 mM, EDTA 1 mM) électrophorèse sur gel d&#39;agarose (80 à 120 V). Stocker l&#39;ARN à -80 ° C. </li></ol> 2. microinjection d&#39;ADN plasmidique pour Transient expression génique <ol><li> Préparer une plaque d&#39;injection agarose pour maintenir les œufs fécondés pendant l&#39;injection. Verser le liquide 3% d&#39;agarose dans un plat de 90 mm de Pétri. Laissez refroidir agarose à 40-50 ° C et ajouter la micro-injection moule en forme coincée TU-1 au-dessus de l&#39;agarose liquide. Après durcissement à température ambiante, laisser le reste agarose à 4 ° C pendant 30 minutes avant de retirer le moule. moules de micro-injection de magasin à 4 ° C et la réutilisation. </li><li> Préparer une aliquote de la solution d&#39;injection. Effectuez les étapes suivantes sur la glace. Introduire à la pipette 1 pi d&#39;ADN de plasmide (concentration finale de 10 ng / ul), 2 ul d&#39;ARNm transposase (concentration finale de 20 ng / ul), 2pi de 10 mg / ul isothiocyanate de rhodamine B-Dextran, 2 pl de solution Danieau 5x (290 mM de NaCl, 3,5 mM de KCl, 2 mM de MgSO 4, 3 mM de Ca (NO 3) 2, 25 mM de HEPES, pH 7,6) à une volume final de 10 ul dans l&#39;eau sans nucléase. </li><li> Préparer aiguilles des capillaires de verre borosilicate de 1 mm de diamètre contenant un filament intérieur en tirant le capillaire dans des directions opposées avec une micropipette extracteur. Utilisez le programme suivant: chauffer 530, tirer 200, la vitesse et l&#39;heure 80 150. </li><li> Remplir une aiguille avec 2 pi de la solution d&#39;injection (conservé sur de la glace). Éviter les bulles en retirant soigneusement la pointe de microloader tout en libérant la solution dans le capillaire. Cassez délicatement la pointe de l&#39;aiguille avec une pince. </li><li> Réguler la taille de la goutte avec une pompe pneumatique pico. Mesurer le diamètre de goutte / volume (V = 4/3 πr 3) et ajuster la taille de goutte avec un micromètre oculaire sous un stéréoscope diméthylpolysiloxane. Nous vous recommandons100 um, ce qui correspond à 0,5 nl. Ceci assure concentrations uniformes et reproductibles par chaque embryon injecté. Titrer la concentration injectée et ajuster pour chaque préparation de construction et le plasmide. </li><li> Placez les zygotes (figure 1A) obtenus d&#39;un croisement de Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) 15 avec io006 Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg 16 dans les moules de la plaque d&#39;injection par utilisation d&#39;un pastette 3 ml. En attendant, continuez la pointe de l&#39;aiguille d&#39;injection pré préparé en diméthylpolysiloxane pour éviter la solution de sécher et la coagulation. </li><li> Injecter la chute mesuré au préalable (100 um correspondant à 0,5 nl) sous un stéréoscope à travers le chorion dans le blastodisque 17, avant le premier clivage (figure 1A). L&#39;injection dans le stade d&#39;une cellule augmente le risque d&#39;une distribution uniforme de l&#39;ADN plasmidique et de l&#39;ARN dans la masse des cellules en développement et la possibilité de transmission de lignée germinale. Il estnotable que l&#39;expression de constructions tend à être plus souvent mosaïque. </li></ol> 3. conditionnelle cellules de la peau Transformation de 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) <ol><li> Transférer les embryons injectés dans la solution 0.3x Danieau et les garder à 28,5 ° C dans un incubateur. Retirer les oeufs non fécondés de l&#39;antenne à l&#39;étape de la sphère 17. La co-injecté isothiocyanate de rhodamine B-dextrane peut être utilisé comme une injection sous-contrôle d&#39;un stéréoscope fluorescent. </li><li> embryons de l&#39;écran à 24 HPF (h après la fécondation) pour l&#39;expression de eGFP cardiaque. Continuer d&#39;élever CMLC: eGFP embryons de poisson zèbre positifs jusqu&#39;à 72 HPF. Surveiller attentivement la qualité de l&#39;eau (0.3x Danieau). </li><li> Retirez le chorion de ces embryons qui ne ont pas éclos avec une pince à 72 HPF. Piquez délicatement le chorion avec une pince et le séparer en utilisant l&#39;autre. Sélectionner des embryons pour lysC: expression DsRed2 utilisant un stéréoscope fluorescente. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;une 10 mMle bilan des (Z) -4-hydroxytamoxifène à 20 ml de solution 0.3x Danieau (concentration finale de 5 uM). Utiliser la solution induction 4-OHT pour une boîte de Pétri standard (90 mm) sur un lot de 40 à 60 embryons. </li><li> Transférer les embryons dans une nouvelle boîte de Petri contenant 20 ml de fraîchement préparé induction solution. 4-OHT doit être stocké et manipulé dans l&#39;obscurité. Les premiers signes d&#39;expression peut être détectée deux heures après l&#39;induction départ. L&#39;induction-étape peut être prolongé la nuit, en gardant à l&#39;esprit que cellule initiale d&#39;accueil: interactions cellulaires prénéoplasiques peut déjà se produire quelques heures après le traitement. </li></ol> 4. Montage et l&#39;imagerie en direct de poisson zèbre larves <ol><li> Préparer une boîte de Pétri de 60 mm en introduisant un trou d&#39;un diamètre de 18-20 mm. Utiliser de la graisse silicone de haute vide pour couvrir et sceller le trou sur le fond extérieur de la boîte de Pétri avec un verre de 25 mm de couverture (figure 1B). </li><li> Préparez 1% à bas point de fusion (LMP) agarose. Gardez-en un tube de 1,5 mld&#39;agarose LMP à 37 ° C dans un bloc chauffant. </li><li> Présélection Tg (krt4: KalTA4-ER T2; SAMU: eGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) larves pour la cellule de la peau verte fluorescente et d&#39;expression DsRed2 positif innée des cellules immunitaires, sous un stéréoscope fluorescent. Anesthetize larves par addition de 1 ml de 0,4% tricaïne 18 à la solution 20 ml d&#39;induction. </li><li> Transférer les larves présélectionnée avec une pastette dans l&#39;agarose LMP liquide. Que les larves se enfoncer dans l&#39;agarose LMP et de les transférer sur le verre de couverture (figure 1B). Orienter les embryons sous un stéréoscope. Les larves doivent être placés directement sur le verre pour réduire la distance de travail (jusqu&#39;à 6 larves). </li><li> Couvrir l&#39;agarose LMP avec le tricaïne contenant une solution d&#39;induction après qu&#39;il a durci (figure 1B flèche). </li><li> L&#39;image de larves embarqué utilisant un fluorescent inversé, à balayage laser ou un disque de filature microscope confocal. Utilisez un 40X ou 63Xobjectif que les objectifs avec des distances de travail long permettent de se concentrer à travers l&#39;ensemble de la larves. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Au cours de l&#39;embryogenèse et le développement des larves, la peau du poisson zèbre embryonnaire est composé de deux couches épithéliales, la couche superficielle appelé périderme et une couche de kératinocytes basaux qui sont attachés à la membrane basale sous-jacente 19 (Figure 1C, a). Le protocole présenté ici décrit une méthode simple pour induire conditionnellement transformation de cellules prénéoplasiques dans la couche de peau superficielle de larves de poisson zèbre, et permet d&#39;analyser l&#39;interaction subséquente avec des cellules immunitaires innées par imagerie en temps réel. Les méthodes de base de notre protocole suivent techniques de poisson zèbre bien établies 9-13, et notre protocole peuvent être facilement adaptés et modifiés. Le promoteur de krt4 5 utilisée ici entraîne KalTA4-ER T2 expression spécifiquement dans la couche la plus externe de la peau (figure 1C, b). Cependant, la porte d&#39;entrée MultiSite modulairestratégie de clonage utilisée pour générer le krt4: KalTA4-ER T2 construction (figure 1D, a), offre la possibilité de cloner ne importe quel promoteur d&#39;intérêt devant KalTA4-ER T2 dans une étape de clonage unique. Une adaptation de la méthode présentée dans ce document est donc possible pour la plupart des tissus et au cours de l&#39;embryogenèse stades larvaires. La disponibilité des séquences de promoteur est par les présentes le facteur limitant. En outre, presque ne importe quel gène d&#39;intérêt cloné derrière un UAS peut être surexprimé conditionnellement à différents stades de développement par l&#39;utilisation de l&#39;expression spatiale et temporelle contrôlée KalTA4-ER T2. Par conséquent, notre protocole peut être adapté pour effectuer l&#39;expression du gène conditionnel dans un tissu d&#39;intérêt pour larves de poisson zèbre, de manière mosaïque. On peut également optimiser le réglage afin de vivre l&#39;image des tissus plus profonds tels que le foie ou le pancréas microscope. Nous avons décrit une application utilisant le protocole qu&#39;ilRe, de même, on peut surexprimer d&#39;autres modulateurs de l&#39;inflammation en utilisant ce protocole pour étudier la régulation des réponses inflammatoires, comme on peut facilement l&#39;image neutrophiles en direct et les changements de comportement suivants macrophages l&#39;induction et l&#39;arrestation dans l&#39;expression d&#39;un modulateur inflammatoire candidat. En outre, le protocole adapté serait également bénéfique pour ceux qui veulent retracer le mouvement des cellules et le changement de comportement au cours des différentes étapes de la morphogenèse des tissus et la formation d&#39;organes et, l&#39;image enfin vivre l&#39;interaction des interactions de cellules immunitaires innées avec d&#39;autres lignées cellulaires spécifiques qui peuvent être ciblées par le système d&#39;expression T2 / SAMU KalTA4-ER inductible. Nous avons utilisé le vecteur de la pDestTol2CG Tol2kit de poisson zèbre 20-23 qui contient une cmlc2: eGFP-pA cassette (figure 1D, a) qui permet la sélection ultérieure des embryons par fluorescentes vertes coeurs positifs comme un soilection marqueur 20 qui simplifie le processus de dépistage de F0. Une insertion stable du gène flanqué de transposon dans le génome d&#39;intérêt est facilitée par co-injection de l&#39;ADN plasmidique avec l&#39;ARNm transposase. La préparation d&#39;ADN plasmidique et l&#39;ARNm de transposase pour microinjection suit des protocoles standard. Cependant, une bonne intégration de la construction dans le génome dépend de la transposition à base de Tol2 14. Cela souligne l&#39;attention particulière soit accordée à travailler sur de la glace dans des conditions stériles pour éviter les contaminations et les dégradations par RNases et DNases. Microinjection dans des embryons de stade unicellulaire est une technique robuste et bien établie pour le gain et la perte de fonction dans les études de 9,10 poisson zèbre. Bien que une personne bien entraînée peut facilement injecter dans le jaune de plus de 1000 embryons dans une heure, l&#39;injection dans le blastodisque (figure 1A, astérisque) nécessite plus d&#39;expérience et de formation. Critique au cours de cette procédure is la manipulation de l&#39;aiguille. L&#39;aiguille doit être très mince pour pénétrer dans la cellule sans dommage et doit être rompu seulement sur sa pointe très conséquent. Il est important de contrôler régulièrement et mesurer la taille des gouttes au cours de l&#39;injection pour assurer une injection uniforme dans chaque embryon. Manipulé avec soin, l&#39;aiguille peut être utilisé pour faire tourner l&#39;embryon. Ce est souvent nécessaire pour trouver le blastodisque et l&#39;angle de pénétration optimal. La concentration de l&#39;ADN et l&#39;ARNm transposase utilisée pour l&#39;injection presque certainement une influence sur l&#39;efficacité d&#39;expression. Des doses plus élevées peuvent conduire à une plus grande proportion de cellules exprimant le transgène, mais avec des concentrations plus élevées d&#39;ADN (&gt; 50 ng / ul) et transposase ARNm (&gt; 100 ng / ul) a également le potentiel d&#39;effets toxiques parmi les embryons injectés ne se pose. Nous préférons l&#39;utilisation de 10 ng / pl d&#39;ADN et 20 ng / pl d&#39;ARNm transposase pour l&#39;injection, ce qui correspond à 50 pg d&#39;ADN de plasmide et 100 pg d&#39;ARN injecté par embryo. 100% des embryons injectés avec ces concentrations ne se développent normalement, et entre 40 à 70% montrent eGFP-HRAS G12V expression, après 4-OHT induction, en fonction de l&#39;efficacité de l&#39;injection dans la cellule unique. Parmi les embryons positifs nous trouvons normalement environ 30% qui ont de 1 à 10 clones, 40% qui ont de 10 à 50 clones et 30% ayant plus de 50 clones. Grâce à nos objectifs de recherche, nous privilégions l&#39;utilisation d&#39;embryons ayant moins de clones exprimant eGFP-HRAS G12V. Nous sélectionnons avec 10-50 embryons clones de nos expériences transitoires. Pour la génération de poissons fondateur transgénique, nous recommandons de ne sélectionner que les embryons à la fois avec le marqueur cardiaque positif eGFP et un grand nombre de clones positifs eGFP-HRAS G12V dans leur épiderme. (Z) -4-hydroxytamoxifène subit une cis-trans (EZ) interconversion lorsqu&#39;il est exposé à la lumière 24. On a constaté que l&#39;isomère cis (E) est inférieure 100x anti-oestrogénique que son homologue trans 25,26. Exposure à la lumière doit donc être évité. La solution mère de 4-OHT dissous dans de l&#39;éthanol peut être conservé à -20 ° C dans l&#39;obscurité pendant une longue période de temps. Nous recommandons l&#39;utilisation d&#39;une boîte pour protéger les boîtes de Pétri de la lumière lors de l&#39;induction du gène cible dans l&#39;incubateur et le transport. Bien que le domaine de l&#39;imagerie est très faible et l&#39;exposition du 4-OHT à la lumière UV est réduite à un minimum, un échange constant de la solution d&#39;induction toutes les 2 heures tout en imagerie sur des périodes de temps plus longues est recommandé de maintenir les niveaux d&#39;expression maximales. 4-OHT perméabilise efficacement à travers le chorion et les couches les plus externes de la peau au cours de l&#39;embryogenèse le poisson zèbre, donc elle peut induire l&#39;expression de gène très rapidement. Nous pouvons facilement observer eGFP émissions après 2 h d&#39;induction et il a été rapporté que les premiers signes d&#39;expression du gène cible peuvent être observés après 1 heure et 3 heures plateau après traitement 8. Les différences peuvent être dues à la différence de promoteur utilisé dans notre étude. Comme il a été previously rapporté que 4-OHT traitement dépend de la dose de 8,27, nous avons choisi d&#39;utiliser la plus forte concentration de 5 uM d&#39;atteindre des niveaux d&#39;expression robustes et reproductibles dans notre approche transitoire. Cela devrait garantir que toutes les cellules portant le transgène vont induire l&#39;expression du gène cible. Il doit être pris en compte que le transitoire approche présentée ici pourrait conduire à des niveaux d&#39;expression différents en raison de la possibilité de multiples événements aléatoires et d&#39;insertion du génome. En outre, l&#39;utilisation de l&#39;ARNm de transposase dans le Tol2 fond transgénique de Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 peut conduire à des transpositions potentiels du transgène UAS pouvant entraîner l&#39;inactivation de gène ou d&#39;interruption. Cependant, comme la méthode présentée ici représente une approche transitoire, la pré-sélection des embryons ultérieures de l&#39;injection est obligatoire. De nombreux laboratoires ont trouvé que les séquences UAS ont tendance à être réduit au silence dans la descendance transgénique, donc dansjecting l&#39;pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP construction dans Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 embryons pourrait ne pas être aussi efficace que l&#39;injection d&#39;un SAMU construction dans Tg (krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: GFP embryons). L&#39;utilisation de la lignée transgénique stable Tg (krt4: KalTA4-ER T2) croisé avec Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 permettra un suivi précis de ON / OFF cinétique de l&#39;époque-dosage d&#39;activation dépend du gène 4-OHT . Une étape critique lors du montage de larves est le transfert dans l&#39;agarose LMP et sur ​​la vitre de recouvrement (figure 1B). Il ya seulement un court laps de temps pour le liquide température agarose LMP qui permet un transfert sûr et l&#39;orientation des larves présélectionné sans nuire le poisson soit par choc thermique ou de durcissement du gel. Les larves doit être orienté directement sur le verre de couverture afin de réduire la distance de travail pour l&#39;analy microscopique ultérieureSIS. Comme cela peut être un facteur limitant lors de la microscopie le choix des objectifs appropriés est obligatoire. Une fois montée, la larve peut être maintenue en jours. La conditionnalité du système de modèle présenté ici permet la transformation répétée par l&#39;activation du 4-OHT du transgène. Le système d&#39;expression dépend de la présence de 4-OHT et donc l&#39;expression de KalTA4 contrôlée d&#39;un gène d&#39;intérêt est réversible (figure 1D, b). Contrairement au système Cre-ER T2 / Lox, ce qui facilite un génomique événement de recombinaison irréversible 28, KalTA4-ER T2 / UAS peut être activé et désactivé lors de l&#39;addition ou l&#39;enlèvement de 4-OHT et ce potentiel d&#39;induction répétée est un avantage de la technique sur le système T2 / Lox Cre-ER. Cependant, l&#39;exigence d&#39;un niveau constant de 4-OHT est une limitation si l&#39;expérience doit être prolongée de quelques jours à quelques semaines.

La prolifération d&#39;une descendance des cellules prénéoplasiques au sein d&#39;une feuille épithéliale ailleurs normal dépend fortement une interaction avec son micro. L&#39;interaction avec son tissu hôte est susceptible d&#39;être le principal facteur déterminant de savoir si une cellule prénéoplasique est en mesure d&#39;établir un créneau clonale à développer en cancer complet soufflé. Malgré son importance dans le développement, cette phase initiale de la progression du cancer est inaccessible dans des systèmes modèles les plus couramment utilisés, in vivo. Le poisson zèbre, Danio rerio, est un organisme modèle bien établi pour les études d&#39;imagerie en direct en raison de sa transparence au cours du développement, la possibilité pour la manipulation génétique, et l&#39;accessibilité des médicaments solubles dans l&#39;eau. Des études récentes utilisant des larves de poisson zèbre d&#39;un modèle, la surexpression de l&#39;oncogène humain HRAS G12V pour transformer des cellules épithéliales, ont montré que la cellule hôte des signaux dérivés, en particulier H 2 O 2 à plomble recrutement de cellules immunitaires innées. Fait intéressant, les cellules immunitaires, les neutrophiles et les macrophages recrutés, se sont avérés avoir un rôle trophique pour soutenir la prolifération de cellules prénéoplasiques 2,3. Afin de comprendre les événements précoces de l&#39;initiation et la progression tumorale ainsi que la contribution d&#39;une réponse inflammatoire, il faut être en mesure à l&#39;image de ces événements du point de temps le plus précoce,. Par conséquent, il est nécessaire de contrôler les transformations cellulaires d&#39;une manière spécifique dans le temps et les tissus. Nous utilisons le système / UAS Gal4 qui a été adapté avec succès à partir de Drosophila 4 à exprimer conditionnellement l&#39;oncogène humain HRAS G12V sous le contrôle du promoteur spécifique de la peau kératine 4 (krt4) 5. La version modifiée de l&#39;activateur transcriptionnel Gal4, à savoir KalTA4 6, permet l&#39;expression de HRAS G12V sous le contrôle de la séquence d&#39;activation en amont (UAS). Pour induire l&#39;expression conditionnelle de l&#39;activateur de transcription, KalTA4 a été fusionné au domaine mutant de liaison au ligand des récepteurs α d&#39;oestrogène humain (ER T2) 7 qui se lie spécifiquement le 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) 1. En l&#39;absence de 4-OHT l&#39;ER T2 est lié dans le cytoplasme par des protéines de choc thermique. Sur 4-OHT liant le choc thermique protéines dissocient, permettant une translocation nucléaire de KalTA4-ER T2 et l&#39;activation subséquente de la SAMU gène d&#39;intérêt 8 contrôlées (figure 1C, b). Comme ce système d&#39;expression dépend de la présence de 4-OHT, l&#39;expression de KalTA4 contrôlée d&#39;un gène d&#39;intérêt est réversible. Contrairement au système Cre-ER T2 / Lox, ce qui conduit à un événement de recombinaison irréversible, l&#39;induction de l&#39;activation de la transcription par KalTA4-ER T2 est réversible par addition ou enlèvement de 4-OHT. Le protocole suivant allo<html> ws une transformation conditionnelle des cellules de la peau chez les larves de poisson zèbre et un contrôle ultérieur de l&#39;interaction avec les cellules immunitaires innées par expression de la protéine fluorescente. Les méthodes de base employées dans ce protocole sont similaires à certaines techniques couramment utilisées au sein de la communauté de poisson zèbre 9-13. La production et l&#39;utilisation combinatoire des lignées transgéniques avec la micro-injection de constructions transgéniques permet une approche transitoire seulement transformer des cellules individuelles d&#39;une manière mosaïque. La perméabilité à l&#39;oxygène de la peau embryonnaire et larvaire poisson zèbre soulève la possibilité pour time-lapse études d&#39;imagerie en direct par microscopie à haute résolution de quelques heures à quelques jours. En outre, son accessibilité aux médicaments solubles dans l&#39;eau permettra de futures études mécanistes et le suivi des événements biologiques cellulaires in vivo qui pourraient mener à une meilleure compréhension des premiers stades de développement du cancer. _content &quot;&gt; Ce protocole peut être adapté pour effectuer l&#39;expression du gène conditionnel dans ne importe quel tissu de l&#39;intérêt chez les larves de poisson zèbre, d&#39;une manière mosaïque. On peut également optimiser le réglage afin de vivre l&#39;image des tissus plus profonds autres que la peau microscope.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1104">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:197px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:467px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(Z)-4-Hydroxytamoxifen&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H7904</td>
			<td>dilute in ethanol and store in the dark at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>20x/0,5 Ph2 &#8734;/0,17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>40x/1,2W Korr &#8734;/0,14-0,18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">63x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>63x/1.4 Oil Ph3 &#8734;/0,17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 510 META</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0171</td>
			<td>Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DMPSV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dow Corning high-vacuum silicone grease&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MKBL4135V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Program: heat 530, pull 200, velocity 80 and time 150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent stereoscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>M205 FA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjection mold TU-1</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microloader tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axiovert 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE mMACHINE Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic pico pump</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>PV820&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic pico pump</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-90A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B isothiocyanate-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8881</td>
			<td>10mg/&#956;l in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>M80</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BMC developmental biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PloS one 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine/MS-222</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Low Melting Point Agarose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td>25:24:1, v/v</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of innate immune and preneoplastic cell interactions using an inducible gal4/uas expression system in larval zebrafish skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Zygotes d&#39;un croisement entre Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V) io006 et Tg (lysC: DsRed2) nz50Tg ont été recueillies 10-15 minutes après la fécondation (figure 1A) pour obtenir une cellule embryons au stade. Après injection, les embryons ont été soulevées jusqu&#39;à 3 dpf, avant l&#39;induction avec 4-OHT et le montage pour l&#39;imagerie en direct (figure 1B). 2-6 heures après l&#39;induction des embryons ont été placés soit montés sous un microscope à fluorescence inversé (figure 2A) ou d&#39;un microscope inversé confocal (Figure 2B-C) et pour imager 2-3 h avec des intervalles de 1,5 min. Des cellules cutanées superficielles prénéoplasiques peuvent être identifiés par leur morphologie plus arrondie par rapport aux kératinocytes normaux, ainsi que l&#39;émission de fluorescence verte de la membrane localisée eGFP-HRAS G12V. Domaines de l&#39;imagerie ont été sélectionnés pour la co-localisation des cellules de la peau pré-néoplasiques et des cellules immunitaires innées (figure 2A tête de flèche). En raison de la rapide migprocessus de rationnement des neutrophiles les intervalles time-lapse ont été choisis pour être comprise entre 1 à 1,5 min avec Z pile tailles de pas de 0,7 à 1,7 um pour obtenir projections d&#39;intensité maximale (figure 2, Vidéo 1). Il ya un large éventail de comportements qui peuvent être observés tout imagerie en temps réel: les neutrophiles migrent côté et sous les cellules pré-néoplasiques (figure 2C, vidéo 1), forment des contacts directs aux cellules (Figure 2B et C), enlever les restes de cellules pré-néoplasiques qui subissent apoptose (Vidéo 1), ou activement engloutir des parties de cellules prénéoplasiques (non représentées). Pour saisir le spectre entier des interactions, il est conseillé de suivre leurs comportements par imagerie time-lapse en direct. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" width="700px" /> Figure 1: Schéma de conditionnelle transformation des cellules de la peau chez les larves de poisson zèbre. (A) Une image d&#39;un zygote de Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; LysC: DsRed2) poisson zèbre à 10 min après la fécondation (MPF). L&#39;ovule fécondé est entouré par le chorion (tête de flèche). Le site d&#39;injection est la blastodisque (astérisque), formé par des ruisseaux cytoplasmiques du jaune (flèche) qui définit le pôle animal de l&#39;embryon. (B) Montage de larves de poisson zèbre. 60 mm boîte de Petri avec un trou de 18 à 20 mm (tête de flèche) qui est fermé hermétiquement par un couvercle en verre de 25 mm. Les larves de poisson zèbre sont immobilisés et monté sur le couvercle en verre de 1% agarose LMP. Solution 0.3x Danieau (flèche) contenant 5 uM 4-OHT est utilisé pour couvrir l&#39;agarose LMP. (C) 4-OHT transformations de cellules superficielles de la peau. (A) de profil en coupe transversale schématique de la peau larvaire induite. La peau embryonnaire et larvaire est composé de deux couches de cellules épithéliales, des cellules d&#39;une couche superficielle et une couche cellulaire basale de kératinocytes qui sont connectés à la membrane basale sous-jacente (BM). (B) L&#39;expression transitoire système to induire un clone de cellules prénéoplasiques chez les cellules superficielles de la peau. KalTA4-ER T2 est exclusivement exprimée dans la couche la plus externe de la peau entraîné par le promoteur de krt4 (jaune). Expression mosaïque de KalTA4-ER T2 active UAS contrôlée (bleu) eGFP-HRAS G12V expression dans les cellules superficielles, conduisant à un clone de cellules pré-néoplasiques (vert). (D) Schéma du système d&#39;expression transitoire. (A) la cassette Tol2 de la pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: vecteur d&#39;expression utilisé eGFP transitoire (b) l&#39;induction de l&#39;expression conditionnelle activateur transcriptionnel.. KalTA4 est fusionnée au domaine de liaison au ligand mutant du récepteur oestrogène humain α (ER T2) qui se lie spécifiquement le 4-hydroxytamoxifène (4-OHT). En l&#39;absence de 4-OHT l&#39;ER T2 est lié dans le cytoplasme par des protéines de choc thermique Hsp90 (). Lors de la liaison 4-OHT Hsp90 dissocie, permettant une translocation nucléaire de KalTA4-ERT2 et l&#39;activation subséquente de la SAMU contrôlées expression eGFP-HRAS G12V. Barre d&#39;échelle A = 500 um. <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" width="700px" /> Figure 2: imagerie en direct de l&#39;interaction des cellules immunitaires prénéoplasique et innée. (AC) Images d&#39;un 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) embryon, qui a été injecté avec pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP et transposase ARNm à une étape de la cellule. Les images ont été prises après six heures de 4-OHT induction (A) Vue latérale de la région de la nageoire caudale à 6 heures après le traitement, montrant des taches de eGFP-HRAS G12V exprimant cellules de la peau (flèche), et lysC:. DsRed2 + neutrophiles (flèche). (BC) des images représentatives taken d&#39;un film confocale time-lapse, montrant neutrophiles (rouge) interactions avec eGFP-HRAS G12V exprimant cellules de la peau (en vert). (B) Une cellule prénéoplasique forme une extension filopodial court avec le neutrophile contact (flèche). (C) Les neutrophiles (rouge) est en contact étroit avec un clone de cellules de la peau prénéoplasiques (vert). La barre d&#39;échelle dans A = 100 um; B / C = 50 um. <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52107/Video_1.mov" target="_blank">Vidéo 1</a> : Time-lapse imagerie en temps réel de l&#39;interaction des cellules immunitaires prénéoplasique et innée. Time-lapse d&#39;un 4 dpf Tg (UAS: eGFP-HRAS G12V; lysC: DsRed2) embryon, injecté avec pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: eGFP et transposase ARNm à une étape de la cellule. Confocale film accéléré 6-9 hours après 4-OHT induction montrant lysC: DsRed2 + neutrophiles (rouge) interactions avec eGFP-HRAS G12V exprimant cellules de la peau (en vert). Neutrophiles migrent côté et sous les cellules pré-néoplasiques et enlever les restes d&#39;une cellule prénéoplasique qui subit l&#39;apoptose. Intervalles time-lapse de 1,5 min pendant 3 heures avec la pile Z tailles de pas de 1,3 um.

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Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin | Developmental Biology | Video

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Etudier les premiers événements de la progression de cellules prénéoplasiques et l&#39;interaction immunitaire innée des cellules est essentiel pour comprendre et traiter le cancer. Ici, nous décrivons une méthode pour induire une condition transformations de cellules epitheliales et de la formation d&#39;image en temps réel de l&#39;interaction subséquente immunitaire inné avec des cellules exprimant HRAS G12V cellules de la peau chez les larves de poisson zèbre.

Imagerie en direct d&#39;Innate immunitaire et prénéoplasiques Interactions cellulaires L&#39;utilisation d&#39;un système d&#39;expression / UAS inductible Gal4 dans des larves de poisson zèbre peau

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

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Vidéo: Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D organotypiques Co-culture Modèle Soutenir médullaire thymique des cellules épithéliales prolifération, la différenciation et Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Recherche

Biologie du développement

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Suivi des cellules dans le poisson zèbre transgénique de la GFP-Utilisation du système photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

en cours d&#39;analyse<em&gt; In Vivo</em&gt; Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Biosensing Potentiel de membrane de neurones moteurs dans les embryons vivants de zébrés

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Culture de l’ovule pour vivre-cellule d’imagerie du Zygote polarisation et structuration d’embryon chez Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagerie en direct de la souris Fusion de palais secondaire

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Mise en place du poisson-zèbre larvaire comme modèle Animal pour enquêter sur Trypanosoma cruzi motilité In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

Quantifier la taille du foie chez le poisson zèbre larvaire à l'aide de la microscopie Brightfield

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Préparation de Drosophila Larval et Pupal Testes pour l’analyse de la division cellulaire en direct, Tissu intact

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control over gene expression timing, location, and amplitude using light as the inducing agent. In this protocol, an optogenetic expression system is used to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos. This system relies on an engineered transcription factor called TAEL based on a naturally occurring light-activated transcription factor from the bacterium E. litoralis. When illuminated with blue light, TAEL dimerizes, binds to its cognate regulatory element called C120, and activates transcription. This protocol uses transgenic zebrafish embryos that express the TAEL transcription factor under the control of the ubiquitous ubb promoter. At the same time, the C120 regulatory element drives the expression of a fluorescent reporter gene (GFP). Using a simple LED panel to deliver activating blue light, induction of GFP expression can first be detected after 30 min of illumination and reaches a peak of more than 130-fold induction after 3 h of light treatment. Expression induction can be assessed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and by fluorescence microscopy. This method is a versatile and easy-to-use approach for optogenetic gene expression.

Optogenetics is a powerful tool with wide-ranging applications. This protocol demonstrates how to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos using the blue light-responsive TAEL/C120 system.

Expression de GFP induite par la lumière dans des embryons de poisson-zèbre à l’aide du système optogénétique TAEL/C120

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...