Nous remercions Susan Farmer et le personnel du centre de recherche de poisson zèbre UAB pour les soins du poisson zèbre. Le financement fourni par les fonds de démarrage du Département de pharmacologie et de toxicologie.

NOTE: Ce protocole a été approuvé par l&#39;Université de l&#39;Alabama à comité de protection et d&#39;utilisation des animaux Birmingham. 1. Élevage de poisson zèbre et collections d&#39;œufs <ol><li> Trois jours avant le début de l&#39;exposition aux produits chimiques, assembler bassins d&#39;élevage avec séparateurs à mâles et femelles séparés. Remplir chaque mi-chemin du réservoir avec de l&#39;eau du système de l&#39;aquaculture. L&#39;utilisation d&#39;un filet, transférer Tg (5xERE: GFP) poissons c262/c262 de bassins d&#39;élevage, en plaçant 2 mâles et 3 femelles dans chaque réservoir séparé par un diviseur. Placez un couvercle sur chaque réservoir et l&#39;étiquette avec la date et les souches à franchir. </li><li> Le lendemain matin, enlever tous les obstacles et de l&#39;inclinaison des déflecteurs pour créer une zone peu profonde à une extrémité de l&#39;aquarium de reproduction. Laisser le poisson zèbre pour s&#39;accoupler, la collecte des embryons à des intervalles de 10 min pour assurer la mise en scène de développement précis. Œufs propres par rinçage à travers une passoire à thé en utilisant un milieu E3B et rincer délicatement les embryons dans des boîtes de Pétri. Retour de poissons adultes à permanenteles réservoirs. </li><li> En utilisant un microscope de dissection, trier, compter, et enlever les embryons non fécondés, anormales ou endommagées. La place des embryons dans des boîtes de Pétri en milieu E3B et maison à 28,5 ° C avec une lumière 14h10: cycle d&#39;obscurité. densité de l&#39;embryon peut affecter le développement. Ne placez pas plus de 100 embryons dans une boîte de 100 mm x 35 et pas plus de 50 embryons dans une boîte de 60 mm x 15. </li><li> En 24 HPF, remplacer le support avec E3B contenant 200 uM 1-phényl 2-thiourée (PTU). PTU empêche la formation de pigment et conserve les embryons de poisson zèbre et de larves transparentes pour une clarté d&#39;image. ATTENTION: concentré PTU boursier est dangereux; porter des gants lors de la solution E3B + PTU. </li><li> A après la fécondation 1 jour (DPF), supprimer manuellement le chorion de l&#39;embryon à l&#39;aide de pinces fines. Le chorion ne semble pas affecter la pénétration des oestrogènes, mais la suppression améliore la clarté d&#39;image. Il n&#39;est pas nécessaire de retirer chorions des médias. NOTE: Comme alternative à dechorionation manuel, des lots d&#39;embryons peuvent être Chemiquement dechorionated en utilisant 1 mg / ml de pronase traitement, comme décrit précédemment 11. </li></ol> 2. Traitement chimique des embryons <ol><li> Le jour avant le traitement, la préparation des solutions mères de chaque produit chimique à une concentration 1000 fois dans du DMSO (ou solvant approprié). Par exemple, pour exposer les embryons à 10 uM bisphénol A (BPA), préparer une solution stock mM BPA de 10 à 100% de DMSO. Ceci assure la concentration de DMSO dans chaque traitement uniforme et permet une non-toxique 1:1000 dilution de DMSO pour servir de contrôle du véhicule. Solutions magasin de stock à -20 ° C. Pour ce protocole, les embryons seront exposés à 1 pM et 10 pM BPA, 18,5 nM et 1,85 uM génistéine, 367 nM d&#39;estradiol (contrôle positif) et véhicule (0,1% de DMSO, témoin négatif). ATTENTION: Les produits chimiques comme le BPA et l&#39;estradiol sont dangereux et peuvent avoir des effets néfastes sur le fœtus humain. Poignée perturbateurs endocriniens avec soin et toujours utiliser un équipement de protection individuelle approprié.</li><li> Le jour du traitement, d&#39;dégel préparé des solutions chimiques. Diluer 1:1000 par pipetage 1 ml E3B + PTU dans un tube de 1,5 ml et en ajoutant 1 pl de solution stock chimique. Vortex vigoureusement. Diluer DMSO 1:1000 dans E3B + PTU comme un contrôle de véhicule. Utilisez 1 ml E3B + PTU dans un tube de centrifugation de 1,5 ml comme un témoin non traité. </li><li> En utilisant un grand pipette de transfert en plastique de l&#39;alésage, de transfert d&#39;embryons à partir des boîtes de Pétri dans chaque puits d&#39;une plaque à 96 puits, 3 embryons par puits, 3 puits par condition. Pour éviter l&#39;évaporation au cours du traitement prolongé, omettre embryons de lignes extérieures et les colonnes de la plaque (lignes A et E, les colonnes 1 et 12). Puits extérieurs peuvent être remplis avec 300 pl de E3B + PTU. Etiqueter le couvercle de la plaque de manière appropriée. </li><li> Retirez le support de chaque puits avec une fine pointe de transfert en plastique pipette. Travaillez rapidement pour éviter le dessèchement des embryons. </li><li> Ajouter 200 ul de solution de traitement dans le puits correspondant. Placer le couvercle underneath la plaque en tant que guide pour assurer l&#39;addition de traitements dans les puits appropriés. Vortex chaque tube avant pipetage pour distribuer le produit chimique en solution. Confirmer visuellement chaque embryon est dans la solution de traitement. Si les embryons sont sur le côté du puits, utiliser une pipette de transfert propre à les laver dans le puits avec la solution de traitement. </li><li> Placer la plaque dans l&#39;incubateur à 28,5 ° C. Les embryons seront analysés pour la fluorescence à 72 HPF. </li></ol> 3. Automated Imaging des embryons en plaques à 96 puits <ol><li> Anesthésier les embryons en ajoutant 10 ul de 4 mg / ml de tricaïne à chaque puits. REMARQUE: Anesthetize embryons avant l&#39;imagerie. À 24-96 HPF, le poisson-zèbre exposer mouvement spontané et une réaction de sursaut à la source de lumière changeante pendant la capture d&#39;image. Anesthésier embryons réduit le mouvement lors de l&#39;imagerie. </li><li> Placer la plaque de 96 puits dans la platine motorisée et calibrer la scène. Utilisation Zeiss Zen Bleu de 2011 logiciels pour la microscopie automatiquementsur et de contrôle, sélectionnez l&#39;option de support de l&#39;échantillon et de sélectionner multipuits 96. Sélectionnez étalonnage. Suivez les instructions pas à pas pour calibrer la scène. NOTE: Ne pas décocher le bouton tuiles après cette étape. Si le bouton de tuiles n&#39;est pas cochée, les paramètres d&#39;étalonnage peuvent être perdues et la plaque de 96 puits devront être recalibré. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un objectif 10x et le fond clair (BF) fixant, identifier un embryon de contrôle positif et définir les paramètres d&#39;exposition appropriée pour BF et canaux de GFP, faire en sorte que le signal de fluorescence est pas saturer la caméra. Focus sur un seul embryon et programmer le microscope pour acquérir 3 total Z-sections, une image 50 um ci-dessus et un 50 um ci-dessous le plan focal actuel. NOTE: En raison de différents tissus occupent différents plans focaux, ce qui garantira que pour chacune des images de poisson zèbre sont capturées avec le coeur et le foie au point. </li><li> Définissez les paramètres du logiciel à acquérir une image en mosaïque utilisant la GFP et BF Channels. Sous l&#39;onglet d&#39;acquisition, sélectionnez la configuration avancée. Certaines régions de tuiles, puis les tuiles. Choisissez l&#39;option cercle bien. REMARQUE: Carrelage est utilisé pour créer une image composite de chaque puits. Un champ de vision unique ne saisit qu&#39;une petite partie de chaque bien. La fonction de carrelage peut capturer automatiquement multiples adjacent de chaque puits des champs de vue, la création d&#39;une image composite de l&#39;ensemble du bien. Il est donc possible de capturer automatiquement des images composites 96 par plaque, où chaque image composite contient plusieurs dizaines d&#39;images individuelles à partir d&#39;un seul bien. </li><li> Sélectionnez transporteur et le facteur de remplissage de 90%. La sélection d&#39;un facteur de remplissage de 90% sera capturer plusieurs images des puits choisis de telle sorte que 90% de la surface de chaque puits est visible dans l&#39;image composite. Remarque: Lors de la sélection facteur de remplissage, un diagramme est affiché représentant la zone à imager. Sélectionnez un pourcentage qui comprendra la zone du puitsqui est appropriée pour l&#39;expérience. </li><li> Sous Options, sélectionnez la quantité de chevauchement souhaité. NOTE: Lorsque la couture de tuiles pour une seule image représentant, un chevauchement de 5-10% permet une couture lisse entre les images. Toutefois, si l&#39;assemblage des images n&#39;est pas nécessaire, en utilisant un recouvrement de 0% sera de réduire le temps d&#39;imagerie. Utilisation de 90% facteur de remplissage et 5% de chevauchement, une image composite d&#39;un seul puits est constitué de 59 images individuelles. </li><li> Lancer imagerie. Le microscope va acquérir automatiquement les images. </li><li> Inspecter manuellement images composites de chaque puits pour la fluorescence spécifique du tissu (figure 1). </li><li> NOTE: Il est préférable de commencer avec le contrôle positif à confirmer que l&#39;exposition chimique travaillé avant à l&#39;observation des puits de traitement expérimental. </li></ol> 4. L&#39;image saisie manuelle des embryons en plaque de 96 puits REMARQUE: Pour confirmer les résultats, utilisez un objectif 20x à longue distance de travail à acQuire des images plus détaillées manuellement (Figure 2). <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un objectif 20x et le fond clair (BF) fixant, identifier un embryon de contrôle positif et définir les paramètres d&#39;exposition pour les canaux BF et GFP de manière appropriée, en veillant à ce que le signal de fluorescence est pas saturer la caméra. </li><li> Identifier les embryons individuels et de capturer des images manuellement. NOTE: Une fois les paramètres d&#39;exposition ont été sélectionnés pour l&#39;embryon de contrôle positif, ne pas modifier les réglages. Ceci permet une comparaison de l&#39;intensité de fluorescence en tant que chaque image est capturée dans des conditions uniformes. </li></ol>

<ol>
	<li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).</li><li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish.">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li><li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish.">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li><li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+A+tool+for+chemical+screens.">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li><li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos.">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li><li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+reporter+quantification+in+vivo:+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish.">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li><li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens.">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+estrogen+response+element.">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li><li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation.">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book:+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (2000).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Ce protocole décrit une méthode simple pour automatiquement fluorescence spécifique des tissus image embryons de poisson zèbre. Le protocole a été développé en utilisant un Zeiss Axio Observer. Z1 avec Zen logiciel Blue 2011, cependant la technique peut être adaptée en utilisant n&#39;importe quel microscope inversé avec une platine motorisée et un logiciel de contrôle de microscope qui peut effectuer carrelage pour créer des images composites. L&#39;équipement d&#39;un microscope inversé avec une platin...

Poisson-zèbre transgénique ont été développés qui permettent la visualisation directe de l&#39;activité dans les voies, telles que les facteurs de croissance des fibroblastes 1, l&#39;acide rétinoïque et les œstrogènes 2 3, dans embryons vivants signalisation. De tels outils permettent le dépistage de substances qui perturbent les voies de signalisation (dosée comme changement de l&#39;intensité de fluorescence) ou à des composés chimiques qui modulent la signalisation d&#39;une manière spécifique d&#39;un tissu (changement de fluorescence localisation) 4. Capture d&#39;image automatisé augmente le débit d&#39;écrans chimiques considérablement 5,6. Écrans fluorescence dosage automatiquement chez le poisson zèbre en direct s&#39;appuient souvent sur des équipements coûteux, spécialisé. Soi-disant criblage à haut contenu offre l&#39;avantage de la haute résolution, l&#39;imagerie quantitative, mais au prix de l&#39;utilisation de lecteurs de plaques spécialisées équipées pour la microscopie confocale 7,8. Le but de cette méthode est d&#39;automatiquement fluorescence spécifique des tissus essai dans embryons de poissons zèbresdans une plaque à 96 puits en utilisant un microscope à épifluorescence standard. Fluorescence spécifique d&#39;un tissu peut être distingué en utilisant cette technique et peut-être une approche raisonnable pour les laboratoires qui n&#39;ont pas accès aux lecteurs de plaques spécialisées ou de l&#39;équipement de haute teneur dépistage. Dans ce protocole, nous utilisons l&#39;imagerie automatisée pour détecter récepteur des oestrogènes tissu-spécifique (ER) des agonistes chez le poisson zèbre en direct à 3 jours après la fécondation (DPF). La lignée transgénique Tg (5xERE: GFP) c262/c262 contient 5 tandem réponse aux œstrogènes séquences d&#39;ADN d&#39;éléments (ERE) en amont de la protéine fluorescente verte (GFP) 3. En l&#39;absence de ligand, RÉ sont normalement inactifs. La liaison du ligand déclenche un changement de conformation, ce qui permet de lier les récepteurs ERE ADN et régulent la transcription 9. 5xERE: poissons GFP peuvent être utilisés pour cribler des bibliothèques chimiques pour modulateurs ER et peuvent être utilisés pour cribler des échantillons d&#39;eau de l&#39;environnement pour les contaminants oestrogéniques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:885px;" width="886">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:451px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; wide bore</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plastic transfer pipettes; fine tip</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well, round, flat bottom plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">21-377-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100 x 35mm paltes</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 60mm plates</td>
			<td style="width:100px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dumont #5 fine forceps</td>
			<td style="width:100px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
			<td>tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tricane methanesulfonate</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040-25G</td>
			<td>see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P7629-10G</td>
			<td>Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 &#956;M in E3B&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">20x long working distance objective</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiocam HRm digital camera</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ZenBlue 2011 microscope control software</td>
			<td style="width:100px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;MB-1; 25 grams</td>
			<td>make 2% solution in RO water for use in E3B (below)</td>
		</tr>
		<tr height="273">
			<td height="273" style="height:273px;">E3B</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:451px;">60X E3 SOLUTION: 
			NaCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 17.2 grams 
			KCl&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; - 0.76 grams 
			CaCl2-2H2O&#160;&#160;&#160;&#160; - 2.9 grams 
			MgSO4-7H2O&#160; - 4.9 grams or MgSO4 &#8211; 2.39 grams 
			Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 
			 
			1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 
			60X E3&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 150mls 
			2% methylene blue&#160;&#160;&#160;&#160; 100&#956;l&#160; 
			Bring to 9 liters with Milli-Q water 
			&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos

Embryons de poisson zèbre constituent un outil puissant pour le dépistage à grande échelle de petites molécules. Poisson-zèbre transgénique qui exprime des protéines rapporteurs fluorescents sont fréquemment utilisés pour identifier des produits chimiques qui modulent l&#39;expression des gènes. écrans chimiques qui essai de fluorescence chez le poisson zèbre en direct s&#39;appuient souvent sur des équipements coûteux, spécialisé pour le criblage à haut contenu. Nous décrivons une procédure à l&#39;aide d&#39;un microscope à épifluorescence standard avec une platine motorisée à automatiquement l&#39;image des embryons de poisson zèbre et de détecter la fluorescence spécifique de tissu. Utilisation de poisson-zèbre transgénique pour signaler que l&#39;activité du récepteur des oestrogènes via l&#39;expression de la GFP, nous avons développé une procédure semi-automatique pour cribler des ligands du récepteur de l&#39;œstrogène qui activent le rapporteur d&#39;une manière tissu-spécifique. Dans cette vidéo, nous décrivons les procédures pour rangeant embryons de poisson zèbre à 24-48 heures après la fécondation (HPF) dans une plaque de 96 puits et ajouter de petites molécules qui se lient les récepteurs des œstrogènes. À 72-96 HPF, des images de chaque puits dela totalité de la plaque sont collectées automatiquement et manuellement pour inspecter fluorescence spécifique d&#39;un tissu. Ce protocole démontre la capacité de détecter les oestrogènes qui activent les récepteurs dans les valves cardiaques, mais pas dans le foie.

La figure 1 montre des images composites à partir de puits individuels d&#39;une plaque à 96 puits. Chaque image composite est composé de 59 images individuelles avec 5% d&#39;image de chevauchement. Notez que le poisson zèbre en direct sont orientés de façon aléatoire au sein de chaque bien, mais nous sommes en mesure de distinguer la fluorescence dans le coeur du foie. Images en fond clair sont utiles comme références pour évaluer l&#39;orientation du poisson zèbre et de visualiser les anom...

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Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Décrit ici est un protocole d&#39;imagerie semi-automatisé de la fluorescence spécifique de tissu d&#39;embryons de poisson zèbre.

Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

semi-automated-imaging-tissue-specific-fluorescence-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K vues.  University of Alabama at Birmingham.  Décrit ici est un protocole d'imagerie semi-automatisé de la fluorescence spécifique de tissu d'embryons de poisson zèbre. 

Vidéo: Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection d&#39;ARNm et oligonucléotides antisens morpholino dans embryons de poissons zèbres.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Recherche

Biologie

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Deux photons axotomie et time-lapse imagerie confocale dans embryons de poissons zèbres vivent

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Analyse semi-automatisée Heartbeat optique de petits coeurs

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Deux-Photon-Based photoactivation dans Live embryons de poissons zèbres

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

La transplantation de blastomères exprimant la GFP pour l&#39;imagerie en direct sur le développement de la rétine et du cerveau dans les embryons de poissons zèbres chimériques

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Changement de forme d&#39;imagerie cellulaire en vie Drosophile Embryons

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Assay immunoprécipitation de la chromatine des gènes spécifiques de tissus en utilisant des embryons de souris en début de

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Glycanes imagerie dans embryons de poissons zèbres par marquage métabolique et Chimie Cliquez Bioorthogonal

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Analyse du profil métabolique des embryons de poisson zèbre

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...