Nous remercions Bernard Foucart pour l&#39;assistance technique. Ce travail a été financé par le Fonds belge de la recherche scientifique (FRS-FNRS) et par le Fonds Reine Elisabeth pour la recherche médicale. Agnès Villers est chercheur au Fonds de la Recherche Scientifique.

Toutes les procédures d&#39;animaux ont été effectuées en conformité avec les Instituts de réglementation de la Santé nationale pour le soin et l&#39;utilisation des animaux en recherche et avec l&#39;accord du comité d&#39;éthique local. 1. Préparation de Artificial liquide céphalo-rachidien Les mêmes médias sont utilisés pour disséquer, couper et perfuser tranches (1 ml / min) pendant la période de repos et les enregistrements électrophysiologiques. Ce support est composée de NaCl 124 mM, 4,4 mM de KCl, 26 mM NaHCO3, 1 mM de NaH 2 PO 4, 2,5 mM de CaCl2, 1,3 mM MgSO4 et 10 mM D-glucose. <ol><li> Peser les différentes composantes de 2 L de ACSF sauf MgSO 4, qui est déjà en solution (1 M). En utilisant une solution standard permet d&#39;être sûr de la concentration exacte de Mg 2 +, car MgSO4 en poudre est fortement hygroscopique. Ca 2 +: Mg 2 + rapport influe grandement sur ​​l&#39;induction et l&#39;entretien LTP14 et donc leurs proportions doivent toujours être respectés. </li><li> Mettez tous les composants à l&#39;exception de CaCl2 dans un verre graduée et porter à 2 L d&#39;eau distillée H 2 O. </li><li> Remuer vigoureusement. Quand tout est dissous, ajouter carbogène par un bulleur d&#39;aquarium et de tubes attachés à la cuve (95% O 2, 5% de CO 2). Attendez quelques minutes et ajouter du chlorure de calcium lorsque le pH est fixé à 7,4 par l&#39;action de tampon bicarbonate. </li><li> Gardez 600 ml dans un plat rectangulaire en verre réfrigéré et refroidir à 4 ° C avec de la glace autour de l&#39;assiette. Ce support sera utilisé pour la dissection de l&#39;hippocampe. </li><li> Filtrer l&#39;1,400 ml restants et conserver dans une fiole Erlenmeyer. </li></ol> 2. Préparation du Rig électrophysiologique et le cerveau Slice chambre d&#39;enregistrement Le circuit de perfusion est composé de 2 pompes péristaltiques, un pompage de fluide frais à partir d&#39;un réservoir de réserve et l&#39;autre de pompage de fluide utilisé de tchambre, il vous enregistrez sur une poubelle. Liquide frais est ajouté à un système de perfusion artisanale où elle est ré-oxygéné et chauffé avant d&#39;atteindre la chambre d&#39;enregistrement d&#39;interface par gravité (figure 1A). La chambre d&#39;enregistrement de l&#39;interface été conçu par FST (Outils Fine Science, Vancouver, Canada, figure 1B). des tranches de tissu sont placés sur le filtre net tissés attachés à un anneau de puits amovible et peut être maintenue en permanence dans des conditions d&#39;interface en réglant la hauteur du puits d&#39;aspiration d&#39;aiguille. Un tube en matière plastique fait maison est bloqué à son extrémité et perforé latéralement (0,5 mm) est fixé à l&#39;aiguille d&#39;aspiration pour augmenter la stabilité de ce niveau dans la chambre. La tête d&#39;enregistrement est montée sur un bain d&#39;eau contenant une pierre de dispersion de gaz qui contribue à maintenir un environnement humide en faisant passer de l&#39;air humide à travers des orifices de déviation dans la tête d&#39;enregistrement (pour diminuer la formation de gouttelettes d&#39;eau). Bain et de la température du fluide sont contrôlées en faisant varier en continu le niveau de courant continu èmerugueux un caoutchouc de silicone incorporée élément de chauffage dans le bain d&#39;eau. Thermistances dans le bain d&#39;eau et les puits d&#39;enregistrement de la température permettent de la chambre pour être réglée et contrôlée précisément à ces sites. Le système de chauffage de la chambre est complétée par un système de chauffage global commander la température de l&#39;ensemble du gréement. Le logiciel développé par des chercheurs de l&#39;Université d&#39;Edimbourg ( <a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a> ) surveille et égalise la température de l&#39;air oxygéné, la tranche de cerveau, les électrodes et le gréement restant fournir un environnement stable pour les enregistrements à long terme (figure 1C) . La température utilisée pour des coupes d&#39;hippocampe de souris est de 28 ° C. <ol><li> Rincez tout le circuit de perfusion à l&#39;eau distillée H 2 O pour un minimum de 20 min et démarrer les systèmes de chauffage. </li><li> Commencez le bouillonnement carbogène dans le circuit. Carbogen arrive dans les faits maison tubes de perfusion à travers fbougies ILTER et dans le bain d&#39;eau au-dessous de la chambre d&#39;enregistrement. Le débit dans le bain d&#39;eau est contrôlé par un débitmètre. Si le débit est trop lent, le tissu pourrait devenir hypoxique. Inversement, si le débit est trop élevé, le gaz pourrait ne pas être suffisamment réchauffé et humidifié menant au séchage du tissu. Débit de gaz élevé peut aussi augmenter les chances de pulvérisation d&#39;eau sur le tissu du bain d&#39;eau au-dessous menant à un choc osmotique. Ceci peut être évité en ajoutant des bits de nylon de maille (100 um) à la sortie des orifices de déviation. </li><li> Purger le circuit et remplir avec ACSF filtré. </li><li> Mettez l&#39;anneau qui soutiendra la tranche dans la chambre de retenue. Un filtre filet tissé avec des ouvertures de mailles allant de 500 à 750 um est étiré et fixé sur le noyau avec deux parties de la colle époxy à base de résine. Le filtre net tissé est composé de 87% polyamide et 13% élasthanne (culotte 15 den). Colle doit être appliquée avec soin pour éviter la formation de reliefs à la surface de la ring. </li><li> Retirez soigneusement toutes les bulles d&#39;air du circuit. </li><li> Ajuster le niveau de ACSF dans la chambre d&#39;enregistrement par la vis de l&#39;aiguille d&#39;aspiration. La vitesse des pompes péristaltiques est ajusté à 1 ml / min pour la pompe d&#39;entrée et de 5 ml / min pour la pompe de sortie. </li></ol> Le système de perfusion est placée sur une table rigide résistant aux vibrations et entouré d&#39;une cage de Faraday. 3. Préparation de la zone de dissection Instruments chirurgicaux: un scalpel avec une lame # 11, petits ciseaux standards de dissection, ciseaux, pinces à ressort courbes, deux Heidemann spatules et une cuillère. Les données supplémentaires: une guillotine, une alèse, un hacheur de tissu McIlwain avec une lame de rasoir, un papier filtre, une pipette Pasteur en verre avec une tétine en caoutchouc, deux plastique Pasteur pipettes dont l&#39;une avec une large ouverture, une boîte de Pétri, un cylindre métallique de 7 mm de diamètre (figure 2A). <ol><li&gt; dans le plat rempli de dissection froide ACSF (préparé à l&#39;étape 1), plonge un couvercle en verre réfrigéré d&#39;un plat de coloration, enveloppé dans du papier filtre. Retirez délicatement les bulles d&#39;air et oxygéner l&#39;ACSF à travers un barboteur aquarium (figure 2A). </li><li> Disposez les instruments dans l&#39;ordre d&#39;utilisation. Ajouter trois couches de papier filtre sur la plaque de découpage de tissu et d&#39;une nouvelle lame de rasoir nettoyé avec de l&#39;eau distillée et de l&#39;éther (figure 2B). Lame de rasoir doit être horizontale lorsque la pile de papier. la force de la lame est ajustée à la moitié de la valeur maximale et la vitesse à environ un tiers de la valeur maximale. </li><li> Vérifiez attentivement si tout est prêt (instruments, température ...) parce que vous n&#39;aurez pas le temps par la suite. </li><li> Demandez à quelqu&#39;un de pulvériser la dissection avec une pipette Pasteur rempli avec ACSF froid. </li><li> Anesthésier la souris avec IP Nembutal (100 mg / kg) avant la décapitation. anesthésie à l&#39;halothane peut également être utilisé. Nous avons comparé les deux méthodes et bénéficier du droitminé mêmes résultats. Décapitation doit être réalisée sous anesthésie mais dislocation cervicale peut également être utilisé. Cependant dislocation cervicale a besoin d&#39;une très bonne pratique pour éviter la souffrance animale. </li><li> Disséquer le underpad aussi rapidement que possible sous ACSF douche froide continue. </li></ol> 4. Retrait du cerveau <ol><li> Tout en maintenant toujours la tête avec l&#39;index et le pouce d&#39;une main sur la bouche, faire une incision avec des ciseaux de dissection le long du milieu de la partie supérieure de la tête à partir du bord de la coupe guillotine et le fonctionnement rostralement à l&#39;os frontal . </li><li> Couper à travers le muscle cutané de chaque côté de la tête pour exposer pleinement les plaques de crâne et de supprimer les muscles sur le côté extrême de la tête. </li><li> Avec des ciseaux de dissection, couper le muscle temporal de chaque côté, le long de la plaque temporal, puis couper les plaques frontales dans le milieu, transversalement. Ensuite, faire une petite coupure sur l&#39;os occipital, entre les deux plAtes. </li><li> Pour chaque face, coupée à la base caudale des plaques occipitaux. </li><li> Coupez le long de la suture sagittale avec des ciseaux à ressort. </li><li> Avec des pinces, retirer les moitiés de crâne en les étalant les uns des autres. </li><li> Avec le scalpel, couper transversalement juste après le bulbe olfactif et juste avant le cervelet puis plonger le cerveau extrait dans le plat de dissection avec ACSF froid. </li></ol> 5. Dissection hippocampique <ol><li> Une fois que le cerveau est immergé dans le plat de dissection, séparer les deux demi-sphères de l&#39;autre avec un scalpel insérée dans le milieu. </li><li> La dissection de l&#39;hippocampe est réalisée avec spatules sous contrôle visuel à travers un microscope opératoire binoculaire (X25, figure 2A). D&#39;un hémisphère, écartez avec précaution les structures pour voir le ventricule latéral. Enlevez le tronc cérébral et le diencéphale. Cela se fait en appliquant le spatules sur le cortex frontal sur un côté et sur le diencéphale sur leautre côté. Prenez soin de ne pas toucher l&#39;hippocampe avec les spatules et de ne pas l&#39;étirer pendant la coupe du tissu. </li><li> Sever le cul de sac puis poussez doucement l&#39;hippocampe sur le cortex (rouler), en insérant une spatule dans le ventricule. </li><li> Lorsque l&#39;hippocampe est extraite, enlever les tissus de cortex excès et les vaisseaux sanguins restants. </li></ol> 6. Couper des tranches <ol><li> Avec un plastique bouche grande pipette Pasteur, transférer l&#39;hippocampe dans une cuillère avec ses hausse de surface Alvear (côté convexe). </li><li> Retirer l&#39;excès de liquide avec une pipette Pasteur en plastique standard. </li><li> Astuce jusqu&#39;à la cuillère verticalement près de toucher le papier filtre du hacheur (figure 2B) et déposer l&#39;hippocampe de la cuillère, en touchant rapidement le papier filtre puis reculer la cuillère. </li><li> Orienter l&#39;hippocampe et le découper transversalement à 400 um avec le hachoir (voir figure 2C pour l&#39;orientation de l&#39;hippocampepus par rapport à la lame de rasoir). Agir aussi rapidement que possible. </li><li> Retirez le papier filtre avec l&#39;hippocampe en tranches et l&#39;enrouler autour du cylindre métallique de répartir les tranches un peu. Puis, libérez les tranches avec des pulvérisations de ACSF utilisant un standard en plastique pipette Pasteur et à leur rassemblement dans une boîte de Pétri remplie avec ACSF froid. </li></ol> 7. L&#39;incubation des tranches d&#39;interface <ol><li> Sélectionner tranches avec une pipette Pasteur plastique standard et placer rapidement dans la chambre d&#39;enregistrement. Tranches remettre des traumatismes de dissection directement dans la chambre d&#39;enregistrement, dans l&#39;interface à 28 ° C. </li><li> La tranche sera très probablement évier. Abaisser le niveau de liquide d&#39;atteindre le niveau de tranche, puis porter à le faire flotter. </li><li> Tourner la tranche dans la position correcte pendant l&#39;abaissement du niveau. Les tranches sont toujours orientés de la même manière afin de faciliter le positionnement des électrodes (2 stimulant et une des électrodes d&#39;enregistrement) dans la région CA1. </li><li> Arrêtez-vous lorsquele fluide est en interface. Un &quot;ménisque&quot; du support autour de la tranche est indicatif d&#39;un niveau suffisant de médias. Le filtre net doit être saturé de médias, mais pas complètement immergée. </li><li> Gardez la chambre couverte de papiers filtre placé sur le couvercle perforé. </li><li> Laisser reposer la tranche pendant au moins 1,5 heures à 28 ° C. </li></ol> 8. Enregistrement des réponses synaptiques <ol><li> Enregistrement d&#39;électrode: capillaires en verre sont tirés d&#39;obtenir une résistance à la pointe de 2-5 MQ lorsqu&#39;il est rempli avec ACSF. Un petit morceau de papier filtre est placée autour de la pointe de l&#39;électrode et de la cire d&#39;os est appliquée à l&#39;extrémité pour réduire la condensation. Électrodes de stimulation: platine-iridium électrodes de munitions bipolaires avec un diamètre de 12,5 um sont achetés auprès de FHC (USA). Avec des soins appropriés, chaque électrode peut être utilisé au moins 30 fois (figure 1B). </li><li> Positionner les électrodes dans le stratum radiatum de la région CA1, toutes les électrodes alignéesvers le haut (figure 3A). Les électrodes sont abaissés de 75 à 150 um sous la surface de la tranche avec micromanipulateurs Narishige. Les deux électrodes de stimulation sont placées pour stimuler deux faisceaux distincts de Schaffer collatéraux. Lorsque les électrodes sont abaissées sur la tranche, papiers filtres sont soigneusement placées tout autour pour fermer la chambre. </li><li> La stimulation biphasique (0,08 msec durée d&#39;impulsion par demi-onde) est effectuée à une tension constante avec un stimulateur Grass connecté à des unités d&#39;isolement UES-V. Réponse maximale est effectuée par augmentation de l&#39;intensité de stimulation à partir de 2 V à 12 V. maximale EPSP de champ sont amplifiés 1000 fois avec un amplificateur WPI ISO-80 et filtrés à 10 Hz et 10 kHz. Le signal est ensuite envoyé à un PC via un convertisseur A / D Instrument National. Stimulation, l&#39;acquisition et l&#39;analyse des données sont effectuées en utilisant le programme WinLTP ( <a href="http://www.winltp.com">www.winltp.com</a> ). EPSP de champ sont enregistrés à 40% de l&#39;amplitude maximale obtenue à une entrée de départmettre courbe. Pour chaque tranche, les pentes fEPSP sont normalisées contre la pente moyenne sur les 30 min précédant LTP induction. </li><li> LTP est déclenchée par l&#39;application d&#39;un seul train de stimulation (100 Hz) à la force d&#39;essai sur une voie tandis que la seconde voie sert de témoin. </li></ol> 9. Le nettoyage de l&#39;installation <ol><li> Rincer tout le circuit avec une solution à 3% de peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2) pendant au moins 10 min, puis égoutter. Le circuit sera soigneusement rincé à l&#39;eau distillée avant de commencer toute expérience. L&#39;utilisation de H 2 O 2 n&#39;est pas absolument nécessaire que d&#39;autres laboratoires utilisent uniquement de l&#39;eau distillée pour le nettoyage, mais nous avons remarqué le dépôt de résidus noirs dans le système de tuyauterie en utilisant uniquement de l&#39;eau. </li><li> Remplacer l&#39;eau dans le bain d&#39;eau au-dessous de la chambre d&#39;enregistrement. </li><li> Bain stimulant les conseils des électrodes dans l&#39;alcool pendant 5 min. </li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons développé dans notre laboratoire un protocole résultant de la combinaison des méthodes développées et utilisées par d&#39;autres laboratoires ayant une grande expertise dans la LTP enregistrements 11,17. Ce protocole est adapté à l&#39;hippocampe de souris adulte et peut être utilisé chez les animaux de tout âge et de tout génotype de fond. Il permet également l&#39;analyse de LTP dans des souris transgéniques développement des maladies neurodégénératives comme la maladie d&#39;A...

Aujourd&#39;hui, il ya une compréhension limitée de la façon dont les souvenirs complexes sont mémorisés et rappelés au niveau du circuit neuronal. Cependant, une hypothèse unificatrice de stockage de mémoire est disponible et largement acceptée: les souvenirs sont stockés comme des changements dans la force des connexions synaptiques entre les neurones dans le système nerveux central. À elle seule, la recherche sur la plasticité synaptique a largement bénéficié de deux découvertes révolutionnaires. (1) Dans un essai séminal, Bliss et Lomo 1, en ​​utilisant le lapin anesthésié intact, a constaté que la livraison d&#39;une brève haute fréquence (1 sec, 100 Hz) stimulation de la voie perforante de l&#39;hippocampe a provoqué une longue durée (plusieurs heures) augmenter dans les connexions synaptiques liés. Ce phénomène fascinant s&#39;appelait «potentialisation à long terme» ou LTP par Douglas et Goddard en 1975 2. (2) Par la suite, il a été constaté qu&#39;un phénomène similaire pourrait être déclenché dans des tranches de cerveau (0,4 mm) maintenu artificiellement en vie in vitro </em&gt;. La LTP plus étudié a été observée in vitro en fournissant un ou plusieurs tetani à un faisceau d&#39;axones (les soi-disant collatérales de Schaffer) tout en enregistrant le champ excitateur potentiel synaptique résultant évoqué dans les neurones pyramidaux de la région dite CA1. Les mécanismes de LTP induction ont été largement mis en évidence. Fondamentalement, un influx de Ca2 + à travers les récepteurs NMDA active les enzymes avec deux conséquences: une phosphorylation des récepteurs AMPA (ce qui augmente leur efficacité) et une incorporation de récepteurs AMPA supplémentaires dans la membrane post-synaptique 3. En revanche, les mécanismes de la phase de maintien de la LTP sont largement inconnues, notamment parce qu&#39;elle est expérimentalement beaucoup plus difficile de maintenir une tranche santé pendant de nombreuses heures que pendant 30 à 60 min. Beaucoup d&#39;études ont été consacrées à la compréhension des mécanismes LTP et des théories intéressantes ont été élaborés au cours des années 4-11. Mais l&#39;ONUjusqu&#39;à présent, les mécanismes moléculaires précis qui sous-tendent l&#39;augmentation stable de la force synaptique n&#39;ont pas été élucidées. Cela pourrait être dû en partie à la difficulté de reproduire les résultats précédents dans différents laboratoires utilisant des techniques différentes pour la préparation et l&#39;entretien des coupes d&#39;hippocampe. Dans leur document de méthodologie, le 12 Sajikumar et al. Souligné l&#39;importance des conditions expérimentales pour la préparation de coupes d&#39;hippocampe de rat et l&#39;enregistrement de LTP stable. Dans cette vidéo, nous vous présentons l&#39;ensemble des étapes d&#39;optimisation développés dans notre laboratoire au cours des années pour être en mesure d&#39;enregistrer une LTP très stable dans les tranches d&#39;hippocampe de souris. Cette optimisation a été faite à partir des protocoles développés et utilisés avec succès par d&#39;autres laboratoires qui étudient les mécanismes LTP chez les souris et les rats 13 11. Il permet aux chercheurs expérimentés pour induire et enregistrent une très longue durée LTP chez des souris adultes avec un taux de réussite élevé. Le physiological base de la LTP induite a été soigneusement vérifié et démontré 14. Dans ce document de méthodologie, nous montrons que les modifications des conditions expérimentales, telles que la température ou l&#39;oxygénation peuvent avoir un impact profond sur l&#39;entretien LTP alors que la procédure de dissection peut profondément modifier tranches excitabilité. Il faut également souligner que le contrôle précis de tous ces paramètres nécessite une formation de plusieurs mois pour les étudiants débutants.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 1M</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>63126</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Air Liquide (Belgium)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>WPI, Inc. (UK)</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating Electrodes</td>
			<td>FHC (USA)</td>
			<td>CE2B30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>FST (Germany)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper 84 g/m2</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>FT-3-105-110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh</td>
			<td>Lycra</td>
			<td>15 den</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>plus endfest300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>WPI, Inc. (UK)</td>
			<td>ISO-80</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface recording chamber</td>
			<td>FST (Germany)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pumps</td>
			<td>Gilson (USA)</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>University of Edinburgh</td>
			<td><a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a></td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Mcllwain</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulators</td>
			<td>Grass (USA)</td>
			<td>S88X + SIU-V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program analysis</td>
			<td>WinLTP</td>
			<td><a href="http://www.winltp.com" target="_blank">www.winltp.com</a></td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3 and MMO-220A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A/D converter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NIPCI-6229 M-series</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved preparation and preservation of hippocampal mouse slices for a very stable and reproducible recording of long-term potentiation

Potentialisation à long terme (LTP) est un type de plasticité synaptique caractérisée par une augmentation de la force synaptique et censé être impliqué dans l&#39;encodage de la mémoire. LTP a suscité dans la région CA1 de tranches d&#39;hippocampe aiguë a été largement étudiée. Cependant, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la phase d&#39;entretien de ce phénomène sont encore mal compris. Cela pourrait être dû en partie aux différentes conditions expérimentales utilisées par les différents laboratoires. En effet, la phase de maintien de la LTP est fortement dépendant de paramètres extérieurs tels que l&#39;oxygénation, la température et l&#39;humidité. Il dépend aussi de paramètres internes tels que l&#39;orientation du plan de tranchage et la viabilité de la tranche après dissection. L&#39;optimisation de tous ces paramètres permet l&#39;induction d&#39;une potentialisation très reproductible et très stable à long terme. Cette méthode offre la possibilité d&#39;explorer plus avant les mécanismes moléculaires impliqués dans l&#39;augmentation stablela force synaptique dans des coupes d&#39;hippocampe. Il souligne également l&#39;importance des conditions expérimentales dans l&#39;investigation in vitro de phénomènes neurophysiologiques.

Cette méthodologie a été utilisée pour analyser les propriétés de potentialisation à long durable à long terme induite dans des coupes d&#39;hippocampe aiguë de souris C57BL/6J adultes (JANVIER SAS, France) 14. Étonnamment, l&#39;amélioration des conditions expérimentales a conduit à une nouvelle façon de regarder LTP. Nous avons montré que augmentation durable de la force synaptique n&#39;exigeait pas la synthèse de nouvelles protéines. Ici, nous montrons que l&#...

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Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Cet article présente une méthodologie complète pour préparer et conserver<em&gt; In vitro</em&gt; Coupes d&#39;hippocampe aiguë de souris adultes. Ce protocole permet l&#39;enregistrement de potentialisation à long terme durable très stable (LTP) pendant plus de 8 heures avec un taux de réussite de 95%.

Amélioration de la préparation et la conservation de l&#39;hippocampe Tranches de souris pour un enregistrement très stable et reproductible de potentialisation à long terme

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

improved-preparation-preservation-hippocampal-mouse-slices-for-very

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.6K vues.  University of Mons. Cet article présente une méthodologie complète pour préparer et conserver In vitro Coupes d'hippocampe aiguë de souris adultes. Ce protocole permet l'enregistrement de potentialisation à long terme durable très stable (LTP) pendant plus de 8 heures avec un taux de réussite de 95%.

Vidéo: Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Préparation des oligomères β-amyloïde 1-42 Et induction de la plasticité synaptique Dépréciation sur les coupes d&#39;hippocampe

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

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Neurosciences

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

Préparation des coupes d&#39;hippocampe aiguë chez des rats et des souris transgéniques pour l&#39;étude des altérations synaptiques au cours du vieillissement et de l&#39;amylose pathologie

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Reproductible écrasement du nerf sciatique de souris et l&#39;évaluation subséquente de la régénération par l&#39;analyse du Mont muscle entier

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Une poli et renforcé Diluée-crâne fenêtre for Long-term imagerie du cerveau de souris

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

Préparation d&#39;une souris Awake pour l&#39;enregistrement des réponses de neurones et l&#39;injection de traceurs

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Un indicateur moléculaire de l&#39;adaptation à long terme olfactive dans<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Appariés enregistrements de cellules entières dans organotypiques coupes d&#39;hippocampe

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Une méthode simplifiée pour les ultra-basse densité, à long terme primaire hippocampique Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Enregistrement de la plasticité synaptique dans des tranches d’hippocampe aiguës maintenues dans un petit volume recyclage - Perfusion- et système de chambre de Submersion-type

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...