Ce travail a été soutenu par l&#39;American Heart Association (post-doctoral à AYS) et le National Institutes of Health (MH085499, EB003832 et OD006831 à DK). Nous tenons à remercier Beth Friedman et Pablo Blinder pour les commentaires sur le manuscrit.

1. Préparation pour la chirurgie i <ol><li> Nettoyer les outils chirurgicaux par sonication dans un mélange de lait et de chirurgie Maxizyme dans un nettoyeur à ultrasons. Autoclaver les instruments chirurgicaux avant chaque expérience. </li><li> Veiller à ce que tous les réactifs nécessaires et consommables sont disponibles. Une liste des réactifs et consommables est fourni dans le tableau 2. Réactifs et consommables qui entrent en contact avec les tissus exposés doivent être stériles, lorsque cela est possible. </li><li> Induire une anesthésie. Anesthésiques typiques appropriés pour les études de survie sont décrites dans le tableau 1. Veiller à ce plan chirurgical de l&#39;anesthésie en vérifiant l&#39;absence de réflexe pincement de l&#39;orteil. L&#39;âge optimal de la souris est de 3 à 6 semaines d&#39;âge. Les crânes de jeunes souris sont plus doux et plus difficiles à éclaircir. Les souris plus âgées sont plus épaisses crânes qui saignent plus au cours de la procédure d&#39;amincissement. </li><li> Fixer l&#39;animal dans un cadre stéréotaxique 1. Une liste de matériel chirurgical est fourni dans le tableau 2. </li><li> Maintenir température du corpsture à 37 ° C en utilisant une rétroaction sonde rectale et réglementé pad thermique. </li><li> Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux pour retenir l&#39;humidité. </li><li> Rasage du cuir chevelu avec un rasoir électrique petite. </li><li> Nettoyer le cuir chevelu avec Bétadine, suivie par pistonnage à 70% (v / v) d&#39;alcool isopropylique. </li><li> Si vous le souhaitez, vérifiez que la fréquence cardiaque et la respiration sont dans une fourchette normale en utilisant un oxymètre de pouls. Pour une souris, ces chiffres devraient se concentrer autour de 10 Hz et 2, respectivement. </li><li> Réchauffez une aliquote de filtration stérile de fluide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) à 37 ° C (125 mM NaCl, 10 mM de glucose, 10 mM d&#39;HEPES, 3,1 mM CaCl 2, 1,3 mM MgCl 2, pH 7,4) (tous les produits chimiques de Sigma) 2. </li></ol> 2. Montage d&#39;un Cadre Chef <ol><li> Retirez le cuir chevelu sur la surface du crâne dorsale ensemble avec une paire de pinces et de ciseaux chirurgicaux. Couper la peau latéralement aux bords des muscles temporelles de chaque côté du crâne et de posterior aux muscles du cou (fig. 1A). </li><li> Utilisation d&#39;une lame de scalpel pour enlever le périoste mince de la surface du crâne. </li><li> Nettoyez le crâne avec un coton-tige humide et séchez la surface du crâne avec un flux d&#39;air à partir d&#39;une poussière possible. Ensuite, appliquez une fine couche de colle cyanoacrylate à la surface du crâne entier. Laissez la colle sécher complètement. Cette couche de colle est nécessaire pour une bonne adhérence du ciment dentaire dans des étapes ultérieures. La colle cyanoacrylate n&#39;a pas besoin d&#39;être stérilisés. </li><li> Attacher un connecteur métallique sur la surface du crâne, l&#39;écart de la zone de la fenêtre souhaité. Pour les préparations anesthésiés, une petite noix peut être fixé sur le crâne avec un peu de colle cyanoacrylate, qui peuvent ensuite être vissée dans la configuration d&#39;imagerie à l&#39;aide d&#39;un boulon (Fig. 1B, 1L et 1N). Sceller l&#39;arrière de l&#39;écrou avec du ruban adhésif afin d&#39;assurer que la colle ne pénètre pas dans les discussions lors de la fixation sur le crâne. L&#39;écrou et la bande doivent être stérilisés<html> par autoclavage avant la chirurgie. </li><li> Pour les préparations d&#39;imagerie éveillés, fixez un connecteur plus rigide personnalisé avec deux points de fixation (Fig. 1M et 1N). Percez deux trous dans le crâne sur l&#39;hémisphère controlatéral corticale avec un ½ mm de forage bavure, puis introduire deux # 000 vis auto-taraudeuses. Ces vis aidera à ancrer la tête de monter sur le crâne. Appliquer un seul tour complet de la vis, afin d&#39;éviter l&#39;application de pression au cortex sous-jacent. Ensuite, fixez la barre de métal sur mesure croisée avec une petite goutte de colle cyanoacrylate sur le cervelet. Laissez la colle cyanoacrylate pour sécher complètement. Ce connecteur métallique réduit considérablement les degrés de liberté et simplifie la réinstallation de l&#39;Imagerie même dans les études longitudinales. Une barre transversale large donne amplement d&#39;espace pour le placement des électrodes et la stimulation de vibrisses. Des plans détaillés pour la génération de la monture de tête personnalisé et dispositif de fixation sont disponibles en ligne (SICS / liens.html &quot;&gt; http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). Les vis et la barre transversale doivent être stérilisés par autoclavage avant la chirurgie. </li><li> Couvrir toute la surface du crâne, à l&#39;exclusion de l&#39;emplacement de la fenêtre, d&#39;une couche de ciment dentaire (figure 1C et 1D). Veiller à ce que tous les bords exposés de la peau sont couverts par le ciment. Les composants du ciment dentaire n&#39;ont pas besoin d&#39;être stérilisés. </li></ol> 3. La nouvelle génération d&#39;un poli et renforcé Diluée-crâne (ports) Fenêtre <ol><li> Veiller à ce que les bavures de forage sont tranchants et éviter de les réutiliser. En utilisant une faible vitesse sur la fraise de dentiste, mince de 2 mm par 2 mm sur la région du cortex somato-sensoriel avec un ½ mm bavure. Alternez entre mouiller le crâne avec l&#39;ACSF, puis le séchage de la surface du crâne avec un léger courant d&#39;air à partir d&#39;un époussetage à gaz; humide pour le refroidissement, et au sec pour l&#39;éclaircissage. Ce doit être diluée à travers la couche spongieuse du crâne, qui peuvent saigner, mais peut être controlled par rinçage avec ACSF (Fig. 1E). Le crâne commence à fléchir sous la pression légère de la perceuse quand il est ~ 50 um, et les vaisseaux pie-mère doit être visible à travers l&#39;os par voie humide (Fig. 1F). A cette épaisseur, de petites taches blanches à l&#39;intérieur de l&#39;os devient visible pendant quelques secondes immédiatement après la surface du crâne sec est humidifié. </li><li> À ce stade, l&#39;os mince encore. Utilisez une vitesse plus lente de forage, c&#39;est-à 1000 tours par minute, qui rase la surface du crâne avec seulement une légère touche. Utilisation de petits mouvements contrôlés tout en maintenant la fraise comme un stylo et seulement appliquer une force dans la direction latérale. L&#39;os doit être ~ de 10 à 15 um à son épaisseur finale (Fig. 1G). Lorsque l&#39;os est suffisamment mince, les petites taches blanches dans l&#39;os ne sera plus visible lorsque la surface du crâne sec est humidifié. </li><li> Polir la zone de la fenêtre avec de la poudre d&#39;oxyde d&#39;étain. Fixer une mèche pré-mesure qui a été trempé dans l&#39;aquarium d&#39;étanchéité de silicone et avecétabli, en laissant un fouet conique (en médaillon, Fig. 1H). Le fouet en silicone doit être préparé au moins un jour avant la chirurgie, et stérilisés à l&#39;isopropanol à 70% avant de les utiliser. Placez une petite pincée de poudre sur la fenêtre avec une baisse de l&#39;ACSF (Fig. 1H). Agiter la suspension sur la fenêtre pour un maximum de dix minutes en effleurant du bout du fouet en mouvement à la surface du crâne. Évacuez la poudre d&#39;oxyde d&#39;étain fond de la fenêtre à l&#39;aide ACSF et sécher soigneusement l&#39;os avec un léger courant d&#39;air. Les irrégularités de surface et des fragments d&#39;os adhérentes laissés par forage dans les étapes précédentes doivent être enlevés après polissage (Fig. 1H et 1I). La poudre d&#39;oxyde d&#39;étain n&#39;a pas besoin d&#39;être stérilisé. </li><li> Couper des morceaux carrés de pas. 0 lamelle légèrement plus petit que la taille de la fenêtre. Utilisez un scribe pour marquer délicatement séparés lignes horizontales et verticales dans la lamelle à l&#39;aide d&#39;une règle droite. Ensuite, placez la lamelle dans une boîte de Pétri et knock le plat contre un bord de table pour séparer les morceaux de verre. Le plat de Petri toute peuvent ensuite être passés à l&#39;autoclave pour assurer la stérilité. </li><li> Placer une vitre de protection de taille appropriée à proximité de la fenêtre séchée. Appliquer une noisette de colle cyanoacrylate sur la fenêtre en utilisant la pointe d&#39;un applicateur de coton cassé bois pointe, et rapidement pousser la pièce prédécoupée de couvercle en verre au sommet de la colle. Éviter de créer des bulles en dessous de la vitre de protection. Poussez doucement le couvercle en verre contre la surface du crâne, et maintenez pendant quelques secondes (Fig. 1J et 1O). Laissez la colle sécher pendant 15 minutes. Excès de colle cyanoacrylate peut être enlevé de la surface supérieure de la vitre de protection avec une lame de scalpel après qu&#39;il a été séché. Sceller les bords de la vitre de protection avec un ciment dentaire et former une légèrement soulevée et à retenir l&#39;eau de la lentille d&#39;immersion (1K fig. et 1O). </li></ol> 4. Récupération <ol><li> Placez l&#39;animal dans un cabinet suivant cage chaud. Surveiller l&#39;animaux périodiquement jusqu&#39;à ce qu&#39;il récupère complètement de l&#39;anesthésie. </li><li> Si la préparation est destinée à survivre pendant plus d&#39;une journée, de fournir la buprénorphine (0,03 pg par les rongeurs g) pour l&#39;analgésie. En général, nous l&#39;image de l&#39;animal au moins un jour après l&#39;implantation initiale. </li></ol> 5. Préparation d&#39;imagerie <ol><li> Stabiliser l&#39;animal sur une planche à pain pour l&#39;imagerie optique, en utilisant le cadre comme un support de tête (Fig. 1L et 1M). Un appareil de retenue peut être fabriqué à partir de composants disponibles dans le commerce optomécaniques de Qioptiq ou Thorlabs. Notre plaque séparée peuvent être transportés entre les suites de chirurgie et d&#39;imagerie à deux photons avec l&#39;animal et tous les dispositifs de surveillance physiologique assemblés comme une seule unité 3. </li><li> Si imagerie débit sanguin est désiré, injecter 0,05 ml de 5% (p / v) fluorescente-dextrane colorant dissous dans une solution saline stérile soit par la veine de queue ou d&#39;une veine sous-orbitaire pour étiqueter le sang (fig. 2A à 2C et 2H sérum </strong&gt;) 4-7. Cela doit être fait sous anesthésie générale. L&#39;administration sous-orbitaire veine peut être plus facile pour les débutants, comme des solutions de dextrane sont plus visqueuses. La veine de la queue peut être difficile à localiser dans l&#39;obscurité des souris colorées, et la veine a tendance à s&#39;affaisser après une injection échoué. Pour l&#39;imagerie vasculaire avec le vert des émissions, utiliser un isothiocyanate de fluorescéine dextrane. Pour l&#39;émission, rouge, utiliser un Texas Red dextran. Grâce à la haute dextranes de poids moléculaire, le colorant resteront en circulation pendant plusieurs heures. En variante, les animaux avec des marqueurs fluorescents endogènes peut être imagée directement à la longueur d&#39;onde d&#39;excitation à deux photons appropriée. La solution de dextrane peuvent être congelés en aliquotes pour une utilisation future. </li><li> Nettoyez délicatement la surface de la fenêtre avec un coton-tige humide. </li><li> Pour l&#39;imagerie prolongée de préparations anesthésiés, injecter par voie intrapéritonéale solution stérile de Ringer lactate à l&#39;adresse d&#39;un volume de 3 uL par gramme toutes les 2 heures afin de maintenir les fluides corporels et les besoins en énergie. &lt;/ Li&gt; <li> Lorsque les animaux d&#39;imagerie dans l&#39;état de veille, de limiter l&#39;appuie-tête à seulement quelques heures à la fois de réduire les niveaux de stress. Retour à l&#39;animal de la cage entre les sessions d&#39;imagerie pour la nourriture et l&#39;eau. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Une fenêtre réussie permettra d&#39;imagerie des profondeurs allant jusqu&#39;à 250 um en dessous de la surface piale pendant plusieurs mois. Cette méthode a été utilisée pour étudier in vivo dans le flux sanguin capillaire 4, 8, activation de la microglie 8, 9, et la structure dendritique dans le cortex du parenchyme 8. Dans un exemple, nous utilisons l&#39;imagerie à deux photons pour montrer la vascularisation corticale d&#39;un anesthésié Thy1 jaune protéines (YFP) de la souris fluorescente, après le sérum sanguin est marqué par une injection intraveineuse de Texas Red dextran (Fig. 2A). Dural navires sont souvent visibles légèrement au-dessus de la surface corticale dans la dure-mère (Fig. 2C, flèche). Les grandes artérioles pie-mère et veinules lie sur la surface corticale (figure 2D). Pénétrant branche navires de ce réseau de surface et plongée dans le cortex où elles se ramifient en un lit dense capillaire qui nourrit le tissu cortical (Fig. 2E à 2H). Mandrins dendritiques de la YFP profonde exprimant neurones corticaux, une endogène à cette ligne de signal de la souris, peut être imagée simultanément dans un second canal 10 (Fig. 2B au 2H). Le signal de second harmonique de l&#39;os ont été recueillis dans un troisième canal, et peut être utilisé pour évaluer l&#39;épaisseur du crâne amincie après la collecte des piles d&#39;images (Fig. 2A à 2C). Corticales dynamique vasculaires sont profondément affectés par les anesthésiques 11. Dans un deuxième exemple, nous montrer une vidéo de vasoactivité spontanée recueillies par microscopie à deux photons d&#39;une souris habitués éveillé. Oscillations vasomoteurs éminents dans le diamètre de la lumière sont observés avec une artériole pial, mais pas avec une veinule voisin. Cettelarge base de vasoactivité est diminué avec 4 anesthésie à l&#39;uréthane. Pour quantifier les changements spontanés et évoqués dans le flux sanguin, nous utilisons adaptées ligne techniques de balayage pour capturer à la fois le diamètre vasculaire et rouge vitesse des globules de navires individuels. Des ressources détaillées sur l&#39;imagerie du flux sanguin quantitative à l&#39;aide microscopie à deux photons sont disponibles 3, 12. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig1.jpg" /> Figure 1. Procédure pour une fenêtre Ports. (A la maternelle à la) Images d&#39;étapes séquentielles dans la procédure pour générer une fenêtre Ports. Voir le texte pour obtenir des instructions détaillées. β = λ = bregma et lambda. (L) système de Boulon et écrou de fixation de la tête lors de l&#39;imagerie des préparations anesthésiées. (M) usinés croix de montage tête de barre pour les préparations éveillés. Dans cet exemple, un connecteur a également été implanté pour les enregistrements électrocorticogramme répétées. (N)Schéma montrant une vue dorsale de la monture de tête et la position des différentes composantes. L&#39;écrou utilisé dans L panneau est conçu comme alternative à la barre transversale à l&#39;aide dans le panneau de M. Deux # 000 vis auto-taraudeuses sont ajoutés à la barre transversale de montage pour plus de stabilité avec des préparations d&#39;imagerie éveillés. Schéma (O) montrant la section transversale d&#39;un fenêtre Ports. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3742/3742fig2.jpg" /> Figure 2. L&#39;imagerie à deux photons de la structure vasculaire et neuronale dans le cortex de la souris. Toutes les images ont été recueillies à travers une fenêtre de ports dans une souris Thy1-YFP moins 2 jours après implantation 10 fenêtre. Projection maximale de plus de 150 um de tissu dans l&#39;orientation coronale affichant le crâne amincie par rapport à la vascularisation (A) et les dendrites (B). L&#39;os (bleu) a été détectée par la collecte de la fluorescence de seconde harmonique à 450 nm d&#39;émission de 900 nm d&#39;excitation <sup&gt; 8. La vascularisation (rouge) a été marqué par injection intraveineuse de 70 kDa Texas Red dextran 6. Les champs dendritiques des neurones (vert) sont endogènes à la ligne Thy1-YFP souris transgénique. (CH) des projections maximales de plus de 50 um de tissus dans l&#39;orientation horizontale à différentes profondeurs en dessous de la pie-mère. Les données proviennent de la pile même image montre dans les panneaux A et B. navires Dural peut être visible juste au-dessus de la surface corticale (flèche C). Abréviations ACSF = artificielle liquide céphalo-rachidien PORTS = fenêtre poli et armé du crâne amincie YFP = protéine fluorescente jaune i Veiller à ce que les procédures décrites sont approuvés par votre soin des animaux locale institutionnel et l&#39;utilisation Comité.

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Rien de divulguer.

Imagerie biphotonique à travers une fenêtre ports exige la transmission à travers l&#39;os aminci et la dure-mère, ce qui atténue la lumière laser et ajoute des aberrations optiques à plus grande profondeur 8. Cependant, malgré cet inconvénient, les profondeurs d&#39;imagerie jusqu&#39;à 250 um en dessous de la surface piale peut être atteint avec 900 nm d&#39;excitation. Des profondeurs d&#39;imagerie plus élevés peuvent en principe être possible avec des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation p...

<table border="1"><tbody><tr><td> Agent </td><td> Route de la livraison </td><td> Dose pour la souris </td><td> Durée </td><td> Remarques </td><td> Source </td><td> Ref Ref </td></tr><tr><td> Pentobarbital (Nembutal) </td><td> IP </td><td> 90 pg / g </td><td> 15-60 min </td><td> Marge de sécurité étroite. Travailler jusqu&#39;à la dose appropriée de l&#39;anesthésie lentement. Supplément de 10% de la dose d&#39;induction selon les besoins. </td><td> 036093; Butler Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> La kétamine (Ketaset) mélangé avec xylazine (Anased) </td><td> IP </td><td> 60 pg / g (K) 10 pg / g (X) (mélange dans une même seringue) </td><td> 20-30 min </td><td> Xylazine est co-injecté comme relaxant musculaire et analgésique. Supplément que kétamine à 50% de la dose d&#39;induction selon les besoins. </td><td> (K) 010177, (X) 033 198; Butler Schein </td><td> 7 </td></tr><tr><td> L&#39;isoflurane (Isothesia) </td><td> Inhalation </td><td> 4% de la concentration moyenne alvéolaire (MAC) pour l&#39;induction, 1-2% de la MAC pour l&#39;entretien </td><td> 4-6 h. </td><td> À condition en mélange de l&#39;oxygène 70% et 30% de protoxyde d&#39;azote. L&#39;anesthésie prolongée conduit à ralentir la récupération. </td><td> 029403; Butler Schein </td><td> 26 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Suggérée agents anesthésiques pour les études de survie. <table border="1"><tbody><tr><td> ARTICLE </td><td> SOCIÉTÉ </td><td><strong&gt; CATALOGUE # / MODÈLE </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Butler Schein </td><td> 6906950 </td></tr><tr><td> La buprénorphine (Buprenex) </td><td> Butler Schein </td><td> 031919 </td></tr><tr><td> Fluorescéine isothiocyanate dextrane, 2 MDa poids moléculaire </td><td> Sigma </td><td> FD2000S </td></tr><tr><td> L&#39;alcool isopropylique </td><td> Pêcheur </td><td> AC42383-0010 </td></tr><tr><td> Solution de lactate de Ringer </td><td> Butler Schein </td><td> 009846; </td></tr><tr><td> Lidocaïne, 2% (v / v) </td><td> Butler Schein </td><td> 002468 </td></tr><tr><td> Saline </td><td> Butler Schein </td><td> 009861 </td></tr><tr><td> Lait chirurgicale </td><td> Butler Schein </td><td&gt; 014325 </td></tr><tr><td> Rouge Texas dextrane, 70 kDa de poids moléculaire </td><td> Invitrogen </td><td> D1864 </td></tr><tr><td> Maxizyme </td><td> Butler Schein </td><td> 035646 </td></tr><tr><td> DISPOSABLES </td></tr><tr><td> Carbide bavures, taille de la pointe 1/2 mm </td><td> Outils belle science </td><td> 19007-05 </td></tr><tr><td> Applicateurs pointe pigé </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-400-100 </td></tr><tr><td> Couvercle en verre, pas. 0 épaisseur </td><td> Thomas scientifique </td><td> 6661B40 </td></tr><tr><td> La colle cyanoacrylate </td><td> Industries ND </td><td> 31428 H04308 </td></tr><tr><td> Époussetage à gaz </td><td> Newegg </td><td> N82E16848043429 </td></tr><tr><td> Poudre de ciment Grip </td><td> Dentsply </td><td> 675571 </td></tr><tr><td> Ciment Grip solvant </td><td> Dentsply </td><td> 675572 </td></tr><tr><td> Seringue à insuline, 0,3 ml de volume avec 29,5 aiguille de la jauge </td><td> Butler Schein </td><td> 018384 </td></tr><tr><td> D&#39;écrous et de boulons pour fixer la tête </td><td> Digikey </td><td> Nut, H723-ND; boulon, R2-56X1/4-ND </td></tr><tr><td> Pommade ophtalmique </td><td> Butler Schein </td><td> 039886 </td></tr><tr><td> Lames de bistouri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-460-448 </td></tr><tr><td> Vis, autotaraudante # 000 </td><td> JI Morris Company </td><td> FF000CE125 </td></tr><tr><td> Silicone aquarium d&#39;étanchéité </td><td> Perfecto Fabrication </td><td> 31001 </td></tr><tr><td> Poudre d&#39;oxyde d&#39;étain </td><td> Maman Minerals </td><td> EQT-TINOX </td></tr><tr><td> ÉQUIPEMENT </td></tr><tr><td> Scribe de verre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-675 </td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td> Carl Zeiss </td><td> OPMI-1 FC </td></tr><tr><td> Perceuse électrique alimenté </td><td> Foredom ou Osada </td><td> K.1020 (Foredom) ou EXL-M40 (Osada) </td></tr><tr><td> Rasoir électrique </td><td> Wahl </td><td> Série 8900 </td></tr><tr><td> Forceps, Dumont ne. 55 </td><td> Outils belle science </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Coussin chauffant Commentaires réglementé </td><td> FHC </td><td> 40-90-8 (thermistor rectal, 40-90-5D-02; hmanger pad, 40-90-2-07) </td></tr><tr><td> Vaporisateur isoflurane </td><td> Ohmeda </td><td> IsoTec4 </td></tr><tr><td> Oxymètre de pouls </td><td> Starr Sciences de la Vie </td><td> MouseOx </td></tr><tr><td> Tournevis, miniature </td><td> Garret Wade </td><td> 26B09.01 </td></tr><tr><td> Cadre stéréotaxique </td><td> Kopf Instruments </td><td> Modèle 900 (avec masque d&#39;anesthésie de la souris et les non-rupture barres d&#39;oreilles) </td></tr><tr><td> Ciseaux chirurgicaux, extrémité émoussée </td><td> Outils belle science </td><td> 14078-10 </td></tr><tr><td> Nettoyeur à ultrasons </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15-335-30 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Liste des réactifs spécifiques, consommables et équipements.

a polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain

L&#39;imagerie in vivo de la fonction corticale nécessite un accès optique au cerveau sans interruption de l&#39;environnement intracrânienne. Nous présentons une méthode pour former un crâne poli et armé amincie (ports) fenêtre dans le crâne de la souris qui s&#39;étend sur plusieurs millimètres de diamètre et est stable depuis des mois. Le crâne est amincie à 10 à 15 um d&#39;épaisseur avec une perceuse à main pour réaliser une clarté optique, et est ensuite recouverte d&#39;une colle cyanoacrylate et une vitre de protection à: 1) fournir une rigidité, 2) inhiber la repousse osseuse et 3) réduire la diffusion de la lumière des irrégularités sur la surface osseuse. Depuis le crâne n&#39;est pas violé, une inflammation qui pourrait affecter le processus de l&#39;étude est considérablement réduit. Des profondeurs d&#39;imagerie allant jusqu&#39;à 250 um en dessous de la surface corticale peut être réalisé en utilisant la microscopie biphotonique à balayage laser. Cette fenêtre est bien adapté pour étudier le débit sanguin cérébral et la fonction cellulaire dans les préparations à la fois anesthésiés et éveillés. Il offre en outre l&#39;opportunity de manipuler l&#39;activité des cellules à l&#39;aide optogénétique ou d&#39;interrompre le flux sanguin dans les vaisseaux ciblés par irradiation de la circulation photosensibilisants.

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A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

Nous présentons une méthode pour former une fenêtre d&#39;imagerie dans le crâne de la souris qui s&#39;étend millimètres et est stable pendant des mois sans inflammation du cerveau. Cette méthode est bien adaptée pour les études longitudinales de la circulation sanguine, la dynamique cellulaire et cellulaire / structure vasculaire en utilisant la microscopie à deux photons.

Une poli et renforcé Diluée-crâne fenêtre for Long-term imagerie du cerveau de souris

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

a-polished-reinforced-thinned-skull-window-for-long-term-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.7K vues.  University of California, San Diego. Nous présentons une méthode pour former une fenêtre d'imagerie dans le crâne de la souris qui s'étend millimètres et est stable pendant des mois sans inflammation du cerveau. Cette méthode est bien adaptée pour les études longitudinales de la circulation sanguine, la dynamique cellulaire et cellulaire / structure vasculaire en utilisant la microscopie à deux photons.

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Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imagerie chronique des souris cortex visuel en utilisant une préparation Diluée-crâne

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Recherche

Neurosciences

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, inflammatory and metabolic conditions, using in vivo fluorescence microscopy. A closed cranial window is placed over the left parieto-occipital cortex of the mice. Local microcirculation is recorded in real time through the window using epi and fluorescence illumination, and measurements of vessels diameters and red blood cell (RBC) velocities are performed. RBC velocity is measured using real-time cross-correlation and/or fluorescent-labeled erythrocytes. Leukocyte and platelet adherence to pial vessels and assessment of perfusion and vascular leakage are made with the help of fluorescence-labeled markers such as Albumin-FITC and anti-CD45-TxR antibodies. Microcirculation can be repeatedly video-recorded over several days. We used for the first time the close window brain intravital microscopy to study the pial microcirculation to follow dynamic changes during the course of Plasmodium berghei ANKA infection in mice and show that expression of CM is associated with microcirculatory dysfunctions characterized by vasoconstriction, profound decrease in blood flow and eventually vascular collapse.

Intravital microscopy to follow temporal and spatial hemodynamic and inflammatory events in the pial microcirculation.

Microscopie intravitale de la microcirculation cérébrale souris en utilisant une fenêtre fermée crânienne

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Mouse Imaging neuroanatomiques par résonance magnétique

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Formation extinction pendant la fenêtre Reconsolidation empêche la récupération de la peur

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Un indicateur moléculaire de l&#39;adaptation à long terme olfactive dans<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluée-skull Technique fenêtre corticale pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Tomographie par cohérence optique d&#39;imagerie

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

Amélioration de la préparation et la conservation de l&#39;hippocampe Tranches de souris pour un enregistrement très stable et reproductible de potentialisation à long terme

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Deux-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambres agarose à long terme de l&#39;imagerie calcique<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...