Merci à Willy Sun pour l&#39;assistance technique et le Dr Kris Gellynck pour leurs commentaires utiles et trois relecteurs anonymes pour leurs conseils constructifs. Ce travail a été financé par l&#39;Initiative de régénération d&#39;audience Sunnybrook

Tissu souris a été récolté à partir de Sox2 EGFP -reporter souris 12 maintenus et euthanasiés conformément aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux sur pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 1. La culture embryonnaire cochlées <ol><li> Supplément milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) en mélangeant 8,89 ml de DMEM, 1 ml de sérum bovin fœtal (FBS), 100 ul de 100x supplément N2, et 10 pi de 10 mg / ml de la ciprofloxacine. Supplément solution saline équilibrée de Hank (HBSS) en mélangeant 495 ml de HBSS avec 5 ml de HEPES 100%. </li><li> Préparer des boîtes de culture de fond de verre: <ol><li> Dans une hotte à flux laminaire, la remise en suspension de 200 ul de substrat sous-sol extrait de membrane dans 5 ml de DMEM. Préparer 35 mm verre de diamètre des boîtes de culture de 10 mm avec fond des puits. Pipette 150 ul substrat / DMEM dans le centre de chaque fond de verre plat. Ces plats peuvent être utilisés après 40 minutes d&#39;incubation, ou peuvent stockée dans un CO 2 </sub&gt; Incubateur à 35 ° C pendant au moins une semaine. REMARQUE: à fond de verre plats sont utilisés pour les raisons suivantes: veiller à ce que le fond du plat est transparent et adapté pour l&#39;imagerie, pour créer un puits au centre de l&#39;assiette qui permet de régler les explants dans une zone facilement localisé et enfin de sorte que, après une expérience de l&#39;échantillon peut être traité pour une analyse ultérieure et immunocoloration. </li></ol></li><li> Préparer le poste de travail et outils: <ol><li> Tournez sur le banc de nettoyage à écoulement laminaire, et arroser avec EtOH à 70% pour créer un espace de travail propre. Faire tremper pinces, cuillères, et un 184 plat en élastomère de silicone noir (un mélange de 184 élastomère de silicone (10 parties), l&#39;agent (1 partie) et de la poudre de charbon de bois (2,5 g) de durcissement) dans EtOH à 70%. </li></ol></li><li> Dans le poste de travail propre, les embryons de récolte pour l&#39;expérience. Recueillir des embryons de la gestation approprié dans la glace HBSS froid additionné de 1% HEPES. <ol><li> Déterminer un organe externe ou visible qui démontreral&#39;activité du rapporteur et examiner les embryons en utilisant un microscope stéréoscopique fluorescent. Recueillir les embryons qui présentent une activité de journaliste dans la glace HBSS froid additionné de 1% HEPES que ceux-ci font l&#39;objet de l&#39;expérience. </li></ol></li><li> Recueillir os temporaux: <ol><li> En travaillant rapidement, à l&#39;aide d&#39;une source de lumière froide et une pince fine, recueillir les têtes des petits. Prenez soin de couper au niveau des vertèbres cervicales et en dessous de la mâchoire pour éviter d&#39;endommager l&#39;os temporal. </li><li> Ouvrez soigneusement le crâne. Retirez le cerveau, coupez le devant de la tête, et de transférer le crâne postérieur à glace fraîche HBSS froid additionné de 1% HEPES dans un plat propre. Disséquer soigneusement les arachides os temporaux en forme en prenant soin de garder le système vestibulaire de tact. </li></ol></li><li> Disséquer la cochlée: <ol><li> Transférer les os temporaux dans un plat recouvert d&#39;élastomère de silicone noir dans la glace HBSS froid additionné de 1% HEPES, la broche de la région vestibulaire de l&#39;os. Insérer les broches d&#39;insectes àun angle oblique afin de stabiliser l&#39;os temporal et créer un espace pour la pince. Épingler est une étape cruciale dans le processus comme si l&#39;os temporal est autorisé à se déplacer trop, il est très difficile de récolter une cochlée intacte. </li><li> Retirez délicatement le cartilage entourant la cochlée. Insérer une dent de la pince dans le cartilage sur le bord extérieur de la base de la cochlée et découper un trou dans le cartilage. </li><li> Attachez un rabat sur le côté, insérer la dent de la pince et se séparer en douceur le toit de la gaine du cartilage. Couper horizontalement sur le dessus et en diagonale, et soulevez délicatement la partie avant de la capsule. Insérez un volet de la pince entre le cartilage restant et le conduit et le clip doucement la dernière section. La surface apicale de la cochlée est maintenant exposé. </li><li> À partir de la base, attraper la zone où le toit de la conduite répond l&#39;épithélium cochléaire et ouvrir le canal cochléaire. Retirez délicatement le toit, le paragelorsque cela est nécessaire jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit complètement retiré. Coupez les portions de membrane à gauche sur la face interne de la conduite. Faire ramoner le conduit de tissu mésenchymateux excès et détacher la conduite du système vestibulaire. </li></ol></li><li> Culture: les explants <ol><li> Passer une explantation, surface luminale place, dans le centre d&#39;un verre recouvert boîte de culture bas de substrat, soigneusement prélever tout le liquide et laisser reposer pendant deux minutes. Ajouter 150 ul complétée DMEM goutte à goutte à l&#39;expiant, en prenant soin de ne pas déranger. Si l&#39;expiant flotter librement, repositionner avec une pince, mais veiller à ce que l&#39;explantation se dépose au fond de la boîte de sorte qu&#39;il peut se brancher sur le substrat. </li><li> Placez les plats à fond de verre dans un 12 cm de diamètre plat de Pétri de profondeur, avec un petit plat d&#39;eau stérile pour maintenir l&#39;humidité. Mettre les cultures dans un incubateur à 35 ° pendant une nuit pour que l&#39;expiant pour fixer au substrat et l&#39;aplatir. </li></ol></li></ol> 2. direct ImagING <ol><li> Sélectionnez échantillons explants. Utilisation d&#39;un microscope stéréoscopique fluorescent pour évaluer l&#39;état de chaque cochlée explantée. Sélectionner uniquement explants où le canal est intact et attaché au verre à partir de la base au sommet. </li><li> Régler l&#39;incubateur à 35 ° C avec 5% de CO 2 à la culture de tissus cochléaire. Mettez les cultures dans le microscope de l&#39;incubateur: <ol><li> Aspirer doucement le DMEM supplémenté et remplacer avec au moins 500 pi de milieu frais. Pour l&#39;imagerie jusqu&#39;à 6 jours, de 1-1,5 ml est mieux. Dans les cas où explants sont mal fixés, une pipette un anneau de médias autour du bord du plat. Ce liquide supplémentaire fera une &quot;chambre humide&quot; miniature sans perturber l&#39;expiant alors qu&#39;il continue à attacher à la matrice. <ol><li> Vous pouvez aussi utiliser articulé plat couvre pour ouvrir les couvercles alors que le plat reste dans sa mise en place dans le microscope si les réactifs doivent être échangés pendant les intervalles entre les collections d&#39;images. Couvercles plat charnières permettent aux couvercles d&#39;êtreouvert sans déranger les échantillons ou de retirer les plats de leurs paramètres. Cela permet de maintenir leur position exacte des captures d&#39;images suivantes. </li></ol></li><li> Insérez les plats en verre fond contenant des échantillons appropriés dans le support de plat de l&#39;échantillon. Le microscope dans cet exemple a une plate-forme rotative qui contient huit plats de 35 mm de l&#39;échantillon. </li><li> Sous la hotte à flux laminaire remplacer les couvercles en plastique avec couvercles en verre et insérer les plats dans le support de plat de l&#39;échantillon. Placez le support de plat de l&#39;échantillon à l&#39;intérieur de l&#39;incubateur en prenant soin de ne pas déloger les explants du fond du plat ou de perturber les médias. </li></ol></li><li> Mettre en place la routine d&#39;imagerie: <ol><li> Allumez le microscope, lampe UV et l&#39;appareil, ouvrez le logiciel d&#39;imagerie. </li><li> Repérez les échantillons, choisir une zone d&#39;imagerie, plan de mise au point et ajuster les temps d&#39;exposition pour chaque plat en séquence. Choisir le plan de mise au point en fonction non seulement de la vue de l&#39;explant au moment du démarrage, mais alen gardant à l&#39;esprit la façon dont le tissu se déplace et combien de temps le cours du temps sera exécuté. </li><li> Définir une pile Z de centrage dans le plan focal sélectionné dans le canal de fluorescence. Réglez la fréquence et la durée de l&#39;échantillonnage pour l&#39;expérience. La fréquence d&#39;échantillonnage est limitée par le temps qu&#39;il faut pour recueillir des images, ce qui devrait être déterminée après la sélection de champs de vision et la fixation d&#39;un empilement de Z. Dans ce cas, le prélèvement est effectué toutes les 30 min pendant cinq jours. La durée de l&#39;expérience peut aller jusqu&#39;à 14 jours. </li></ol></li><li> Générer un film: <ol><li> A la fin de la période de laps de temps d&#39;ouvrir les fichiers d&#39;image. Dans ce cas, le logiciel Metamorph qui ouvre des points de collecte séquentielles est utilisé. Image par image choisir le meilleur plan focal pour montrer la population cellulaire d&#39;intérêt. </li><li> Convertir ces images dans un fichier .avi, ou les exporter sous forme d&#39;un montage pour produire un ensemble d&#39;images qui peuvent être ouverts et analysés dans le logiciel de traitement d&#39;image ou convertis en forma multiplets en utilisant un logiciel de traitement vidéo. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development.">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li><li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auditory+sensory+epithelium:+the+instrument+of+sound+perception.">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li><li>Van de Water, T., Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+inner+ear+in+organ+culture.">Growth of the inner ear in organ culture.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).</li><li>Jacques, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+function+for+canonical+Wnt/beta-catenin+signaling+in+the+developing+mammalian+cochlea.">A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea.</a> Development. 139, 4395-4404 (2012).</li><li>Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+field+laser+confocal+microscopy+for+enhanced+spatial+and+temporal+resolution+in+live-cell+imaging.+Microscopy+and+microanalysis+:+the+official+journal+of+Microscopy.">Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy.</a> Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+increases+fibroblast+growth+factor+receptor+expression+and+disrupts+cell+mechanics+in+the+developing+organ+of+corti.">Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti.</a> BMC developmental biology. 13, 6 (2013).</li><li>Appler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring.">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li><li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry.">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li><li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly(dimethylsiloxane)+microwells+and+time-lapse+imaging.">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li><li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro.">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

Les auteurs ont rien à divulguer.

Il ya plusieurs points techniques à prendre en compte lorsque les cultures sont établies et à mettre en place le microscope time-lapse pour que l&#39;imagerie à long terme. Nous utilisons sous-sol matrice de la membrane comme substrat pour la culture des explants cochléaires, mais le substrat doit être adapté au type de cellule. Par exemple, à l&#39;image des cultures de neurones, il peut être préférable de fournir un revêtement de fibronectine. La température d&#39;incubation e...

La cochlée des mammifères est un organe complexe très ordonnée. Chez la souris, entre l&#39;émergence de l&#39;oreille interne primitif de la vésicule otique le jour E11 et l&#39;achèvement du programme de développement à des stades postnatales, de multiples vagues de signalisation cellulaire et des changements coordonnés dans l&#39;expression génique ont lieu. Exécution de la base au sommet de la cochlée est la détection épithélium sensoriel, ou organe de Corti son. Développement de l&#39;organe de Corti est superbement contrôlé de telle sorte que d&#39;ici la fin du développement, il sera composé d&#39;une seule rangée de cellules ciliées internes, trois rangées de cellules ciliées externes entrecoupées de cinq rangées de cellules de soutien (deux rangées de cellules de pilier, trois des rangées de cellules de Deiters 1). Déviation de cette précises résultats d&#39;ordre dans la perte d&#39;audition, heighlighting l&#39;importance de studye DELA genèse et la structuration de la epithemlium sensorielle 2. Dans la culture in vitro de l&#39;embryon de souris cochLea est un outil essentiel dans l&#39;étude des mécanismes de développement de l&#39;organe de Corti. Cette technique a été créé en 1974 et au cours des 40 dernières années, a été utilisé pour élucider bon nombre des mécanismes par lesquels l&#39;épithélium sensoriel est spécifié et l&#39;organe de Corti établi 3. La cochlée est un organe complexe avec les processus dynamiques de développement; une manipulation peut prendre aussi longtemps que sept jours pour manifester 1. Par exemple, lors de l&#39;ajout d&#39;inhibiteurs de GSK 3β à une culture d&#39;explant cochléaire à E13, la période d&#39;incubation optimal pour observer un effet robuste du composé 4 est de six jours. Imagerie en temps réel de la cochlée développement permet l&#39;étude des changements dans la morphologie de l&#39;organe de Corti, les changements dans l&#39;expression des gènes, le suivi de migration, prolifération ou mourants cellules, et il permet d&#39;observer en temps réel les résultats des agents pharmaceutiques et la perturbation de la signalisation voies. Jusqu&#39;à présent, vivre l&#39;imagerie de la cochléea principalement été effectués en utilisant la microscopie confocale à l&#39;image de petites zones de l&#39;organe de Corti sur des périodes courtes 5-8, mais cette technique a des limites dues à la viabilité explant. Dans l&#39;imagerie des effets de manipulations à long terme sur les processus de développement lent, le milieu de formation d&#39;image est cruciale. Typiquement, un système d&#39;imagerie confocale en direct utilise une boîte en plastique humidifié qui se trouve sur le microscope. La chaleur et l&#39;humidité peuvent échapper à travers les lacunes dans la boîte incubation où il rencontre la table de microscope, à travers les fenêtres d&#39;accès, à travers les ouvertures à charnières et à travers les interstices autour des différentes parties de la microscope- comme la source de lumière ou objectif. Ce ne sont pas optimales pour le maintien en bonne santé explants pendant plus de deux ou trois jours. Nous définissons «incubateur microscope» comme un microscope inversé scellé à l&#39;intérieur d&#39;une norme incubateur à CO2, plutôt que d&#39;un incubateur construit autour du microscope. Un ex incubateur de microscopetend la vie de l&#39;expérience, de telle sorte que, plutôt que l&#39;imagerie sur deux ou trois jours, les échantillons peuvent être imagés par un maximum de deux semaines. Un microscope incubateur offre un excellent environnement pour la croissance et la différenciation cellulaire, avec une perturbation minimale de explantation des cultures et des conditions standard contrôlée. Dans les études qui se déroulent sur plusieurs jours, il est courant de recourir à des échantillons d&#39;imagerie sur une base quotidienne en les retirant de l&#39;incubateur et les portant à un microscope à fluorescence inversé. Bien que cette approche peut travailler, de sortir la vaisselle de l&#39;incubateur inflige une tension sur le tissu développement sensible. Les variations de l&#39;acidité du milieu de culture et les fluctuations de température dues à l&#39;enlèvement de l&#39;incubateur peuvent se traduire par le développement et des tissus sous-optimale malsain. L&#39;imagerie de la même région au même plan focal et dans la même orientation à chaque point de temps est extrêmement difficile. En utilisant un système automatisé à l&#39;intérieur d&#39;un incubateur, il est possible de maintenir en bonne santétissu, de recueillir des images à plusieurs points dans le temps et à veiller à ce que la même zone est capturée dans chaque image. Au cours des dernières années, plusieurs incubateurs de tissus au microscope intégrés ont été développés, ceux-ci ont été utiles non seulement dans la pratique clinique 9 mais aussi sur les cellules souches et le cancer recherche 10,11. Nous présentons ici un protocole d&#39;imagerie en temps réel à long terme de embryonnaires explants cochléaires de la souris. On utilise un système de microscopie automatisée à l&#39;intérieur d&#39;un incubateur à CO 2 standard qui est capable de capturer des images de plusieurs échantillons à des instants de consigne. Le système se compose d&#39;un microscope inversé posée dans un incubateur. Les échantillons sont placés dans une estrade tournante qui permet l&#39;imagerie d&#39;échantillons multiples à chaque point de temps. Illumination, capture d&#39;images, et la rotation de l&#39;estrade sont contrôlés par un système automatisé exploité par le logiciel Metamorph. En définissant une routine d&#39;imagerie utilisant le logiciel d&#39;exploitation, nous pouvons définir une expérience à fonctionner jusqu&#39;à two semaines avec une intervention humaine minimale. Dans cet exemple, nous utilisons deux champs lumineux et fluorescence d&#39;afficher une croissance à grande échelle et le réarrangement de la cochlée, et plus précisément, la région prosensory. Dans cette expérience, cochlée sera disséqué de souris rapporteurs Sox2 EGFP le jour embryonnaire E13. Cultures in vitro sera établi et imagé sur cinq jours.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane extract&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. 
			http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5630080</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170161</td>
			<td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. 
			http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&#38;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Size number 5 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&#38;CategoryId=29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curette&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10080-05</td>
			<td>size 1 mm&#160; 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&#38;CategoryId=118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-35</td>
			<td>Must be stainless Steel 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mm plastic dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>charcoal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05105-250G</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>184 silicone elastomer</td>
			<td>Dow/Corning&#160;</td>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>Dishes are home made several weeks in advance.&#160; Silicone elastomer can be from any supplier.<a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291">http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&#160; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. 
			http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&#38;cPath= 1_4_15&#38;products_id=2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>495101-9804-000</td>
			<td>&#160;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Light Source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-182</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Contact Leica microsystems</td>
			<td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Microscope +imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Contact Olympus</td>
			<td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. 
			http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&#38;c=0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51029701</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3310</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026651</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

Nous présentons ici une méthode à long terme imagerie time-lapse de direct embryonnaires explants cochléaires de la souris. Le programme de développement responsable de la construction de la très ordonnée, la structure complexe de la cochlée des mammifères produit une dizaine de jours. Afin d&#39;étudier les changements dans l&#39;expression des gènes au cours de cette période et leur réponse aux pharmaceutique ou manipulation génétique, l&#39;imagerie à long terme est nécessaire. Auparavant, l&#39;imagerie en temps réel a généralement été limitée par la viabilité des tissus expiantes dans une chambre humidifiée au sommet d&#39;un microscope standard. La difficulté dans le maintien des conditions optimales pour la croissance de la culture en ce qui concerne l&#39;humidité et la température a placé les limites de la longueur d&#39;expériences d&#39;imagerie. Un microscope intégré dans un incubateur de culture tissulaire modifié fournit un excellent environnement pour imagerie longue durée en direct. Dans cette méthode, nous démontrons comment établir explants cochléaires embryonnaires de souris et comment utiliser un microscope incubateur de mener laps de temps Imaging utilisant à la fois champ lumineux et la microscopie à fluorescence pour examiner le comportement d&#39;une journée typique embryonnaire (E) 13 explant cochléaire et Sox2, un marqueur des cellules prosensory de la cochlée, sur 5 jours.

Ici, nous montrons un montage (figure 1) et un film (Figure 2) montrant comment un explant cochléaire organotypique typique va croître si plaqué sur E13.5. Un journaliste souris Sox2 a été utilisé pour visualiser la région prosensory. Le film montre que la cochlée est soumis à une croissance et à la convergence et l&#39;extension, les cellules dans la région latérale du domaine de Sox2 vert ne semblent pas se diviser le tissu environnant comme il se dilate....

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants at JoVE.com

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Imagerie en temps réel de la cochlée des mammifères embryonnaire est difficile parce que les processus de développement de la main fonctionnent sur un gradient temporel de plus de dix jours. Nous présentons ici une méthode pour la culture et l&#39;imagerie des tissus embryonnaires des explants cochléaire pris d&#39;une souris rapporteur fluorescent sur cinq jours.

À long terme Accéléré imagerie de souris cochléaires explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

long-term-time-lapse-imaging-of-mouse-cochlear-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K vues.  Sunnybrook Research Institute.  Imagerie en temps réel de la cochlée des mammifères embryonnaire est difficile parce que les processus de développement de la main fonctionnent sur un gradient temporel de plus de dix jours. Nous présentons ici une méthode pour la culture et l'imagerie des tissus embryonnaires des explants cochléaire pris d'une souris rapporteur fluorescent sur cinq jours. 

Vidéo: Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Mouse Imaging neuroanatomiques par résonance magnétique

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Recherche

Neurosciences

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Une poli et renforcé Diluée-crâne fenêtre for Long-term imagerie du cerveau de souris

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur souris adultes

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Moteur section du nerf et imagerie time-lapse de comportements de cellules gliales chez le poisson zèbre en direct

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo postnatale électroporation et imagerie time-lapse de neuroblaste migrations dans Souris aiguë tranches du cerveau

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambres agarose à long terme de l&#39;imagerie calcique<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

L&#39;imagerie confocale temporelle des neurones migrateurs dans la culture de tranches organotypiques du cerveau embryonnaire de souris en utilisant<em&gt; Dans Utero</em&gt; Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

À long terme conflit sensoriel en comportement librement souris

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of the mouse neuroretina&#160;with intact retinal pigment epithelium (RPE). Depending on the research question, retinas can be isolated from wild-type animals or from disease models, to study, for instance, diabetic retinopathy or hereditary retinal degeneration. Eyes from early postnatal day 2&#8211;9 animals are enucleated under aseptic conditions. They are partially digested in proteinase K to allow for a detachment of the choroid from the RPE. Under the stereoscope, a small incision is made in the cornea creating two edges from where the choroid and sclera can be gently peeled off from the RPE and neuroretina. The lens is then removed, and the eyecup is cut in four points to give it a four-wedged shape resembling a clover leaf. The tissue is finally transferred in a hanging drop into a cell culture insert holding a polycarbonate culturing membrane. The cultures are then maintained in R16 medium, without serum or antibiotics, under entirely defined conditions, with a medium change every second day.
The procedure described enables the isolation of the retina and the preservation of its normal physiological and histotypic context for culturing periods of at least 2 weeks. These features make organotypic retinal explant cultures an excellent model with high predictive value, for studies into retinal development, disease mechanisms, and electrophysiology, while also enabling pharmacological screening.

The protocol describes organotypic explants of mouse neuroretina, cultivated together with its retinal pigment epithelium (RPE), in R16 defined medium, free of serum and antibiotics. This method is relatively simple to perform, less expensive, and time-consuming when compared to in vivo experiments, and can be adapted to numerous experimental applications.

Culture à long terme et sans sérum d’explants organotypiques de la rétine de souris avec un épithélium pigmentaire rétinien intact

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...