Ce travail a été financé par des subventions du Conseil de recherches en génie du Canada (CRSNG) en sciences naturelles et de la Fondation canadienne pour l&#39;innovation (FCI), pour DWA.

Une. Préparation et dissection <ol><li> Préparer le plat de dissection bordée de Sylgard. Enregistrement chambres de WPI (Sarasota, Floride, États-Unis, les fournisseurs sont énumérés dans le tableau 2) sont utilisés comme disséquer plats (figure 1). Les chambres sont conçues pour accueillir des lames de verre et de petites rondelles de plastique sont utilisés comme moules pour le Sylgard. Les rondelles sont d&#39;abord fixées sur la lame avec la graisse et Sylgard liquide est ajouté à l&#39;axe de la rondelle. Le Sylgard va guérir du jour au lendemain et comme il le fait, il forme un petit lit circulaire sur la lame de verre, qui devient la base de la boîte de dissection. La lame est placée dans la chambre d&#39;enregistrement et sert de base de la chambre dans laquelle la préparation est fixée (figure 1). </li><li> Préparer les solutions énumérées dans le tableau 3. Solutions extracellulaires doivent être laissées à la température ambiante alors que les solutions intracellulaires doivent être conservés stérile. On peut également ajouter Lucifer jaune (0,1%) à la solution intracellulaire de telle sorte que la visualisation de la morphologie des cellules M peut être réalisée à la fin de l&#39;expérience. Ceci permet de confirmer l&#39;identité des cellules (figure 2). </li><li> Levez sauvages embryons de poisson zèbre de type dans l&#39;eau d&#39;œuf à 28,5 ° C, et de recueillir et stade selon Kimmel et al. 10. Pour les dissections, transfert d&#39;embryons à la dissection plat qui sert aussi de chambre d&#39;enregistrement. Anesthésier pour 7-10 min dans une solution de sel d&#39;anesthésier (0,02% de tricaïne; solution 1, tableau 3) qui se rapproche étroitement de la solution saline physiologique. On peut déterminer s&#39;ils sont suffisamment anesthésiés par l&#39;examen de la réponse à un pincement de la queue douce. </li><li> Epingler les embryons par la notochorde et sur ​​le plat Sylgard bordée de 0,001 &quot;fil de tungstène (Scientific Instrument Services. Inc., Ringoes, NJ, USA) en utilisant un grossissement 25X sur un microscope à dissection (figure 1). Le fil de tungstène est facilement coupé dansà petits segments avec des ciseaux fins de dissection. </li><li> Réglez l&#39;agrandissement sur la portée de dissection à 40 50X pour effectuer la dissection. Une fois l&#39;embryon est tombé à plat, la mâchoire, les yeux et le cerveau antérieur sont éliminées à l&#39;aide d&#39;une belle paire de pinces (Dumont # 5). </li><li> Le cerveau postérieur est légèrement décollée de la notocorde sous-jacente, en travaillant avec soin la pince entre la notochorde et le cerveau. Le cerveau postérieur est ensuite retourné doucement de sorte que la face ventrale vers le haut. Ce positionnement offre un bon accès aux cellules M, qui sont généralement dans les 5-10 pm de la surface ventrale chez les jeunes embryons et ~ 20-50 um dans les larves plus âgées (figure 2A). </li><li> Déplacez doucement la préparation à la configuration de l&#39;enregistrement où l&#39;expérience de patch-clamp peut être effectuée. Les cellules M sont visualisées avec Nomarski interférence différentielle (DIC), bien que d&#39;autres modes de prise de vue (c.-à-Hoffman modulation de contraste ou Dodt Gradient imagerie de contraste deLuigs et Neumann, Allemagne) peuvent également être utilisés. </li></ol> 2. Patch Clamp enregistrement (mode cellulaire total) <ol><li> Tous les enregistrements sont réalisés dans l&#39;ensemble du mode de correction des cellules de serrage 11. Chambres d&#39;enregistrement sont placés sur une platine de microscope dans une configuration d&#39;électrophysiologie. Nos étapes sont fixées en position verticale et le patch clamp microscope est boulonné sur une plate-forme de microscope mobile ou un traducteur de microscope. </li><li> Pipettes de patch-clamp sont tirés sur un extracteur horizontal (P-97; Sutter Instruments Co.) de paroi mince, verre borosilicate obtenu de WPI. diamètres de pointe de la pipette sont de l&#39;ordre de 0,2-0,4 um après polissage au feu à un bord lisse, et le cône de queue est ~ 4 mm de longueur. </li><li> Fixez la pipette à la tête étage amplificateur dans la configuration de l&#39;électrophysiologie. Il est important de garder la tête au-stade plus ou moins 45 ° d&#39;angle de l&#39;axe horizontal comme cela assure un angle d&#39;entrée de la pipette qui est approprié pour la formation de joint d&#39;étanchéité haute résistances sur la cellule Mauthner. </li><li> Juste avant d&#39;entrer la solution de bain, appliquez une petite quantité de pression positive à la pipette pour réduire le risque de salir le bout. Lors de l&#39;enregistrement mEPSCs, des solutions de bain comprennent 1 uM TTX pour bloquer les potentiels d&#39;action, 5 uM strychnine pour bloquer les récepteurs de la glycine et 10 uM bicuculline ou 100 uM Picrotoxine pour bloquer les récepteurs GABA A. Lors de l&#39;enregistrement mIPSCs, des solutions de bain comprennent 1 uM TTX, acide kynurénique et soit bicuculline ou la strychnine en fonction de l&#39;activité du récepteur d&#39;intérêt. </li><li> Approcher le M-cellule avec une petite quantité de pression positive dans la pipette. La pression positive pousse doucement la cellule de gauche à droite et quand il est positionné immédiatement au-dessus de la cellule, forme une petite bosse sur la membrane cellulaire. Laisser la pipette en place pendant quelques secondes pour nettoyer délicatement la surface de la cellule de sorte qu&#39;une forte étanchéité entre la pipette et la membrane peut être formé. Le relâchement de la pression positive dans la pipettepermet au joint d&#39;étanchéité à être initié et une petite quantité de pression négative couplée à des potentiels négatifs de la pipette se traduit par des joints GigaΩ formant l&#39;espace de quelques secondes. </li><li> Changer le potentiel de maintien de l&#39;amplificateur à -60 mV. Rompre la membrane cellulaire par une série de courtes impulsions d&#39;aspiration. Immédiatement enregistrer des potentiels membranaires et de minimiser les artefacts de capacitance. Compenser la capacité de la cellule (C m) et l&#39;accès (série) résistance (R a) de 70 à 85%. R un devrait être surveillés de façon systématique, toutes les 30 secondes à une minute, et si il ya un changement de 20% ou plus, avorter l&#39;expérience. </li><li> Une fois que l&#39;essai est terminé et que suffisamment de données ont été acquises, la préparation est sacrifié par élimination du cerveau postérieur avec une paire de forceps. À ce stade, l&#39;analyse des données peut commencer. </li></ol>

<ol>
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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Le protocole décrit ci-dessus permet de patcher dossier de serrage des cellules M et ses homologues. La technique est difficile et il faut prendre soin dans plusieurs domaines clés tout au long de la procédure. Nous allons maintenant discuter de certains de ces domaines et offrira des conseils utiles pour assurer le succès. La construction de la chambre de dissection / d&#39;enregistrement est un aspect critique de l&#39;expérience. Les cellules M sont difficiles à voir, sauf si le contraste d&#39;interférence différentiel est utilisé. DIC Nomarski fonctionne mieux avec des lamelles de verre propre, mais nous avons trouvé qu&#39;une très fine couche de Sylgard (~ 1-2 mm) ne sera pas fausser le DIC à un point tel que cela interfère avec l&#39;identification des cellules M. Par conséquent, on utilise une chambre d&#39;enregistrement qui a une mince lamelle de verre sur la partie inférieure sur laquelle est placée une petite rondelle de plastique (~ de 5 mm de diamètre). Nous mélangeons Sylgard 184 dans une boîte de Pétri et ajoute soigneusement le Sylgard de liquide à l&#39;intérieur de la rondelle avec une pipette Pasteur. Le Sylgard peut être durcie à la température ambiante pendant quelques jours, ou peut être chauffé pour un durcissement rapide. La rondelle peut être éliminé après la Sylgard a durci, même si cela n&#39;est pas nécessaire. Une fois la chambre dissection / enregistrement a été fait, il peut être utilisé pendant plusieurs semaines avant une lame de verre de Sylgard bordée frais est nécessaire. L&#39;étape suivante de la procédure consiste à compenser toutes les solutions pertinentes sur le jour de l&#39;expérience (tableau 3). Solutions intracellulaires contenant tout, mais l&#39;ATP et GTP sont faites à l&#39;avance et stockées dans 5 ml aliquotes à -20 ° C. Le jour de l&#39;enregistrement d&#39;un aliquot est décongelé à température ambiante et de l&#39;ATP frais et GTP est ajouté. La solution est ajusté à 280 mOsm et pH 7,4. Dans nos mains, nous constatons que plus d&#39;ATP et GTP frais sur un résultat de base par jour dans de bons enregistrements. Toutes les solutions doivent être conservés stérile pour la meilleure chance de succès. Solutions intracellulaires doivent être filtrés Througha 0,22 um filtre (Sigma) pour éliminer les petites particules et de débris qui pourraient affecter l&#39;enregistrement. Pour ce faire, nous attirons d&#39;abord la solution intracellulaire dans une seringue de 1 ml, apposer le filtre à l&#39;extrémité de la seringue et ajouter une pointe de pipette en plastique qui a été chauffé et tiré à pointe fine, à la fin du filtre. Cela nous permet d&#39;appliquer la solution intracellulaire filtrée directement à l&#39;intérieur des pipettes de patch de verre. Une fois que les solutions sont préparées, l&#39;embryon peut être anesthésiés et disséqués. Avant la dissection, il faut prendre soin de bien évaluer l&#39;âge de l&#39;organisme. Chaque embryon dans un âge d&#39;embrayage à un rythme légèrement différent. Par conséquent, lors de l&#39;évaluation de l&#39;âge de l&#39;organisme, il est important de le faire selon les procédures établies 10,13, à l&#39;aide de signaux phénotypiques tels que le nombre de somites, la forme globale du corps et le moment de la fécondation de l&#39;œuf. Tous les dissections sont réalisées avec un # 5 belle paire de Dumontforceps. Celles-ci doivent être forte et en bonne condition de travail sinon il sera très difficile d&#39;enlever la peau recouvrant le cerveau postérieur et tout le tissu conjonctif sur la face ventrale du cerveau postérieur. Nous avons souvent pour aiguiser les pinces après quelques semaines d&#39;utilisation, et le faire nous-mêmes avec une pierre à aiguiser. Pour épingler le poisson à la mince couche de Sylgard, nous utilisons les repères fabriqués à partir de fil fin de tungstène 0,001 pouces de diamètre. Les broches sont coupés avec un vieux, ciseaux micro-dissection au microscope de dissection, et sont suffisamment petits pour tenir tout au long de la notochorde. Épingler les embryons à un autre point ne les immobiliser et ne fait dissections presque impossible à réaliser. Lors de l&#39;apprentissage d&#39;abord pour effectuer les enregistrements, il peut être difficile pour l&#39;identité de la M-cellulaire de ses homologues (notamment MID2 cm, qui est situé dans le rhombomère voisin - rhombomère 5). Dans certains embryons ces deux paires de cellules apparaissent de taille similaire. Le otolithes proVide un point de repère idéal pour aider à l&#39;identification des cellules M. À 48 HPF les cellules M sont situés juste à côté des otolithes, et même si les otolithes sont supprimés lors de la dissection, ils laissent derrière eux une région latérale légèrement endommagé du cerveau postérieur, qui sert de marqueur pour leur position d&#39;origine. Les poissons transgéniques qui expriment la GFP ou un autre marqueur fluorescent dans le M-cellule, offrent d&#39;excellentes préparations pour les nouveaux expérimentateurs. Dans nos mains les cellules M ont une capacité de membrane d&#39;environ 18-24 pF à 48 HPF, tandis que les plus homologues sont plus proches de 12-14 pF. Les cellules avec une plus grande aire de surface ont de plus grandes valeurs de capacité de la membrane (mesurée en pico farads (PF)) par rapport à des cellules plus petites. Ainsi, la capacité de la membrane peut être utilisée comme indicateur brut de la taille des cellules, où des cellules plus grandes ont des valeurs de capacitance plus larges. Cette caractéristique électrophysiologique sert une autre propriété par laquelle le M-cellule peut être identifié à partir de ses homologues. Enfin, nous utilisons souvent Lucifer jaune dans notre enregistrement (intracellulaires) des solutions, ce qui nous permet de procéder à une identification entreprise du type cellulaire à l&#39;étude utilisant l&#39;imagerie par fluorescence une fois les enregistrements sont complets. résistances de pointe de la pipette dans la gamme de 3,5-4,5 MQ sont le meilleur compromis entre la taille de la pointe et faible résistance d&#39;accès, qui varie généralement de 8 à 15 MQ. Ceci est particulièrement important pour les événements avec une cinétique rapide; ~ 0,1 ms (20-80%) temps de montée et ~ 0,5 ms exponentielle désintégrations 12,14,15 (figures 3A et 3B). Les données sont acquises à une vitesse de 50 à 100 kHz de la numérisation et filtré avec un passe-bas de fréquence de 5 à 10 KHz. En ce qui concerne les pipettes de patch, nous avons constaté qu&#39;ils n&#39;ont pas besoin d&#39;être d&#39;obtenir un enregistrement poli-le-feu, mais de façon anecdotique, il semble offrir un peu plus de chances d&#39;obtenir de bons joints rapport avec des pipettes non polis. Depuis les embouts de pipette sont relativement grandes, nous n&#39;ajoutons pas very pression beaucoup de positif à la pipette avant d&#39;entrer dans la solution. Il faut de la pratique de décider de la quantité appropriée de pression positive à appliquer comme un excès de pression se déplace la cellule trop, et éviter la formation de joint. Il peut également endommager les contacts synaptiques que la cellule est déplacée doucement de sa position d&#39;origine. D&#39;autre part, trop peu de résultats de pression dans des conseils sales et ne pas nettoyer la surface de la cellule assez bien pour former de bons joints. Un juste milieu n&#39;est atteinte par la pratique et une expérience significative. la formation de joint peut être améliorée avec des applications de tensions négatives à la pipette. Nous avons généralement des joints de 1.2-2 GQ, qui sont excellents pour les percées dans le mode de cellules entières. Lorsque des agents pharmacologiques doivent être appliqués dans le cytoplasme des cellules, on les inclure dans la solution intracellulaire avant le remplissage de la pipette. Des précautions doivent être prises lors de la préparation des solutions de pipette pour éviter la perte des agentsen le faisant se lier au filtre de 0,22 um. Par conséquent, nous filtrons le milieu intracellulaire d&#39;abord, puis ajoute soigneusement l&#39;agent pharmacologique à la solution filtrée. Application des composés vers le compartiment intracellulaire a son propre ensemble unique de défis. Par exemple, l&#39;addition de la drogue dans le milieu intracellulaire réduit habituellement les chances de former un joint de GQ, mais pas au point où il est un obstacle majeur à l&#39;expérience. On devrait se rendre compte que l&#39;application d&#39;agents pharmacologiques de cette façon ne permet pas à l&#39;expérimentateur d&#39;enregistrer le contrôle le plus approprié étant donné que l&#39;agent a un accès immédiat à la cellule à partir du début de la configuration de cellules entières. Par conséquent, alors que nous enregistrons des données tout au long de ce type d&#39;expérience, il faut être conscient que la meilleure commande est l&#39;application intracellulaire d&#39;une forme inactive de l&#39;agent. Dans de nombreux cas, cela prend la forme d&#39;un composé inactivé par la chaleur, un peptide brouillé or un isomère inactif obtenu auprès du fournisseur. Nous acquérons des données sous la forme de courants synaptiques (de mPSC), les courants de voltage-dépendants et des potentiels d&#39;action. Courants miniatures peuvent être analysés par quelques excellents programmes (pClamp, Axograph, etc), bien que nous préférons utiliser Axograph X (John Clements). Axograph X fonctionne sur les plates-formes Windows et Macintosh et peut être utilisé à la fois pour l&#39;acquisition et l&#39;analyse des données électrophysiologiques. mEPCs sont acquises à l&#39;aide d&#39;un modèle de choix de l&#39;expérimentateur, obtenu à partir de l&#39;enregistrement lui-même. Événements individuels peuvent être analysés pour des propriétés telles que le temps de montée, amplitude, demi-largeur et le temps de descente, etc Nous exportons la feuille de calcul des données de Kaleidagraph (Synergy Software) où nous pouvons produire des chiffres, y compris les copies de traces d&#39;événements de Axograph X. Un des aspects les plus difficiles de l&#39;expérience est de déterminer si l&#39;enregistrement a été effectué assez bien pour fournir une énergie propre,données fiables. Par exemple, les questions de serrage spatiales peuvent survenir lors de l&#39;enregistrement mPSC de cellules M qui ont de grandes axones et de vastes processus dendritiques. Lorsque la tension de serrage, on peut généralement contrôler la tension au niveau de la pointe de la pipette raisonnablement bien (surtout si la résistance d&#39;accès (R a) est faible), mais peuvent ne pas avoir le contrôle approprié du potentiel de membrane dans les procédés dendritiques ou des axones qui sont beaucoup l&#39;écart de la pointe de pipette. Une méthode de déterminer si la cellule était bien serrée espace est de produire un diagramme de dispersion des temps de montée vs l&#39;amplitude des mPSC qui ont été enregistrés. Une corrélation entre les données est suggestive de serrage insuffisant de l&#39;espace. En d&#39;autres termes, si la pince de l&#39;espace est pauvre alors mPSC qui se produisent près de la pipette devront rapidement s&#39;élever temps et des amplitudes plus importantes que les événements survenus à une certaine distance de la pipette. S&#39;il existe une corrélation, puis les données est problématique et ne peut pas être utilisé. Un autre aspectdes enregistrements électrophysiologiques qui doit être abordée est celle des courants de fuite. Cela est particulièrement vrai lorsque la tension de serrage dans une cellule afin d&#39;enregistrer les courants de voltage-dépendants, tels que Na + ou K + des courants. Lorsque le potentiel de membrane est écartée de repos, les courants de fuite peuvent être enregistrées en même temps que l&#39;activité de voltage-dépendant. courants de fuite (I L), une combinaison de potassium (I K), sodium (I Na) et chlorure (I Cl) courant à travers-non voltage-dépendants canaux seront occulter l&#39;activité d&#39;intérêt et doivent être soustraites de l&#39;enregistrement. L&#39;amplificateur est capable de remplir cette fonction en ligne lors de l&#39;enregistrement en exécutant ce qui est généralement appelé un protocole P / N. Pendant un protocole P / N, l&#39;amplificateur de fonctionner plusieurs petites dépolarisations (ou hyperpolarisations) de repos et enregistrer le courant de fuite qui se produit résultant. Il est important d&#39;utiliser suffisamment petites impulsions qui n&#39;activent pas les canaux voltage-dépendants. Le courants qui se produisent au cours de ces impulsions sont enregistrées et calculées de telle façon que ces courants de fuite peuvent être soustraites de l&#39;activité des canaux voltage-dépendants. Enfin, il faut tenir compte du potentiel de jonction, qui se produit à la pointe de l&#39;électrode entre le intracellulaires et extracellulaires solutions. Solutions intracellulaires et extracellulaires sont typiquement composés d&#39;ions différents, avec des activités et des mobilités différentes. Grandes ions à mobilités inférieures offriront une plus grande résistivité de mouvement des ions que les plus petits, ce qui peut entraîner une légère mais significative différence de potentiel à la jonction des solutions. Ce potentiel de jonction doit être prise en compte lors de la détermination des tensions appropriées subies par la cellule. La technique présentée ici est celui utilisé par notre laboratoire pendant de nombreuses années. Cependant, il existe d&#39;autres méthodes d&#39;enregistrement de la M-cellule. Plus particulièrement, Joseph Fetcho et ses collègues ont développered une excellente préparation dans lequel on peut enregistrer des cellules M de larves plus âgées (4-5 jours) d&#39;une manière moins invasive que présenté ici, où le M-cellulaire est abordée à partir de la surface dorsale 16. Nous avions essayé une technique similaire, mais plus de facilité à aborder le M-cellule de la face ventrale du cerveau postérieur, où la cellule est plus proche de la surface du cerveau, en particulier chez les jeunes poissons (soit 24 à 72 HPF HPF). En outre, une approche à partir de la surface dorsale exige habituellement l&#39;utilisation d&#39;une lignée transgénique qui exprime un marqueur fluorescent dans le M-cellule, qui a le potentiel d&#39;introduire des variables supplémentaires dans l&#39;enregistrement. Ce problème n&#39;est pas présent lors de l&#39;utilisation de type de poissons sauvages. Cependant, avec la technique présentée ici, nous sommes limités à l&#39;étude des animaux plus jeunes (24 à 72 HPF HPF). Ainsi, chaque méthode a ses avantages et ses limites. Test t de Student peut être utilisé pour comparer les deux groupes de données tandis que l&#39;analyse de variance (ANOVA) peut être utilisé pour comparer des groupes multiples. Il faut prendre soin de choisir le test post-hoc approprié pour paramétrique vs données non paramétriques.

L&#39;une des questions en suspens dans la neurobiologie du développement se rapporte au rôle des phénomènes de plasticité synaptique lors de la maturation synaptique. Notre recherche se concentre sur la compréhension des mécanismes de plasticité synaptique qui sous-tendent le développement avec un objectif global de la compréhension du comportement des animaux dans le contexte du développement synaptique. Pour ce faire, nous avons développé une préparation en grande partie intacte dans un organisme (le poisson zèbre, Danio rerio) qui a pris de l&#39;ampleur considérable des études sur le développement à la fin des années 1990. Le poisson zèbre offre plusieurs avantages distincts pour les études sur le développement neurologique. Par exemple, son génome est séquencé et l&#39;on peut effectuer passes rabattues morpholino et KO nucléases à doigts de zinc pour réduire au silence l&#39;activité des gènes et l&#39;expression des protéines. On peut également effectuer des études de surexpression et lignées transgéniques peut être construit 7-9. Les embryons sont relativement faciles et abondantes à acquérir, etle caractère transparent de l&#39;embryon se prête bien à des études d&#39;imagerie et opto-génétique. En outre, l&#39;analyse comportementale peut être effectuée, et les expériences électrophysiologiques peut être réalisée sur les fibres musculaires, les neurones de la moelle épinière et du cerveau postérieur neurones dans les organismes en grande partie intacts, permettant un pour examiner la fonction cellulaire in vivo. Surtout, nous sommes en mesure d&#39;examiner l&#39;activité synaptique dans non seulement la même classe de la cellule, mais dans la même paire de neurones, de la préparation à la préparation. En d&#39;autres termes, il s&#39;agit d&#39;un des rares préparations de vertébrés dans lequel on peut retrouver le même neurone, in situ, d&#39;étudier son développement. Afin de maintenir circuits neuronaux aussi viable que possible, nous avons développé une préparation dans laquelle le cerveau postérieur et de la moelle épinière ont été laissés intacts, tandis que patch clamp des cellules M. Dans cette préparation, les yeux, la mâchoire et la peau recouvrant le cerveau sont éliminées en douceur et le cerveau postérieur est peeled loin de la notochorde, permettant l&#39;accès à la surface ventrale du cerveau postérieur. Les neurones réticulo sont situés à quelques micromètres de profondeur et sont relativement faciles d&#39;accès. À 48 heures après la fécondation (HPF; certaines abréviations sont énumérées dans le tableau 1), les cellules sont électriquement compact et on peut enregistrer fidèlement l&#39;activité synaptique (à la fois excitateurs et inhibiteurs courants), les courants de voltage-dépendants et des potentiels d&#39;action de leur part. Nos résultats suggèrent que de nombreux aspects du développement synaptique et la maturation se produisent dans le 24 heures avant l&#39;éclosion, et donc beaucoup de notre attention est centrée sur les organismes âgés de 24 à 72 HPF HPF. Cependant, par 72 hpf, les cellules M sont moins compact électriquement et sont difficiles à bien l&#39;espace de serrage. La technique peut être utilisée pour enregistrer non seulement les cellules M, mais aussi de ses homologues, MID2 cm et MiD3 cm. Théoriquement, on peut également effectuer des enregistrements doubles, d&#39;un spneurone cordon inal comme un neurone moteur primaire et du M-cellule, mais cela est difficile et on pourrait faire valoir que les avantages tirés de cette technique difficile peut-être pas en valeur l&#39;effort extraordinaire qui est nécessaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Equipment Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting Dish</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0291</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.001" Tungsten Wire</td>
			<td>Scientific Instruments Services Inc.</td>
			<td>W406</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ9.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-97</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige Group</td>
			<td>MF-900</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Upright Patch clamp microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMLFSA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou Inc.</td>
			<td>MX7500</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digidata</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1322A</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>200B</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp9</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Axograph X</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>Axograph X</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

patch clamp recordings from embryonic zebrafish mauthner cells

Cellules Mauthner (cellules M) sont de grands neurones réticulo situées dans le cerveau postérieur de poissons téléostéens. Ils sont des neurones clés impliqués dans un comportement caractéristique connue comme la réponse C-démarrer ou échapper qui se produit lorsque l&#39;organisme perçoit une menace. Le M-cellulaire a été étudiée chez le poisson rouge adulte où il a été démontré à recevoir une large gamme de excitateurs, des signaux inhibiteurs et neuromodulateurs 1. Nous avons examiné l&#39;activité M-cellule embryonnaire chez le poisson zèbre pour étudier les aspects du développement synaptique dans une préparation de vertébrés. À la fin des années 1990 Ali et ses collègues ont développé une préparation pour l&#39;enregistrement patch clamp de cellules M dans embryons de poissons zèbres, dans lequel le CNS était 2,3,4 en grande partie intact. L&#39;objectif à l&#39;époque était d&#39;enregistrer l&#39;activité synaptique des neurones du cerveau postérieur, les neurones de la moelle épinière et le tronc muscle squelettique, tout en maintenant des connexions synaptiques fonctionnelles au sein d&#39;une préparation de la moelle du cerveau-moelle intacte.Cette préparation est encore utilisée dans notre laboratoire aujourd&#39;hui. Pour examiner les mécanismes de la plasticité synaptique sous-jacente de développement, nous enregistrons excitateur (AMPA et NMDA médiation) 5,6 et inhibiteurs (GABA et glycine) courants synaptiques de développer les cellules M. Surtout, cette préparation unique nous permet de revenir à la même cellule (M-cellule) de la préparation à la préparation d&#39;examiner attentivement la plasticité synaptique et neuro-développement dans un organisme embryonnaire. Les avantages offerts par cette préparation comprennent: 1) intact, les connexions synaptiques fonctionnelles sur le M-cellulaire, 2) les préparations relativement bon marché, 3) une grande quantité d&#39;embryons facilement disponibles 4) la capacité de retourner au même type de cellule (c. M- cellule) dans chaque préparation, afin que le développement synaptique au niveau d&#39;une cellule individuelle peut être examiné à partir de poissons à pêcher, et 5) l&#39;imagerie des préparations entières en raison de la nature transparente des embryons.

Dans ce manuscrit, nous présentons une méthode pour l&#39;enregistrement de patch-clamp en mode cellule entière de neurones réticulo chez le poisson zèbre, en particulier en mettant l&#39;accent sur le M-cellule. Bien sûr, il est également possible d&#39;enregistrer dans d&#39;autres modes tels que la cellule attachée, à l&#39;intérieur et à l&#39;extérieur hors-out patch clamp. Le type de données que l&#39;on peut obtenir ne se limite pas à ce que nous avons présenté ici, mais nous essayons de donner un exemple à la fois de l&#39;activité synaptique (excitateur et inhibiteur) en mode voltage-clamp ainsi que les potentiels d&#39;action en pince de courant. Avec le vieillissement de l&#39;organisme et les cellules se développent M dendrites plus étendus et complexes, la capacité à la tension adéquate de serrage et serrer l&#39;espace cellulaire est compromise et le mode de blocage de courant devient l&#39;enregistrement des choix. La figure 3 montre des enregistrements représentatifs des courants excitateurs du récepteur AMPA et NMDA obtenues à partir d&#39;embryons de 48 hpf en présence de TTX (1 pM) et des agents pharmacologiques àbloquer GABA et la glycine des récepteurs. Lorsque les cellules M-tension sont serrés à -60 mV, les courants synaptiques sont dues à l&#39;activation des récepteurs AMPA (figure 3A). Acquisition et analyse de ces événements permet d&#39;enregistrer des paramètres tels que le temps de montée, temps de descente, l&#39;amplitude et la fréquence. Événements AMPA ont généralement un temps de montée rapide (20-80% du temps de montée de ~ 0,1 ms) et le temps de décroissance (~ 0,5 ms), et présentent une amplitude moyenne d&#39;environ 25 pA. Lorsque les cellules M sont serrés à 40 mV, les courants sortants qui en résultent sont en raison de l&#39;AMPA et NMDA l&#39;activité du récepteur (figures 3C et 3D). Courants des récepteurs NMDA présentent des cours de plus longues périodes que les courants des récepteurs AMPA, et doivent être enregistrées à des potentiels positifs ou en solution de Mg-libre pour enlever le bloc Mg de la NMDA récepteurs 2,6. Le mEPSC moyenne de la figure 3D représente courants AMPA et NMDA mixtes enregistrées à 40 mV. Figure 4 montre des résultats représentatifs lors de l&#39;enregistrement à partir de cellules mIPSCs Mauthner. Ces événements ont eu lieu en présence de TTX (1 pM) et l&#39;acide kynurénique (1 mM) pour bloquer les récepteurs AMPA et NMDA. Ces événements présentent hausse assez rapide et cinétique de décroissance de 48 HPF et sont assez fréquentes pour acquérir beaucoup d&#39;entre eux sur un enregistrement min 3 2-3. Figure 5 montre les potentiels d&#39;action enregistrés à la suite de l&#39;injection de courant de dépolarisation dans la cellule. M-cellules de 48 HPF embryons feu généralement un potentiel d&#39;action unique (figure 5B), mais ils tirent parfois plusieurs points d&#39;accès lorsqu&#39;ils sont injectés à des stimuli supraliminaires (figure 5A). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Abréviation </td><td> Nom et prénom </td></tr><tr><td> Une. </td><td> MPSC </td><td> Courant post-synaptique miniature </td></tr><tr><td> 2. </td><td> mEPSC </td><td> Miniature courant post-synaptique excitateur </td></tr><tr><td> 2 </td><td> mIPSC </td><td> Miniature courant post-synaptique inhibitrice </td></tr><tr><td> 3. </td><td> MQ </td><td> Mega Ohm (unité de résistance; 10 6 Ohm) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> GQ </td><td> Giga Ohm (unité de résistance; 10 9 Ohm) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> MOsM </td><td> Milli osmolaire (unité de l&#39;osmolarité; 10 -3 osmoles) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> TTX </td><td> tétrodotoxine </td></tr><tr><td> 5. </td><td> ATP </td><td> adénosine triphosphate </td></tr><tr><td> 6. </td><td> GTP </td><td> guanosine triphosphate </td></tr><tr><td> 7. </td><td> GFP </td><td> La protéine fluorescente verte </td></tr></tbody></table> Tableau 1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; Équipement Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Une. </td><td> Dissection vaisselle </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0291 </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 0.001 &quot;Fil de tungstène </td><td> Instruments scientifiques Services Inc. </td><td> W406 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Loupe binoculaire </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ9.5 </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Pipette Puller </td><td> Sutter Instruments Co. </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Microforge </td><td> Narishige Groupe </td><td> MF-900 </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Montant patch clamp microscope </td><td> Leica Microsystems </td><td> DMLFSA </td></tr><tr><td> 6. </td><td> Micromanipulateur </td><td> Siskiyou Inc. </td><td> MX7500 </td></tr><tr><td> 7. </td><td> Digidata </td><td> Molecular Devices </td><td> 1322A </td&gt; </tr><tr><td> 8. </td><td> Amplificateur </td><td> Molecular Devices </td><td> 200B </td></tr><tr><td> 9. </td><td> Logiciel d&#39;acquisition </td><td> Molecular Devices </td><td> pClamp9 </td></tr><tr><td> 10. </td><td> Axograph X </td><td> Axograph </td><td> Axograph X </td></tr></tbody></table> Tableau 2. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Nom de la solution </td><td> Réactif et concentration (mM) </td></tr><tr><td> Une. </td><td> Solution dissection </td><td> 134 NaCl, KCl 2,9, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose et 0,02% Tricaine </td></tr><tr><td> 2. </td><td> MPSC solution extracellulaire </td><td> 134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES, 10 glucose et 0,001 TTX </td></tr><tr><td> 3. </td><td> MPSC intracellulaire solutiontion </td><td> 134 CsCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 10 EGTA, 4 Na 2 ATP, 0,4 Li-GTP </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Action solution extracellulaire potentiel </td><td> 137 NaCl, KCl 2,9, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl2, 10 HEPES et 10 glucose (avec 10 uM D-tubocurarine) </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Action solution intracellulaire potentiel </td><td> 130 KCl, NaCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 4mg-ATP et 0,4 Li-GTP. </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Toutes les solutions extracellulaires sont ajustées à 290 mOsm et pH 7,8. Toutes les solutions intracellulaires sont ajustées à 280 mOsm et pH 7,4. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig1.jpg" /> Figure 1. Dissection plat et intact préparation de cordon hindbrain-spinal. (A) à disséquer et à l&#39;enregistrement plat obtenu de WPI. Une rondelle mince est soigneusement scellé sur til lame de verre au fond de la boîte et Sylgard est appliquée sur le puits. (B) 48 hpf rhombencéphale-spinal préparation de cordon. La surface ventrale du cerveau postérieur est orientée vers le haut et le M-cellule se trouve juste en dessous de la surface du tissu au niveau de la pointe de flèche. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig2.jpg" /> Figure 2. (A) l&#39;image de contraste d&#39;interférence différentielle de Nomarski d&#39;un M-cellulaire obtenue à partir d&#39;un embryon de 2 dpf peu après l&#39;éclosion. L&#39;image a été prise après enregistrement de l&#39;activité synaptique excitatrice spontanée de la M-cellule. (B) La cellule a été remplie avec Lucifer jaune pendant l&#39;expérience. Adapté de 12 avec la permission. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig3.jpg" /> Figure 3. (A) mEPSCs AMPA spontanées enregistrées à partir d&#39;un M-cellule<html> à un potentiel de maintien de -60 mV. (B) mEPSCs moyennes obtenues à partir de l&#39;enregistrement en (A). (C) spontanée AMPA et NMDA (pointes de flèches) mEPSCs enregistrées à partir d&#39;un M-cellule à un potentiel de maintien de 40 mV. (D) mEPSCs moyennes obtenues à partir de l&#39;enregistrement en (C). mEPSCs du glutamate ont été enregistrés dans la présence de TTX (1 uM) pour bloquer des potentiels d&#39;action, la strychnine (5 M) et PTX (100 M) pour bloquer la glycine et GABA courants. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig4.jpg" /> Figure 4. (A) mIPSCs spontanées enregistrées à partir d&#39;un M-cellule à un potentiel de maintien de -60 mV. (B) mEPSCs moyennes obtenues à partir de l&#39;enregistrement à (A). mIPSCs ont été enregistrés dans la présence de TTX (1 uM) pour bloquer des potentiels d&#39;action, l&#39;acide kynurénique (1 mm) pour bloquer l&#39;activité des récepteurs du glutamate et bicuculline (10 M) pour bloquer les courants de GABA. nt &quot;fo: keep-together.within page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig5.jpg" /> Figure 5. Potentiels d&#39;action enregistrés à partir d&#39;un M-cellule. Dans cette cellule un stimulus supraliminaire (0,48 nA) a suscité plusieurs potentiels d&#39;action (A), mais une incitation à seuil résultats seulement dans la production d&#39;un potentiel d&#39;action unique (B). (C) Les protocoles actuels pour les tracés affichés dans A et B.

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Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Nous avons mis au point une préparation de la moelle du cerveau-moelle intacte pour enregistrer et contrôler l&#39;activité électrique via correctif enregistrement de serrage des neurones et d&#39;autres cellules Mauthner réticulospinales dans embryons de poissons zèbres. Ainsi, nous sommes en mesure d&#39;enregistrer les courants synaptiques excitateurs et inhibiteurs, l&#39;activité des canaux voltage-dépendants et des potentiels d&#39;action des neurones clés dans un embryon en développement.

Patch-clamp enregistrements de cellules embryonnaires de poisson zèbre Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.8K vues.  University of Alberta.  Nous avons mis au point une préparation de la moelle du cerveau-moelle intacte pour enregistrer et contrôler l'activité électrique via correctif enregistrement de serrage des neurones et d'autres cellules Mauthner réticulospinales dans embryons de poissons zèbres. Ainsi, nous sommes en mesure d'enregistrer les courants synaptiques excitateurs et inhibiteurs, l'activité des canaux voltage-dépendants et des potentiels d'action des neurones clés...

Vidéo: Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l&#39;obscurité Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Recherche

Neurosciences

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Jumelés Recordings Patch Clamp du motoneurone et de muscle ciblé squelettiques chez le poisson zèbre

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

La culture et l&#39;électrophysiologie des cellules sur la SCGDV de patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Les enregistrements de patch-clamp en cellules ciliées de l&#39;oreille Isolé du poisson zèbre

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPase Vesicle Préparation et Technique for the Performing Patch enregistrements de serrage des membranes des vésicules submitochondriales

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolation des neurones sensoriels de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Patch pour les enregistrements de serrage des courants glutamatergiques

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcellulaires Recordings Patch-clamp du Domaine somato de nigrales Dopamine Neurones

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...