Financé par la NSF (0854551).

1. Les préparatifs pré-expérimentales <ol><li> Préparez six solutions (voir le tableau 1 pour les compositions): (a) 100 ml NZR (normal poisson zèbre Ringer), (b) 50 ml NZR + tricaïne (MS222), (c) 10 ml NZR + BSA; (d) 100 Locas ml (faible solution de Ca 2 +), (e) 10 ml + Locas papaïne, (f) 100 ml K +-solution interne. Les solutions (a), (b), (d) et (f) peut être stocké pendant jusqu&#39;à un mois à 4 ° C. Solutions (c) et (e) doit être préparée le jour de l&#39;expérimentation. Toutes les solutions doivent être à température ambiante avant de commencer les expériences. </li><li> Étiquette et remplir quatre boîtes de Pétri de 35 mm environ à mi-chemin avec des solutions (a), (c), (d) et (e). </li><li> Faire un plat à dissection en remplissant une boîte de 60 mm de Pétri avec du Sylgard (Dow Corning, Midland, MI), puis en coupant une cavité dans ce qui permettra à un poisson de se tenir debout sans basculer. </li><li> Préparer au moins deux outils d&#39;isolement des cellules par collage à la fin d&#39;un follicule de cheveux de chien à l&#39;extrémité d&#39;un verrePipette Pasteur avec de la colle, ce qui permet d&#39;étendre les cheveux delà de l&#39;extrémité de la pipette d&#39;environ 0,5 cm. Les poils de fourrure douce comme des chiens Labrador Retrievers et Weimaraners bien fonctionner. </li></ol> 2. L&#39;isolement de l&#39;audition et un labyrinthe vestibulaire <ol><li> Sacrifier un poisson zèbre adulte par immersion dans un bécher contenant NZR + tricaïne. Contrôler visuellement les branchies jusqu&#39;à ce que tous les mouvements operculaires ont cessé. Délai supplémentaire de dix minutes avant de retirer le poisson et le rinçage avec NZR frais. Ces procédures ont été approuvées par la protection des animaux institutionnel et l&#39;utilisation comité (IACUC) de l&#39;Université de Pepperdine, mais l&#39;approbation doit être obtenue à partir de votre propre institution. </li><li> Épingler le poisson à la dissection côté dorsal plat par l&#39;insertion, une broche de couture droite standard (environ 2,5 cm de long) à travers chaque orbite et une troisième broche par l&#39;axe dorso-ventrale environ un tiers à la moitié de la distance de la tête à la queue comme illustré dansFigure 1A. </li><li> En vertu d&#39;un zoom (0.62-5x) stéréo microscope de dissection équipé d&#39;oculaires 10x, utilisez des ciseaux à ressort (Fine numéro de catalogue Outils scientifiques 15000-02) pour exposer le cerveau et un court segment de la moelle épinière en enlevant le toit du crâne à partir d&#39;un point situé à environ 0,5 cm caudal au niveau des ouïes avant du nez du poisson. Couper la moelle épinière et le cerveau soulever avec une pince fine (Fine numéro de catalogue Outils scientifiques 11251-30) tout en réduisant les nerfs spinaux et autres accessoires, retirer et jeter le cerveau (figure 1B). </li><li> La moitié ventrale de la capsule crâne qui reste forme une «cuvette» qui contient les organes d&#39;oreille interne. Respecter les éminents, blanc, opaque otolithes dans les lagenas et sacculi situés symétriquement à l&#39;extrémité caudale de chaque oreille interne et les otolithes utricule latéralement positionnées plus rostrale (figures 1C et 4A). </li><li> Retirer le bol de l&#39;os en coupant toutes attachmen ventrales et latéralests tout en le soulevant doucement de la tête avec une pince fine. Placez-le dans la boîte de Pétri contenant Locas (1D figures et 4B). </li><li> L&#39;utilisation de deux paires de pinces fines, se fissurer à part le bol à sa ligne médiane soit par l&#39;accaparement des bords latéraux de l&#39;os et les tirant ou encore, en séparant les moitiés droite et gauche en insérant les points de la pince dans le centre et soulevant les moitiés de l&#39;autre. Retirez les deux labyrinthes de l&#39;os à l&#39;aide de pinces fines (figure 2). </li><li> Inspectez les labyrinthes d&#39;identifier le auditives et vestibulaires organes terminaux: les canaux semi-circulaires, utricules, sacculi et lagenas (figure 4C). Les zones rosées sous chaque otolithe sont des macules contenant les cellules ciliées. De même, une bande de rose à l&#39;intérieur des ampoules des canaux semi-circulaires identifie la cupule où les cellules ciliées sont situés. </li><li> Retirez délicatement les otolithes de l&#39;utricule et lagena à l&#39;aide des pinces fines ( <strong&gt; Figures 2 et 4C). Il n&#39;est pas nécessaire de retirer les otolithes du saccule, car cela pourrait endommager les cellules ciliées sacculaires. </li></ol> 3. Isolement cellulaire cheveux <ol><li> En utilisant une pipette de transfert en plastique (nombre Fisher Scientific catalogue 13-711, 9 heures), déplacer les organes d&#39;extrémité de la capsule contenant Locas + papaïne minimiser le volume de fluide transféré. </li><li> Incuber ces structures dans cette solution pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> A la fin de la période d&#39;incubation, de déplacer les structures dans le plat contenant NZR + BSA et incuber dans cette solution pendant au moins trente minutes. Les cellules ciliées restera dans cette solution pendant un maximum de quatre heures, mais va se détériorer au bout de 1-2 heures après l&#39;isolement (voir les prochaines étapes). </li><li> En préparation pour l&#39;isolement cellulaire, déplacez l&#39;un des organes de bout-en le plat contenant NZR. </li><li> Pour les lagenas et utricules, utilisez un poil de chien pour soulever doucement les draps macules-épithéliale de ti roséquest ce que contiennent les cellules ciliées (figure 3A). La macula peut être évidé (en utilisant un poil de chien) sous les otolithes de la sacculi, et le cupules de leur emplacement à l&#39;intérieur des ampoules des canaux semi-circulaires. </li><li> À l&#39;aide de deux outils d&#39;isolement des cellules préparées dans l&#39;étape 1,4, triturer une cupule macula ou pour générer un champ de débris contenant les cellules ciliées (figure 3B). Laisser les cellules au moins cinq minutes pour régler sur le fond du plat avant de le déplacer. </li><li> Déplacer l&#39;antenne vers le platine d&#39;un microscope inversé équipé d&#39;une optique à contraste de phase. Respecter les cellules sous un grossissement de 40X et notez la diversité morphologique. De nombreuses cellules sont d&#39;avocat en forme tandis que d&#39;autres sont longs et minces. La présence de faisceaux de poils apicaux les identifie comme des cellules ciliées et la phase luminosité assure leur santé. Photomicrographies de cellules ciliées isolées sont présentés dans la figure 5. </li></ol> 4. Patch de serrage cellules ciliées de poisson-zèbre <ol><li> En préparation pour perfoPatch nominale 5,6 enregistrements, préparer l&#39;amphotéricine solution contenant interne comme suit: lieu de 5 mg d&#39;amphotéricine B (Sigma A4888) dans un tube de 1,5 ml et remplir avec 100 ul de DMSO. Immédiatement vortex cette solution pendant 10-20 secondes jusqu&#39;à ce que tout l&#39;amphotéricine est dissoute. Puis, une pipette 625 ul K +-solution interne dans un tube de seconde. Ajouter 10 ul de la solution d&#39;amphotéricine au K +-solution et vortex interne comme ci-dessus. La solution d&#39;amphotéricine actions durera plusieurs heures, mais jetez la solution finale après une heure. </li><li> Fabriquer pipettes de patch de BF verre borosilicate 150-86-10 (Sutter Instruments) à l&#39;aide d&#39;un extracteur à étages multiples (Sutter P-1000). Pipettes aurait dû faire pencher diamètres d&#39;environ 2 microns et ont des résistances de 1-3 MQ avec les solutions dans le tableau 1. Les paramètres de l&#39;extracteur qui fonctionnent bien sont les suivantes: Chaleur = Rampe minus10, Pull = 0, vitesse = 18, Delay = 1, Pression = 600. La forme desla pointe d&#39;une pipette bonne est évident à partir de la photographie dans le c encart de la figure 5. Blunt &quot;balle&quot; en forme de pipettes sont préférés car ils offrent le moins de résistance lors de l&#39;accès des enregistrements électrophysiologiques. </li><li> Utilisez une aiguille de calibre 28 seringue Microfil (MF28G-5; World Precision Instruments) pour remplir une électrode d&#39;enregistrement à moitié avec de l&#39;amphotéricine K contenant interne +-solution. </li><li> Apposer l&#39;électrode à la headstage d&#39;un amplificateur de patch-clamp. Appliquer -10 mV, 10 ms échelons de tension à 10 Hz et à maintenir une pression positive dans l&#39;électrode tel qu&#39;il est manoeuvré par l&#39;interface air / solution et vers le bas au fond de la cuvette d&#39;enregistrement à proximité des cellules. </li><li> Placez l&#39;électrode perpendiculairement à une cellule saine. Lorsque l&#39;électrode est assez près de la cellule pour qu&#39;elle commence s&#39;éloigner de la solution à fluide, inverser rapidement la pression, en appliquant un léger vide à l&#39;électrode de la cellule jusqu&#39;à ce que «saute» sur elle. Cesser immédiatement d&#39;aspiration sur ee électrode et appliquer un potentiel de maintien de -70 mV à l&#39;intérieur de l&#39;électrode. En quelques secondes, un joint gigaohm se former. </li><li> Respecter les transitoires capacitifs actuels au début et la fin des mesures de tension qui apparaissent peu de temps après la formation du joint. Continuer à surveiller la perforation de la membrane sous l&#39;électrode par l&#39;amphotéricine en observant que les transitoires ampleur croissante de leur taille maximale (en environ dix minutes). </li><li> Pour confirmer la mise en place de la cellule entière (perforée) de configuration dans une cellule saine, susciter des courants K + vers l&#39;extérieur en appliquant l&#39;hyperpolarisation et dépolarisation des mesures de tension. La plupart des cellules de cheveux ont éminents courants sortants (voir figure 6). </li></ol> 5. Les résultats représentatifs La figure 4 montre des images prises pendant les étapes d&#39;isolement cellulaire. Dans la partie A, les otolithes sont associés aux lagenas, saccluli et utricules peut être vu Through la couche mince de l&#39;os qui les recouvre. Ces structures opaques fournir des points de repère pratiques pour aider à l&#39;élimination sûre des organes terminaux de l&#39;animal au cours des étapes ultérieures de la dissection. Le panneau B montre la «cuvette» de l&#39;os qui contient les labyrinthes intacts et les otolithes de premier plan dans les utricules, lagenas et sacculi. Panneau C montre un labyrinthe qui a été retirée de l&#39;os. Notez l&#39;otolithe grande avec le bord festonné dans le lagena, l&#39;otolithe en forme de glaçon dans le saccule et l&#39;otolithe en forme de haricot dans l&#39;utricule. Une partie de la diversité de la taille et de la morphologie observée dans les cellules isolées à partir de la lagena est illustré à la figure 5. Une cellule saine est facilement identifié comme étant la phase lumineuse avec un périmètre pointu. Formes cellulaires peuvent être divisés en deux classes: l&#39;avocat en forme (avo) et longue et mince (THN), bien que la taille des cellules au sein de chaque groupe peuvent varier considérablement (comparer par exemple avo 1 et avo 3). Encart montre un groupe detrois cellules qui n&#39;ont pas été complètement isolés les uns des autres. La couleur noire et d&#39;aspect granuleux de la cellule b encadré identifie aisément cette cellule comme mort. C encart montre la pointe d&#39;une pipette de patch illustrant la forme et les dimensions appropriées pour l&#39;enregistrement de ces cellules. Les traces de courant illustré à la figure 6 ont été obtenues en réponse à l&#39;hyperpolarisation et dépolarisation étapes de potentiel imposé sur une cellule lagena similaire à la avo 2 représenté sur la figure 5. Les réponses actuelles dans les cellules de différentes tailles et formes peuvent varier considérablement suggérant la diversité de l&#39;effectif des canaux voltage-dépendants. Figures 1-3: Dessins animés illustrant des étapes dans l&#39;isolement des cellules ciliées. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig1.jpg" /> Figure 1. Suppression de la capsu crânele contenant dans les labyrinthes de l&#39;oreille interne du poisson zèbre. A. Broche sacrifié poisson zèbre face dorsale jusqu&#39;à disséquer plat. B. Crâne ouvert, retirez et jetez le cerveau. C. Respecter les otolithes dans utricules, lagenas et sacculi. D. Retirer la partie ventrale de la capsule contenant les labyrinthes du crâne. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig2.jpg" /> Figure 2. Suppression des labyrinthes de capsule crâne. A. Crack part capsule crâne à sa ligne médiane. B. Retirer les labyrinthes de l&#39;os. C. Retirer les otolithes des lagenas et utricules à la pince. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig3.jpg" /> Figure 3. Isolement des cellules ciliées de labyrinthes. A. Soulevez doucement hors maculae avec un poil de chien. B. Triturer avec deux macules poils de chien. C. Utilisation des cellules ciliées isolées pour patch-clamp. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig4.jpg" /> Images Figure 4. Prise au cours des étapes de l&#39;isolement des cellules individuelles. A. Après l&#39;élimination du cerveau, les otolithes sont associés aux deux lagenas et sacculi (flèches) et utricules (pointes de flèches) peuvent être visualisées. B. Après le retrait de la face ventrale partie de la capsule crâne qui contient les organes de l&#39;oreille interne de l&#39;animal. La bande dessinée dans la moitié droite de B identifie les emplacements de l&#39;utricule gauche, lagena et le saccule. La ligne en pointillé indique la position approximative du labyrinthe gauche. C. Labyrinthe à droite (vue médiale) D: Cartoon dessin illustrant des parties importantes de labyrinthe dans C. a: demi antérieurecirculaire canal, b: canal horizontal, c: canal postérieur, d: utriculaire otolithes, e: otolithe sacculaire, f: lagenal otolithes. La barre d&#39;échelle dans D représente 1 mm pour A et B, 0,5 mm pour C et D. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig5.jpg" /> Figure 5 isolées, les cellules saines de la lagena illustrant la diversité de la morphologie; avo:. Avocat des cellules de forme; thn: longues, des cellules minces. Insérez un: groupe de trois cellules incomplètement isolés; encart b: cellule morte; c médaillon: la pointe de l&#39;électrode de patch utilisé dans des enregistrements électrophysiologiques de cellules ciliées de poisson zèbre. Barre d&#39;échelle = 20 um s&#39;applique à la figure principale et tous les encarts. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig6.jpg" /> Courants Figure 6. Enregistrées dans un patch serré cellules ciliées. Réponses moyennées dans une cellule (t similaireso avo 2 sur la figure 5) à trois présentations de mesures de tension appliquées par incréments de 10 mV de -140 mV à +70 mV à un potentiel de maintien de -70 mV. Notez le courant inactivation qui apparaît à des potentiels plus dépolarisées. Grandeurs échelon de tension sont indiquées à côté de quelques-unes des traces.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dissection minutieuse des organes cibles et le traitement en douceur des cellules est essentielle à la réussite de l&#39;isolement sains, les cellules ciliées intactes et physiologiquement active. En respectant les conseils suivants vous assurer le succès: <ol><li> Il est plus facile d&#39;obtenir des cellules saines de poissons de petite taille (2-2,5 cm de longueur). Les gros poissons ont beaucoup plus de matières grasses que les gouttelettes de visualisation obscure pendant le processus de dissection. </li><li> Des précautions doivent être prises lors du retrait des otolithes, qui recouvrent les cellules ciliées. Evitez de toucher les cellules lors de l&#39;acquisition des otolithes avec des pinces. </li><li> Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque la macula et cupules sont soulevées comme des feuilles triturées et les cellules de l&#39;épithélium. </li><li> On retrouve l&#39;utilisation d&#39;un poil de chien de triturer les cellules pour être supérieure aux autres méthodes, y compris en utilisant des cils humains 7 qui ne sont pas aussi effilée et moins souple. </li><li> Au cours de patch-clamp, l&#39;application d&#39;une pression positive à til électrode lors de son passage à travers l&#39;interface air / solution est important de garder à l&#39;extrémité propre. La libération de la pression positive afin de permettre à la cellule de «sauter» sur l&#39;électrode est également importante. Ce procédé autorise un faible volume de la solution contenant l&#39;amphotéricine distance de la pointe, ce qui augmente la probabilité de formation d&#39;un joint d&#39;étanchéité gigaohm avec la cellule. Dans nos expériences, nous utilisons la technique du patch perforé d&#39;enregistrement au lieu de la traditionnelle configuration cellule entière en raison de la fragilité des cellules. Tentative d &#39;«aller cellule entière&quot; se traduit souvent par la perte de l&#39;étanchéité gigaohm. </li></ol> La méthode décrite ici donnera des centaines de cellules des cheveux sains par animal. La technique peut être réalisée à température ambiante et ne nécessite aucun équipement spécial au-delà d&#39;un microscope à dissection. Un rapport précédent de JoVE décrit la dissection de l&#39;oreille interne chez le poisson zèbre en utilisant une approche ventrale 8. Ces auteurs démontrent le dissection des entiers, des organes fixes paraformaldéhyde l&#39;oreille interne. Nous encourageons le lecteur à regarder cette vidéo de comparaison avec nos méthodes. Un avantage des méthodes présentées ici est l&#39;obtention de cellules vivantes utiles pour les enquêtes physiologiques. Outre leur utilisation dans des expériences de patch-clamp pour étudier les canaux voltage-dépendants (comme illustré ici) l&#39;utilisation de ces cellules peut être prolongée pour étudier 9,10 résonance cellulaire, la libération des neurotransmetteurs moniteur en effectuant des mesures de capacitance 11,12, enquêter sur la neuromodulation induite par l&#39;activation des canaux dépendants du ligand 13 ainsi qu&#39;à puiser dans la richesse des informations qui peuvent être tirées de l&#39;utilisation de mutants qui affectent à la fois l&#39;audition et de l&#39;équilibre 14.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de solution </td><td> Recette </td></tr><tr><td> (A) NZR (Normal Zebrafish Ringer) (en mM) </td><td> 116 NaCl, 2 KCl, CaCl 2 2, 3 glucose, 5 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (B) NZR + tricaïne </td><td> NZR + 0,02% acide 3-aminobenzoïque d&#39;éthyle méthane sulfonate ester (Sigma A5040). </td></tr><tr><td> (C) NZR + BSA </td><td> NZR + 0,4% albumine de sérum bovin (Sigma A2153). </td></tr><tr><td> (D) Locas (Low Ca 2 Solution +) (en mM) </td><td> NaCl 100, 2 KCl, 0,05 CaCl 2, 0,05 MgCl 2, 3 Glucose, 30 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (E) Locas + papaïne </td><td> Locas + 0,05% de L-cystéine (Sigma c1276) papaïne + 0,2% (Sigma P3375). </td></tr><tr><td> (F) K +-solution interne (en mM) </td><td> 52 K 2 SO 4,38 KCl, 1 K +-EGTA, 5 K +-HEPES, pH 7,3. </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Solutions.

patch clamp recordings in inner ear hair cells isolated from zebrafish

Analyses de patch-clamp des canaux voltage-dépendants dans des cellules ciliées sensorielles isolées d&#39;une variété d&#39;espèces ont été décrites précédemment 1-4, mais cette vidéo est la première application de ces techniques aux cellules ciliées de poisson zèbre. Ici, nous démontrons une méthode pour isoler les cellules saines intactes cheveux de toutes les oreille interne organes terminaux: saccule, lagena, utricule et les canaux semi-circulaires. De plus, nous démontrons la diversité de la taille et de la morphologie des cellules ciliées et de donner un exemple des types d&#39;enregistrements de patch-clamp qui peuvent être obtenus. L&#39;avantage de l&#39;utilisation de ce système de modèle de poisson zèbre sur les autres découle de la disponibilité de mutants poisson-zèbre qui affectent à la fois l&#39;audition et de l&#39;équilibre. En combinaison avec l&#39;utilisation de lignées transgéniques et d&#39;autres techniques qui utilisent l&#39;analyse génétique et la manipulation, l&#39;isolement cellulaire et les méthodes électrophysiologiques présenté ici devrait faciliter une meilleure idée des rôles dans les cellules de cheveux préside dans la médiation de ces modalités sensorielles.

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Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Le but de cette vidéo est de montrer les procédures d&#39;obtention de cellules saines intactes cheveux des organes de l&#39;oreille interne du poisson zèbre adulte, puis de les utiliser pour les études de patch-clamp visant à caractériser les propriétés biophysiques de leurs canaux voltage-dépendants.

Les enregistrements de patch-clamp en cellules ciliées de l&#39;oreille Isolé du poisson zèbre

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

patch-clamp-recordings-in-inner-ear-hair-cells-isolated-from-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K vues.  Pepperdine University. Le but de cette vidéo est de montrer les procédures d'obtention de cellules saines intactes cheveux des organes de l'oreille interne du poisson zèbre adulte, puis de les utiliser pour les études de patch-clamp visant à caractériser les propriétés biophysiques de leurs canaux voltage-dépendants.

Vidéo: Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l&#39;obscurité Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

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Neurosciences

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Jumelés Recordings Patch Clamp du motoneurone et de muscle ciblé squelettiques chez le poisson zèbre

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the postsynaptic activity of a single ribbon synapse 1-4. Ribbon synapses of sensory cells release neurotransmitter continuously, the rate of which is modulated in response to graded changes in IHC membrane potential 5. Ribbon synapses have been shown to operate by multivesicular release, where multiple vesicles can be released simultaneously to evoke excitatory postsynaptic currents (EPSCs) of varying amplitudes 1, 4, 6-11. Neither the role of the presynaptic ribbon, nor the mechanism underlying multivesicular release is currently well understood.
The IHC is innervated by 10-20 auditory nerve fibers, and every fiber contacts the IHC with a unmyelinated single ending to form a single ribbon synapse. The small size of the afferent boutons contacting IHCs (approximately 1 &mu;m in diameter) enables recordings with exceptional temporal resolution to be made. Furthermore, the technique can be adapted to record from both pre- and postsynaptic cells simultaneously, allowing the transfer function at the synapse to be studied directly 2. This method therefore provides a means by which fundamental aspects of neurotransmission can be studied, from multivesicular release to the elusive function of the ribbon in sensory cells.

Whole-cell patch-clamp recordings from auditory nerve fiber dendrites at the inner hair cell ribbon synapse in the mammalian cochlea.

Enregistrements postsynaptiques au dendrites afférentes Contacter cochléaires cellules ciliées internes: Communiqué multivésiculaires surveillance à une synapse ruban

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isoler LacZ cellules exprimant des tissus de la souris oreille interne par cytométrie en flux

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Transfert de gènes à l&#39;oreille de souris en développement intérieur par<em&gt; In Vivo</em&gt; Électroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch-clamp enregistrements de cellules embryonnaires de poisson zèbre Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcellulaires Recordings Patch-clamp du Domaine somato de nigrales Dopamine Neurones

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...