Les auteurs tiennent à remercier Ina Wolter pour son excellente assistance technique. VGAT-Vénus rats transgéniques ont été générées par les Drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi et Y. Kawaguchi à l&#39;Institut national de sciences physiologiques, Okazaki, Japon, utilisant pCS2-Vénus fourni par le Dr A. Miyawaki.

Déclaration éthique: toutes les procédures et animale entretien ont été effectués conformément aux directives institutionnelles, la loi allemande sur la protection des animaux, la directive européenne 86/609 / CEE relative à la protection des animaux, et des directives des autorités locales (Berlin, T-0215/11 ) 1 Préparation de tranches aiguë-hippocampiques <ol><li> Prenez un rat transgénique (17 à 24 jours), l&#39;expression de la protéine fluorescente Venus / YFP sous le promoteur de VGAT, qui marque la majorité des interneurones inhibiteurs corticaux 13. Décapiter le rat. Rapidement disséquer le cerveau (&lt;40 sec) dans semifrozen, carbogenated (95% O 2, CO 2/5%) à base de saccharose liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF saccharose, figure 1A). </li><li> Évaluer le cerveau de rat disséqué pour Venus / YFP fluorescence avec une lampe 505 nm et 515 filtre d&#39;émission LED, monté sur une paire de lunettes. </li><li> Retirer la troisième frontale du cortex et CerebEllum; puis de séparer les hémisphères, le tout avec un scalpel. Retirer la face dorsale du cortex pour fournir une surface plane pour coller le cerveau vers le bas, comme décrit précédemment 14. </li><li> Couper des tranches transversales (300 um) de la formation hippocampique sur un vibratome, les hémisphères doivent être entourés d&#39;semifrozen, carbogenated saccharose ACSF (figure 1B) 14. Retirer régions supplémentaires du cortex rostral, le mésencéphale et le tronc cérébral. Transfert de chaque tranche dans une chambre de retenue immergé ACSF contenant du saccharose, qui est carbogenated et chauffé à 35 ° C. </li><li> Laissez les tranches de récupérer à 35 ° C pendant 30 min à partir du moment de la dernière tranche entrer dans le ACSF réchauffé. Pour ce faire, dans le but de réactiver les processus métaboliques et de faciliter la refermeture de processus neuronaux coupées. Puis transfert à la température ambiante pour le stockage (figure 1C). </li></ol> 2. fabrication et de remplissage de pipettes d&#39;enregistrement <ol><li> PuLes pipettes de patch ll de capillaires en verre, de sorte qu&#39;une résistance à la pipette de 2-4 MQ est réalisé quand il est rempli avec filtré (filtre de seringue, taille des pores: 0,2 um) solution intracellulaire contenant 0,1% de la biocytine (pour le marquage intracellulaire). Conserver la solution intracellulaire refroidi sur de la glace pour empêcher la dégradation de ses constituants. </li><li> Remplissez les pipettes de patch pour l&#39;identification des courants post-synaptiques avec une solution contenant un Cl faible physiologiquement pertinente - concentration (E R (Cl) = -61 mV; voir la liste de la solution). </li><li> Pour les enregistrements appariés pour identifier les réponses médiées par des récepteurs présynaptiques, remplir les pipettes de patch avec une solution intracellulaire de faible capacité Ca2 + tampon pour éviter les interférences avec l&#39;émetteur de presse pré-synaptique, ainsi que 4 fois plus élevée concentration de Cl - (E R (Cl) = -20 mV) pour améliorer le rapport signal-bruit de CISP observées 5 permettant une évaluation précise de resp pharmacologiqueonsiveness. Notez que la modification concentration de Cl - peut modifier la cinétique IPSC 15. </li></ol> 3 cellules entières Patch-clamp enregistrement de FS-IN <ol><li> Carbogenate l&#39;ACSF et alimenter par l&#39;intermédiaire du système de perfusion à la chambre d&#39;enregistrement, au moyen d&#39;une pompe péristaltique (ce qui supprime également l&#39;ACSF à partir de la chambre d&#39;enregistrement à travers une conduite d&#39;aspiration, la figure 2A). Mettre tous les appareils de la configuration en cours de préparation pour l&#39;enregistrement. </li><li> Transférer une tranche de la chambre d&#39;enregistrement et maintenir en place avec un anneau de platine enfilées avec des fibres simples de soie. Positionner la tranche de telle sorte que la couche pyramidale (str.) De CA1 s&#39;étend verticalement à travers le champ de vision, ce qui permet l&#39;accès aux deux pipettes à la fois la str. radiatum et str. oriens simultanément (figures 2C et 4A). </li><li> Placer la chambre dans la configuration et commencer la perfusion de carbogenated et chauffée (32-34 ° C) Un enregistrementCSF à un taux de 5 à 10 ml / min. </li><li> Évaluer la qualité de coupe sous l&#39;optique IR-DIC à un grossissement de 40X objectif, et visualiser avec une caméra CCD vu sur un écran. Présumer de la bonne qualité de la tranche si un grand nombre de cellules rondes, modérément contrastées CA1 pyramidales CA1 (PC) peut être vu dans str. pyramidale à des profondeurs de 20-30 um ci-dessous une surface lisse et légèrement cratères (figure 2C). Pauvres tranches de qualité contiennent un grand nombre de très contrastées, les cellules ratatinées ou gonflées, avec une surface de tranche inégale. </li><li> Identifier FS putatifs interneurones sous un éclairage à épifluorescence que ceux exprimant Vénus / YFP (figure 2B), avec une grande soma multipolaire dans ou près de la str. pyramidale. Sélectionnez les cellules raisonnablement profonde au sein de la tranche (50-100 um, figure 2C) afin de mieux préserver leur intégrité morphologique. </li><li> Monter l&#39;électrode d&#39;enregistrement dans le support de pipette sur la headstage; alors l&#39;applicationment une faible pression positive (20 à 30 mbar) à travers la ligne de tube. Abaisser la pipette à la surface de la tranche, légèrement décalé vers le centre du neurone sélectionné. </li><li> Obtenir la configuration d&#39;enregistrement cellule entière comme décrit précédemment 14,16 et voir également les figures 2D et 2E: <ol><li> Cibler une cellule: Augmenter la pression à 70-80 mbar et abaisser rapidement la pipette par la tranche juste au-dessus du soma de la cellule sélectionnée (figure 2D, en haut). </li><li> Approche de la cellule: Appuyez sur la pipette contre la membrane cellulaire pour produire une «fossette» sur elle (figure 2D, en haut). Effectuez cette étape rapidement, afin d&#39;éviter l&#39;étiquetage biocytine de cellules voisines. </li><li> Créer un joint gigaohm: Relâchez la pression et appliquer simultanément une commande de 20 mV tension à la pipette. Un joint giga-ohms (1-50 GQ; figure 2D, le fond et la figure 2E milieu) typicallié se développe rapidement. Une fois scellé, appliquer le potentiel membranaire de repos attendu (typiquement entre -70 et -60 mV) en tant que commande de tension. </li><li> Brisez le patch: Une fois scellé, la rupture de la pièce de membrane avec une brève impulsion de pression négative; réalisant ainsi la configuration cellule entière (Figure 2E, en bas). </li></ol></li><li> Compenser la capacité de cellule entière et de la résistance série (R S). R s est normalement 5-20 MQ et stable jusqu&#39;à 120 min. Abandon cellules si le potentiel (V M) de la membrane sur la percée est plus dépolarisée à -50 mV; R S est initialement supérieure à 30 MQ; ou R S changements de plus de 20% au cours de l&#39;enregistrement. </li><li> Identifier FS-ins par leur réponse (en mode courant-clamp) à une famille de l&#39;hyper à la dépolarisation des impulsions de courant (-250 à 250 pA, figure 2F, en haut). FS-ins ont relativement dépolarisé V M (typiquement -50 to -60 mV), courte membrane constante de temps (&lt;20 ms) et répondre à une 500 pA dépolarisants injection de courant avec un train de potentiels d&#39;action (PA) à des fréquences&gt; 100 Hz 11 (figure 2F, en bas), qui sont nettement différents de ceux de CA1 PC (Figure 2F, milieu). </li></ol> 4. extracellulaire stimulation électrique à susciter des réponses GABA B R médiation <ol><li> Pour observer les réponses synaptiques évoqués, placer une électrode de stimulation extracellulaire (une pipette de patch rempli de 2 M de NaCl; Résistance: 0,1-0,3 MQ) dans la tranche à la frontière de str. radiatum et str. lacunosum-moleculare. Positionner l&#39;électrode 200 à 300 um de la soma latérale pour empêcher une stimulation électrique directe de la cellule et de réduire au minimum les artefacts de stimulation (figure 3A). </li><li> Une fois que l&#39;électrode de stimulation est positionnée, obtenir l&#39;enregistrement de cellules entières dela cellule choisie et évaluer le phénotype physiologique en mode courant pince comme dans la section 3.9 (figure 3B). </li><li> Avec le neurone enregistré dans voltage-clamp (V M -65 mV), délivrer une stimulation électrique des axones présynaptiques à 50 V (~ 500 uA stimulus efficace) toutes les 20 secondes, en utilisant un stimulateur de tension constante isolé. Utilisez unique stimuli (100 ps durée, la figure 3C, en haut) pour observer GABA B R CISP médiation, et s&#39;imbriquent avec des trains de multiples stimuli (à 200 Hz) afin de produire une plus grande version de l&#39;émetteur. </li><li> Bain s&#39;applique antagonistes des récepteurs ionotropiques du glutamate (récepteur d&#39;AMPA: DNQX [10 uM]; récepteur NMDA: D-AP5 [50 uM]) pour révéler la CISP monosynaptique isolé (Figure 3C, supérieur au milieu). Isoler davantage l&#39;IPSC GABA B R-médiation avec l&#39;application d&#39;un bloqueur GABA A R (gabazine [10 uM]; figure 3C de l milieutournesol). </li><li> Confirmez la résultante lente courant sortant (figure 3C inférieur, élargi) comme étant GABA B R-médiée par l&#39;application ultérieure de CGP-55845 [5 uM] (figure 3C inférieur, reposant en gris) </li></ol> 5. jumelés enregistrements de synapses couplés FS-IN et CA1 PC <ol><li> Évaluer le contrôle présynaptique GABA B R médiation de la transmission synaptique inhibitrice des enregistrements simultanés, réalisées entre synapses couplés paires IN et PC comme décrit ci-dessous. </li><li> Tout d&#39;abord, établir un enregistrement cellule entière d&#39;une interneurones présynaptique (comme dans la section 3) et confirmer le phénotype de FS (figure 4A). </li><li> Puis de relier un PC CA1 voisin (20-100 um Distance, figure 4A) et exercez une brève dépolarisation supraliminaire impulsions de courant (1 msec, 1-5 nA amplitude) à la présynaptique IN (tenue en mode courant-clamp) pour obtenir des points d&#39;accès. Si un co synaptiquennection est présent, les points d&#39;accès dans le résultat IN dans CISP dans le CA1 PC, qui s&#39;est tenue en tension de serrage (compenser R S à environ 80%). </li><li> Si nécessaire, remplir une nouvelle électrode d&#39;enregistrement et enregistrer à partir d&#39;autres ordinateurs CA1 jusqu&#39;à ce qu&#39;une connexion soit trouvée. </li><li> Une fois la connexion établie, obtenir des paires de points d&#39;accès dans le présynaptique FS-IN pour évaluer à la fois la réponse synaptique unitaire et le comportement dynamique. Utilisation d&#39;un protocole typique double choc de deux stimuli dépolarisants avec un intervalle de 50 ms (figure 4B). </li><li> Recueillir des traces de contrôle dans les conditions de base. Ensuite, appliquer les baclofène R agonistes GABA B sélectifs (10 uM) à l&#39;ACSF perfusion, activant ainsi GABA B Rs, suivis par l&#39;antagoniste CGP-55845 (5 M), pour bloquer complètement les effets des récepteurs médiation. Recueillir ~ 50 traces pendant l&#39;état d&#39;équilibre de chaque condition de drogue (figure 4B et C). </li><li> Une fois l&#39;enregistrement terminé, sceller la membrane somatique en formant un outside-out patch: retirer lentement la pipette à partir du corps de la cellule en V-clamp et les R S augmente, réduire le V M à -40 mV. Pour ce faire, afin de faciliter la formation du patch outside-out; puis retirer la pipette de la salle de bain. </li></ol> 6 Analyse des propriétés électrophysiologiques <ol><li> REMARQUE: Une multitude de logiciels différents sont disponibles pour l&#39;acquisition de données électrophysiologiques. Ici, WinWCP, un programme Windows dans le forfait gratuit Strathclyde électrophysiologie logiciel est utilisé, ce qui permet d&#39;enregistrer jusqu&#39;à 16 canaux d&#39;entrées analogiques et une sortie de 10 signaux numériques. </li><li> Filtre passe-bas de toutes les données à 5-10 kHz et à 20 kHz échantillon. </li><li> Analyser les données physiologiques avec une analyse bains hors ligne. REMARQUE: Stimfit, un logiciel open source qui comprend une enveloppe de Python, est utilisé dans ce cas; cependant, d&#39;autres alternatives peuvent facilement être utilisés à la place. <ol><li> Analyser passive membrane propriétés des neurones enregistrées, acquises en pince ampèremétrique, du potentiel de membrane au repos. </li><li> Mesurer la moyenne du potentiel de membrane au repos de la ligne de base des réponses enregistrées à partir du début de l&#39;enregistrement. </li><li> Calculer la résistance d&#39;entrée, en utilisant la loi d&#39;Ohm, à partir de la réponse de tension à la plus petite des impulsions de courant d&#39;hyperpolarisation (≤ -50 Pa). Pour améliorer le rapport signal sur bruit, des traces multiples moyens. Remarque: les exemples sont généralement des moyennes de 10-50 balayages individuels. </li></ol></li><li> Estimer le temps de membrane apparente constante en ajustant une courbe monoexponentielle à la désintégration des réponses aux petites impulsions de courant hyperpolarisants. </li><li> Analyser l&#39;action onde potentiel pour déterminer le seuil, amplitude (seuil à crête) et la durée (largeur mesurée à mi-hauteur) provoquée par niveau de seuil de dépolarisation des impulsions de courant. </li><li> Analyser GABA B R CISP médiation à partir d&#39;enregistrements tension de serrage. Filtre retrace off-line à500 Hz (filtre gaussien) et d&#39;évaluer l&#39;amplitude de crête et la latence de la réponse à médiation par GABA B de R (en moyenne d&#39;au moins 10 traces). </li><li> Détecter l&#39;effet de GABA B Rs inhibitrice sur la production de IN comme un changement dans l&#39;amplitude de crête des CPSI GABA A R médiées mesurées entre le pic et le niveau de référence précédent. Calculer l&#39;amplitude moyenne de ≥50 traces de la période de contrôle et l&#39;état d&#39;équilibre de toutes les époques pharmacologiques. </li></ol> 7 Visualisation et Immunocytochemistry de FS-Ins <ol><li> Après les enregistrements, fixer les tranches par immersion dans du paraformaldéhyde 4% avec 0,1 M de tampon phosphate (PB, pH = 7,35) O / N à 4 ° C. </li><li> Si les tranches nécessaires peuvent être transférées à PB et stockés jusqu&#39;à environ 1 semaine avant le traitement. </li><li> Tranches Laver abondamment à PB frais et suite à 0,025 M PB NaCl à 0,9% (PBS, pH = 7,35). </li><li> Pour réduire anticorps liaison non spécifique, bloquer les tranches for 1 heure à température ambiante dans une solution contenant 10% de sérum normal de chèvre (NGS), 0,3% de Triton-X100 (un détergent pour perméabiliser les membranes) et 0,05% de NaN3, composé dans du PBS. </li><li> Pour étiqueter l&#39;expression de PV, en utilisant un anticorps monoclonal de souris anti-PV dilué dans une solution contenant 5% de NGS, 0,3% de Triton-X100, 0,05% de NaN3 dans du PBS. Incuber les anticorps primaires pendant 2-3 jours à 4 ° C 12. Rincer soigneusement les tranches dans du PBS. </li><li> Appliquer des anticorps secondaires anti-souris fluorescents (par exemple, AlexaFluor-546.) Avec la streptavidine-protéine de liaison de biotine conjugué à un fluorochrome (par exemple, AlexaFluor-647); et incuber dans une solution contenant 3% de NGS, 0,1% de Triton-X100, 0,05% de NaN3, dilué dans du PBS et incubation O / N à 4 ° C. </li><li> Rincer généreusement les tranches 2-3 fois avec du PBS suivi par 2-3 rinçages dans PB. Montez les tranches sur des lames de verre. Utilisez un 300 um agar entretoise pour empêcher la tranche de s&#39;effondrer. Tranches lamelle avec un fluocent milieu de montage et joint avec vernis à ongles. </li></ol> 8. imagerie et la reconstruction de Visualized FS-Ins <ol><li> Visualisez les tranches à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal à balayage, avec le journaliste fluorochome excité avec la ligne laser approprié (diode laser 635 nm pour AlexaFluor-647; hélium-néon 543 nm pour AlexaFluor-546 étiquetage des PV et Argon 488 ou 515 nm pour Venus / YFP). </li><li> Prendre des images à une résolution en Z approprié (typiquement de 0,5 à 1 um d&#39;étapes, en utilisant un objectif 20X) afin de produire une pile en Z de la cellule entière. Piles multiples sont normalement requis pour l&#39;image de la cellule entière, qui peut être numériquement cousu hors ligne à l&#39;aide FIDJI / logiciel ImageJ (figure 5A). </li><li> Reconstruire la cellule de la pile d&#39;images cousu au moyen d&#39;une méthode de suivi semi-automatique (simple plug-in Neurites Tracer dans le progiciel FIDJI / ImageJ 17, Figure C). </li><li> Enfin, évaluer le PV-immunoréactivité de l&#39;interneuron avec une lentille d&#39;objectif à grande ouverture numérique (60X silicium-immersion, NA = 1,3). Faire des images de la soma, dendrites proximales et axone proximal, ou encore de terminaisons axonales si lavage somatique de PV est trop fort. Les cellules sont considérées comme immunoréactive pour PV si l&#39;immuno-marquage est visible à aligner avec les structures de biocytine marquée (Figure 5B). </li></ol>

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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+recording+in+brain+slices+with+improved+slicer+technology.">Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology.</a> Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).</li><li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+enhancement+shown+by+whole-cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices.">Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346, 177-180 (1990).</li><li>Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shunting+inhibition+improves+robustness+of+gamma+oscillations+in+hippocampal+interneuron+networks+by+homogenizing+firing+rates.">Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates.</a> Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).</li><li>Neu, A., F&#246;ldy, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+origin+of+CB1-dependent+tonic+inhibition+of+GABA+release+at+cholecystokinin-positive+basket+cell+to+pyramidal+cell+synapses+in+the+CA1+region+of+the+rat+hippocampus.">Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).</li><li>Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoreactivity+for+the+GABAA+receptor+alpha1+subunit,+somatostatin+and+Connexin36+distinguishes+axoaxonic,+basket,+and+bistratified+interneurons+of+the+rat+hippocampus.">Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus.</a> Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous décrivons une méthode qui combine des techniques de neuro-anatomiques et électrophysiologiques à la caractérisation fonctionnelle des neurones morphologically- et neurochimique identifiés in vitro; notamment les divers types de IN inhibiteurs corticaux. Les principaux aspects de la procédure sont les suivantes: (1) pré-sélection des potentiels IN; (2) l&#39;enregistrement intracellulaire et le neurone visualisation; et enfin (3) l&#39;analyse morphologique et immunocytochimique de IN enregistrées. Bien qu...

Circuits neuronaux de l&#39;hippocampe ont longtemps fait l&#39;objet d&#39;un examen minutieux, par rapport à l&#39;anatomie et de la physiologie, en raison de leur rôle essentiel dans l&#39;apprentissage et la mémoire, ainsi que la navigation spatiale chez les humains et les rongeurs. De même, l&#39;organisation laminaire de premier plan, mais simplement de l&#39;hippocampe fait de cette région un sujet de prédilection des études portant sur les propriétés structurales et fonctionnelles des réseaux corticaux. Circuits de l&#39;hippocampe sont constitués de cellules excitateurs principaux (&gt; 80%) et un plus petit (10-20%), mais la cohorte très diversifié d&#39;interneurones inhibiteurs 1-3. Interneurones libèrent de l&#39;acide γ-aminobutyrique (GABA) de leurs terminaux des axones qui agit à ionotropes rapide récepteurs GABA A (GABA A R) et lents métabotropiques GABAB récepteurs GABA (B R) 4. Ces mécanismes inhibiteurs contrebalancer excitation et de réguler l&#39;excitabilité des cellules principales, et donc lamoment de ir et le modèle de décharge. Cependant, les interneurones GABA libéré agit non seulement sur ​​les cellules principales, mais également sur ​​les interneurones 5,6 eux-mêmes. Récepteurs post-synaptiques et pré médiation régulation par rétroaction et interactions mutuelles inhibitrices entre les différents types de interneurones. Ces mécanismes inhibiteurs dans les réseaux des interneurones sont soupçonnés d&#39;être au cœur de la production et la mise en forme des modèles d&#39;activité de la population, en particulier les oscillations à des fréquences différentes 7. Cellule entière enregistrement patch-clamp est une méthode bien établie pour l&#39;examen des propriétés intrinsèques et les interactions synaptiques des neurones. Toutefois, en raison de la grande diversité des types de interneurones, enquête sur les interneurones inhibiteurs exige l&#39;identification rigoureuse des cellules enregistrées. Comme types de interneurones hippocampiques sont caractérisés par des éléments particuliers morphologiques et l&#39;expression du marqueur neurochimique, anatomique combinée et immunocytochimique eXAMEN peut fournir un moyen de déterminer précisément 6,8,9 identité des interneurones. Dans le présent article, nous décrivons une approche expérimentale dans laquelle des cellules entières enregistrements de patch-clamp de neurones simples ou paires synaptique couplés sont combinés avec marquage intracellulaire, suivie par analyse post-hoc morphologique et immunocytochimique, permettant la caractérisation de la lenteur GABA B médiée par le récepteur des effets inhibiteurs dans les interneurones identifiés. A titre d&#39;exemple, nous nous concentrons sur un type majeur de interneurones, un sous-ensemble de ce qu&#39;on appelle les «cellules de panier&quot; (de la Colombie-Britannique), qui innerve les soma et proximale des dendrites de ses objectifs post-synaptiques et se caractérise par un &quot;dopage rapide» (FS) décharger motif, recouvrant un axone forte densité de la couche de corps de la cellule, et l&#39;expression de la protéine parvalbumine de liaison du calcium (PV) 10,11. Ces interneurones présentent d&#39;importants courants postsynaptiques inhibiteurs, ainsi que des pré proéminentmodulation synaptique de leur sortie synaptique, en réponse à l&#39;activation GABA B R 12. La combinaison des techniques décrites ici peut être appliqué aussi bien pour étudier les mécanismes intrinsèques ou synaptiques dans une variété d&#39;autres types de neurones identifiés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="725">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:175px;">Name</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:152px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Transgenic vGAT-venus rats</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">see Uematsu et al., 2008</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Venus (515&#160;nm) goggles</td>
			<td style="width:148px;">BLS Ltd., Hungary</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:148px;">i.e. FST</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">For brain removal</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Vibratome</td>
			<td style="width:148px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">VT1200S</td>
			<td style="width:251px;">Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Slice holding chambers</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Custom-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Upright IR-DIC microscope</td>
			<td style="width:148px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:152px;">BX50WI</td>
			<td style="width:251px;">With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">CCD camera</td>
			<td style="width:148px;">Till Photonics</td>
			<td style="width:152px;">VX55</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">505 nm LED system</td>
			<td style="width:148px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:152px;">OptiLED system</td>
			<td style="width:251px;">Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Multiclamp 700B&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:251px;">Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">WinWCP acquisition software</td>
			<td style="width:148px;">John Dempster, Strathclyde University</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Electrode Puller</td>
			<td style="width:148px;">Sutter</td>
			<td style="width:152px;">P-97</td>
			<td style="width:251px;">Used with box-filament</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Borosilicate pipette glass</td>
			<td style="width:148px;">Hilgenberg, Germany</td>
			<td style="width:152px;">1405020</td>
			<td style="width:251px;">2&#160;mm outer, 1&#160;mm inner diameter, no filament</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:148px;">Gilson</td>
			<td style="width:152px;">Minipuls</td>
			<td style="width:251px;">Other pumps or gravity feed could be used instead</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Digital Thermometer</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Custom made</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Digital Manometer</td>
			<td style="width:148px;">Supertech, Hungary</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:175px;">Isolated constant voltage stimulator</td>
			<td rowspan="2" style="width:148px;">Digitimer, Cambridge</td>
			<td rowspan="2" style="width:152px;">DS-2A</td>
			<td rowspan="2" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:175px;"><a name="RANGE!A19:D34">Biocytin</a></td>
			<td rowspan="2" style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="2" style="width:152px;">B1592</td>
			<td rowspan="2">Otherwise known as &#949;-Biotinoyl-L-Lysine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">DL-AP5(V) disodium salt</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120271</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">DNQX disodium salt</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120169</td>
			<td style="width:251px;">Alternatively NBQX or CNQX</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Gabazine (SR95531)</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120042</td>
			<td style="width:251px;">Alternatively bicuculline methiodide</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">R-Baclofen</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120325</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">CGP-55,845 hydrochloride</td>
			<td style="width:148px;">Tocris</td>
			<td style="width:152px;">1248</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Streptavidin 647</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">S32357</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">anti-PV mouse monoclonal antibody</td>
			<td style="width:148px;">Swant, Switzerland</td>
			<td style="width:152px;">235</td>
			<td style="width:251px;">Working concentration 1:5000-1:10,000</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">anti-mouse secondary antibody&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">A11030</td>
			<td style="width:251px;">If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:148px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:152px;">S-1000</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Microscopy slides</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Any high quality brand&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Usually 22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Agar spacers</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Agar block, cut on vibratome to 300 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:152px;">Fluoview FV1000</td>
			<td style="width:251px;">Or other comparable system</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Fiji (Fiji is just ImageJ)</td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">See Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons

Interneurones inhibiteurs GABAergiques jouent un rôle central dans les circuits neuronaux du cerveau. Interneurones comprennent un petit sous-ensemble de la population neuronale (10-20%), mais montrent une grande hétérogénéité physiologique, morphologique et neurochimique, reflétant leurs diverses fonctions. Par conséquent, l&#39;enquête des interneurones fournit des renseignements importants sur les principes de l&#39;organisation et de la fonction des circuits neuronaux. Ceci, cependant, nécessite une approche physiologique et neuro-anatomique intégré pour la sélection et l&#39;identification des types individuels des interneurones. Cellules entières d&#39;enregistrement de tranches de cerveau aiguës d&#39;animaux transgéniques, exprimant des protéines fluorescentes dans les promoteurs de marqueurs spécifiques d&#39;interneurones patch-clamp, fournit une méthode efficace pour cibler et électrophysiologique caractériser les propriétés intrinsèques et synaptiques des types des interneurones spécifiques. Combiné avec intracellulaire étiquetage de colorant, cette approche peut être étendue avec post-hoc moanalyse rphological et immunocytochimique, permettant une identification systématique des neurones enregistrés. Ces méthodes peuvent être adaptés à un large éventail de questions scientifiques concernant les propriétés fonctionnelles des divers types de neurones corticaux.

À condition que la qualité de coupe est sensiblement bon, l&#39;enregistrement à la fois CA1 PC et FS-IN peut être réalisé avec un minimum de difficultés. La ligne de rat transgénique exprimant Vénus / YFP sous le promoteur de VGAT 13 ne permet pas d&#39;identifier sans équivoque FS-IN, voire BC. Cependant enregistrements de IN dans et autour de str. pyramidale, où la densité de FS-IN est généralement élevé 1, entraîne une forte probabilité de sélection FS-IN (fi...

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Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Réseaux corticaux sont contrôlés par un petit, mais diversifié ensemble des interneurones inhibiteurs. Exploration fonctionnelle des interneurones nécessite donc l&#39;enregistrement ciblée et identification rigoureuse. Décrit ici est une approche combinée impliquant des enregistrements de cellules entières de paires simples ou synapses de neurones couplés avec marquage intracellulaire, post-hoc morphologique et l&#39;analyse immunocytochimique.

De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

whole-cell-patch-clamp-recordings-from-morphologically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.3K vues.  Charité Universitätmedizin.  Réseaux corticaux sont contrôlés par un petit, mais diversifié ensemble des interneurones inhibiteurs. Exploration fonctionnelle des interneurones nécessite donc l'enregistrement ciblée et identification rigoureuse. Décrit ici est une approche combinée impliquant des enregistrements de cellules entières de paires simples ou synapses de neurones couplés avec marquage intracellulaire, post-hoc morphologique et l'analyse immunocytochimique. 

Vidéo: Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l&#39;obscurité Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Recherche

Neurosciences

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Jumelés Recordings Patch Clamp du motoneurone et de muscle ciblé squelettiques chez le poisson zèbre

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Les enregistrements de patch-clamp en cellules ciliées de l&#39;oreille Isolé du poisson zèbre

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Whole Patch Clamp cellulaire pour étudier les mécanismes de la stimulation neurale infrarouge

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch-clamp enregistrements de cellules embryonnaires de poisson zèbre Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Appariés enregistrements de cellules entières dans organotypiques coupes d&#39;hippocampe

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcellulaires Recordings Patch-clamp du Domaine somato de nigrales Dopamine Neurones

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Enregistrements de patch-clamp à cellules entières pour la détermination électrophysiologique de la sélectivité ionique dans les canarhodopsines

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

Réponse auditif du tronc cérébral et des cellules ciliées externes Whole-cell Patch Clamp enregistrement chez le rat Postnatal

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...