Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du laboratoire Ricke, passés et présents. Nous remercions Calvin Patten, Jr., DVM et Brigitte Raabe, DVM, des commentaires utiles sur le protocole. Nous tenons à remercier le NIDDK, NCI, et NIEHS pour leur soutien financier pour ces études: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN est un stagiaire dans le Programme de formation scientifique médicale à l&#39;Université de Rochester financé par le NIH GM07356 T32, le NIH sous Ruth L. Kirschstein Prix national F30DK093173 Service de recherche soutient également ce projet. CDV est soutenu par T32CA157322 et ABT est soutenu par T32ES007015 à l&#39;Université de Wisconsin-Madison. Le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Institut national des sciences médicales générales ou NIH.

Une. Préparation de comprimé d&#39;hormone / Drug Pellet <ol><li> Cette procédure doit être effectuée sous une hotte de sécurité chimique tout en portant une blouse de laboratoire, des gants, un masque, des lunettes de sécurité, et le chapeau. Pour éviter toute contamination croisée, il est essentiel que l&#39;équipement de fabrication de granulés est nettoyé à fond avec de l&#39;éthanol 70% avant et après la fabrication de chaque type de pastille. </li><li> En utilisant une échelle d&#39;analyse et de peser papier, mesurer la quantité désirée de poudre d&#39;hormone / médicament. Environ 5% de matière supplémentaire est recommandé pour accueillir perte pendant le pressage. </li><li> Certains médicaments nécessitent des hormones / un agent de liaison ou agent de remplissage, qui est mélangé avant d&#39;un culot fabrication. Par exemple, pour la fabrication d&#39;une pastille de 2,5 mg de 17β-estradiol, l&#39;hormone combiner avec 22,5 mg de cholestérol, ce qui résulte en une pastille de 25 mg. </li><li> Soigneusement transférer en jeu de matrices, lieu dans la presse et poussez le levier fermement pour comprimer culot. Utilisez une pression constante pour maintenir constante la surface sontà un rapport en volume. </li><li> Suivant inverser le porte-matrice et pousser le levier vers le bas à nouveau pour libérer le culot. </li><li> Inspectez culot de l&#39;intégrité et de déterminer si la masse finale est à portée souhaitée. Une plage acceptable est une différence de ± 5% de la masse finale (par exemple, une plage acceptable pour une pastille de 25 mg est de 23,8 à 26,3 mg). </li><li> Pellets peuvent être faites avant la chirurgie et stockés (conditions et la durée de stockage dépend de la stabilité de l&#39;hormone ou médicament utilisé dans la fabrication de granulés). pastilles d&#39;hormones peuvent être achetés comme une alternative à la fabrication culot. Achat granulés évite l&#39;utilisation de médicaments de qualité inférieure pharmaceutiques car ils seront formulées et aggravés. </li></ol> 2. Préparation de cellules recombinantes xénogreffes <ol><li> Récolte et culture primaire souris mésenchyme urogénital (UGM) des cellules stromales de moins de 4 semaines avant d&#39;être recueilli pour le comptage. </li><li> Culture des lignées cellulaires immortalisées épithéliale de la prostate dans le fash habituelion et de recueillir pour le comptage. Pour cet exemple, la préparation de greffons cellulaires recombinantes par mélange de 100 000 cellules HPB-1 épithéliales par greffage avec 250 000 cellules stromales UGM par greffage en suspension. </li><li> cellules à granules ensemble et re-suspendre suffisamment Type neutralisé une queue de rat collagène pour faire nombre désiré de greffons, chacun dans un volume de 25 pi à 50 pi. </li><li> Réglez greffes recombinants à 37 ° C pendant 15 minutes et puis couvrir avec un milieu de croissance pour le stockage à 37 ° C pendant jusqu&#39;à 48 heures avant la greffe. </li></ol> 3. Préparation de xénogreffes de tissus <ol><li> Maintenir les précautions universelles pour pathogènes à diffusion hématogène pendant l&#39;obtention de tissus et de la procédure chirurgicale. Après l&#39;approbation du comité d&#39;examen institutionnel et consentement éclairé, obtenir des tissus de la prostate frais de résection chirurgicale. Pour les études de la croissance de la BPH, les tissus peuvent être récoltées à partir de la résection transurétrale de la prostate ou de prostatectomie procédures simples. Xénogreffes primaires d&#39;érythroblastopénie ou prost bénignemangé tissu peut être obtenue à partir d&#39;échantillons de prostatectomie radicale. </li><li> Magasin récolté tissu dans les médias de cellules tamponnées isotoniques ou une solution saline normale sur la glace. En fonction des conditions de tissus et de stockage, les échantillons peuvent être stockés pendant jusqu&#39;à 24 heures avant la préparation de greffons tissulaires. La pratique courante consiste à diviser l&#39;échantillon en trois morceaux, avec une partie fixe dans le formol et systématiquement traités pour l&#39;histologie, une pièce congelé instantanément pour l&#39;analyse moléculaire et une pièce divisée en xénogreffes de tissus (1-3 mm en taille). </li></ol> 4. Préparation du feu poli verre pipette <ol><li> Le port de gants résistants aux lunettes de protection, blouse de laboratoire et de la chaleur, le lieu verre Pasteur pointe de la pipette dans le bec Bunsen flamme à un angle d&#39;environ 60 ° pour commencer. </li><li> Gardez un, léger mouvement constant à la pipette de manière à éviter les points chauds. </li><li> Dessiner la pointe fine et feu-polissez l&#39;objectif étant une fin légèrement incurvé avec une forme arrondie, fermée pointe. </li></ol&gt; 5. Préparation des instruments et bloc opératoire <ol><li> Autoclave tous les instruments. Avant la chirurgie, inspecter tous les instruments, en prenant soin de maintenir un champ stérile. </li><li> Mettre en place la zone chirurgicale stérile avec des coussins absorbants, dissection étendue, nez anesthésie cône, des instruments chirurgicaux et lampe de chauffage dirigé vers la zone de travail. Pour stériliser dans des outils entre les souris, préchauffer stérilisateur à billes. </li><li> Assembler et appareils d&#39;anesthésie d&#39;essai; peser évacuation de gaz. </li><li> En utilisant les micro-ondes, tampons de cire de chaleur pour un maximum de 5 min (par incréments de 1 min, le pétrissage de la plaquette de cire afin de combiner fondu et fondue de cire) à 70-80% de la puissance, jusqu&#39;à ce que toute la cire est uniformément fondu. Par le toucher, assurer le pad n&#39;est pas trop chaud et de lieu dans le vide récupération de rongeur cage. </li><li> Don équipement de protection individuelle pour les interventions chirurgicales, y compris les rongeurs masque chirurgical, bonnet, gants et blouse. </li></ol> 6. Intervention chirurgicale: Capsule rénale xénogreffe<ol><li> Toutes les procédures impliquant des animaux de recherche doivent être effectuées avec l&#39;approbation des comités de protection des animaux dans les institutions et l&#39;utilisation. Avant l&#39;induction de l&#39;anesthésie, observer la souris pour assurer la santé et le bien-être. </li><li> Placez la souris dans la chambre pour l&#39;induction de l&#39;anesthésie isoflurane à 3-5%. Lorsque l&#39;animal a cessé de bouger et la fréquence respiratoire a diminué, transfert à cône en position couchée, et maintenir une anesthésie à 1-3%. </li><li> Si nécessaire, utilisez une tondeuse pour raser le dos de la souris. Ce n&#39;est pas nécessaire lors de l&#39;utilisation des souris athymiques nude (nu / nu). </li><li> Appliquer une pression ferme sur la sangle de la patte arrière élargie pour évaluer l&#39;adéquation de l&#39;anesthésie. Si la souris répond à la pression, plus de temps est nécessaire pour l&#39;anesthésie de prendre effet. Si nécessaire, ajuster le débit anesthésie légèrement pour atteindre une anesthésie adéquate. </li><li> Lorsque la souris est anesthésiée manière adéquate, à désinfecter le site opératoire chirurgical avec de l&#39;iode (Bétadine) en solution suivie d&#39;70% d&#39;alcool. </li><li> Don Les gants et une blouse stérile; appliquer des champs stériles sur le site chirurgical. Soulevez la peau du dos avec une paire de pince à griffes, et en utilisant les ciseaux grossiers faire une incision médiane dorsale cm 2-3. </li><li> Utilisation de ciseaux mousses ou une sonde, séparer le derme sous-jacent à partir de la paroi du corps (des deux côtés de l&#39;incision pour le greffage ou bilatérale sur une face pour le greffage unilatéral). </li><li> Repositionner la souris en position latérale, et identifier l&#39;emplacement du rein par la visualisation du profil rénal à travers la paroi musculaire. En appliquant une pression manuelle douce avec le pouce et l&#39;index sur l&#39;abdomen peut aider à visualiser les organes internes. </li><li> En utilisant des ciseaux fins de l&#39;iris, et en prenant soin d&#39;éviter les gros vaisseaux et les nerfs de la colonne vertébrale, faire une incision de 1 cm dans le mur corps parallèle à la colonne vertébrale. Élargir cette incision de 1,5-2,0 cm (un peu plus long que le grand axe du rein) en ouvrant doucement les ciseaux plus large après les plaçant dans l&#39;incision initiale. </li><li> Extérioriser le rein en appliquant une légère pression à l&#39;extérieur de la paroi du muscle de part et d&#39;autre du rein à l&#39;aide de l&#39;index et du pouce. Tuck bords de la peau au-dessous du rein extériorisé, qui repose sur la paroi du corps. Alors que le rein est extériorisé, maintenir l&#39;hydratation de la capsule rénale en appliquant une solution saline stérile. </li><li> Utilisation fines # 5 forceps soulevez doucement la capsule rénale de parenchyme du rein et avec un scalpel fin, faire une incision mm 2 -4 dans la capsule. La taille de l&#39;incision est déterminée par la taille de la greffe, mais doit être minimisée afin de maintenir l&#39;intégrité de la capsule. </li><li> Manipuler une pipette Pasteur en verre qui a été établi mince et poli-feu avec une extrémité fermée arrondie sous la capsule tangentielle à la surface du rein. Ouvrez doucement une petite poche de la capsule pour les greffes, en utilisant le plus grand soin de ne pas endommager le parenchyme rénal. </li><li> L&#39;arête de coupe de la capsule du rein est soulevé avec les fines pinces, et le greffon is insérée dans la poche sous la capsule en utilisant la pipette en verre poli au feu. Plusieurs greffons peuvent être placés sous la capsule rénale et uniformément espacés sur la surface du rein. </li><li> Si, au cours du greffage, la capsule se déshydrate, il doit être humidifiée par l&#39;application d&#39;une solution saline stérile. </li><li> Lorsque le greffage est terminée, soulever légèrement les côtés de l&#39;incision de la paroi musculaire de remplacer le rein en arrière dans la cavité du corps. Observez que les greffes ne glissent pas de sous la capsule. </li><li> Fermez la paroi musculaire avec une seule suture (4-0, FS-2 vicryl suture). L&#39;intervention chirurgicale peut être répété sur le rein controlatéral par le repositionnement de la souris. </li><li> Lorsque le greffage est terminée, la souris peut subir sous-cutanée culot implantation au cours de la même intervention chirurgicale (Voir Protocole étape 7). </li><li> En utilisant une pince à griffes, alignez les bords de l&#39;incision de la peau et appliquer 2-3 des agrafes chirurgicales pour fermer l&#39;incision. Administrer l&#39;analgésie (nous utilisons 5-10 mg / kg carprofen utilisant une injection sous-cutanée) et placez la souris dans la position couchée sur le côté dans la cage de récupération. Assurer le maintien de la température du corps avec de la chaleur provenant d&#39;une lampe ou un coussin chauffant. Observer pour une restauration complète de la souris, ce qui devrait se produire en moins de 15 minutes. </li><li> Souris devraient être observés pour le 24 heures suivant les signes de la douleur post-opératoire, le saignement et / ou d&#39;autres complications. Inspectez régulièrement incision chirurgicale des signes d&#39;infection. </li><li> Retirer des agrafes avec dispositif d&#39;attache de la plaie de l&#39;ablation chirurgicale 7-14 jours après la chirurgie. </li></ol> 7. Intervention chirurgicale: sous-cutanée Pellet Implantation <ol><li> Répétez les étapes 6.1-6.5 de capsule rénale xénogreffes intervention chirurgicale. </li><li> Soulevez la peau du dos avec une paire de pinces de la peau, et en utilisant les ciseaux grossiers faire une incision médiane dorsale cm 1-2. </li><li> Avec des ciseaux émoussés ou une sonde, séparer le derme sous-jacentes de la paroi du corps dans une direction crânienne. </li><li> En utilisant des pinces de la peau,soulevez doucement l&#39;aspect crânienne de l&#39;incision de la peau, et tenant le culot de l&#39;hormone doucement avec droites, pinces dentelées, insérer le culot et libérer à la peau du cou, dans la poche que vous avez créé avec la sonde émoussée. </li><li> Répétez les étapes 6.18 à 6.20 de la capsule rénale xénogreffes intervention chirurgicale. Si vous effectuez sous-cutanée culot implantation uniquement, utilisez une pince chirurgicale plaie à refermer l&#39;incision chirurgicale. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Ce document et le protocole décrit ici décrivent la fabrication de l&#39;hormone comprimé et / ou granulés de drogue, et la procédure chirurgicale pour sous-cutanée culot implantation de souris. Selon la question de recherche à traiter, cette technique peut être réalisée individuellement ou en combinaison avec capsule rénale xénogreffe de cellules de la prostate greffes recombinantes ou des xénogreffes de tissus de la prostate, qui sont des techniques largement utilisées dans la recherche de la prostate <s...

Cancer de la prostate (AEPA) et l&#39;hyperplasie bénigne de la prostate (HBP) sont des fardeaux pour la santé. L&#39;érythroblastopénie est le deuxième cancer d&#39;organe solide la plus fréquente chez les hommes et une cause majeure de cancer liés mort 1. L&#39;HBP est également très fréquente chez les hommes plus âgés, et il est estimé que la manifestation clinique de l&#39;HBP, la baisse des symptômes des voies urinaires (TUBA), aura une incidence sur 50-90% des hommes 2. Alors que les androgènes et oestrogènes sont connus pour être important dans érythroblastopénie et BPH, notre compréhension des mécanismes hormonaux qui sous-tendent la carcinogenèse et la croissance reste incomplète 3,4. Modèles animaux simples et dociles génétiquement sous-tendent les études qui permettront de répondre à ces priorités dans la recherche de la prostate. Dans hormones maladies sensibles tels que l&#39;érythroblastopénie et l&#39;HBP, l&#39;utilisation de sous-cutanée, la lenteur des pastilles d&#39;hormones de libération, isolément ou en combinaison avec capsule rénale xénogreffe (le transfert de cellules, de tissus ou d&#39;organes d&#39;une espèce à une autre) dans le immunocompSouris hôte romised, fournit un procédé simple et reproductible pour l&#39;étude de la régulation hormonale de la croissance et de la cancérogenèse. Sous-cutanée hormone culot implantation est une technique simple et reproductible pour étudier la régulation hormonale de la carcinogenèse et la croissance bénigne de la prostate 5. Implantation sous-cutanée de souris mâles adultes avec 25 mg de testosterone (T) et 2,5 mg de 17β-estradiol (E 2), provoque une augmentation dans le sérum E 2 et diminution progressive de la T, de recréer l&#39;environnement hormonal dynamique de l&#39;homme vieillissant 5,6. En outre, ce modèle reprend la plupart des caractéristiques cliniques de l&#39;HBP-TUBA 5,7. D&#39;autres méthodes d&#39;administration d&#39;hormones comprennent l&#39;administration orale / de gavage ou par injection intrapéritonéale, qui causent une détresse à l&#39;rongeur, sont moins cohérentes dans la prestation de la même quantité de médicament dans le temps, et sont plus de main-d&#39;œuvre d&#39;une implantation chirurgicale d&#39;un temps. D&#39;autres modes de sous-cutanées hormone et / ou l&#39;administration de médicaments comprennent les capsules de Silastic 8. Alors que nous avons aussi l&#39;expérience avec l&#39;utilisation de capsules de Silastic, granulés compressés sont favorisés pour leur facilité d&#39;utilisation et la reproductibilité. En outre, les taux de pastilles d&#39;hormones comprimé à libération mieux imiter les rapports dynamiques sexuelles stéroïdes hormonaux observés chez les hommes vieillissants 5,7. Depuis le développement des souris génétiquement immunodéprimé, de nombreux systèmes de modèle in vivo en incorporant des techniques de la xénogreffe ont été mis au point pour l&#39;étude d&#39;une grande variété de tissus normaux et malades. Il existe plusieurs catégories de base de la xénogreffe. xénogreffes de tissus sont constitués d&#39;un petit morceau de tissu intact, ce qui peut être une structure normale, une tumeur maligne ou bénigne croissance. Szot et al. (2007) ont récemment éclairé rénale capsule xénogreffe d&#39;îlots pancréatiques 9. Aamdal et al. (1985) a décrit la capsule rénale xénogreffe de 27 lignées cellulaires de cancer humain en imsouris munocompromised accueille 10. Greffons peuvent aussi être composés d&#39;une seule lignée cellulaire immortalisée (cancéreuse ou non tumorigènes), ou peuvent être constitués d&#39;une lignée cellulaire immortalisée combiné avec des cellules isolées à partir de mésenchyme (greffe de cellules recombinantes). Nous privilégions la xénogreffe de recombinants de cellules de sonder les rôles respectifs de stroma et de l&#39;épithélium dans le développement d&#39;érythroblastopénie et BPH. Cunha et al. (1980) a été le premier à signaler que lorsque les adultes murin épithélium de la vessie est combiné avec embryonnaire mésenchyme urogénital des sinus (UGM) et xénogreffes sous la capsule rénale d&#39;hôtes souris mâles, le tissu se développe en structures ressemblant prostate acini 11. Norman et al. (1986) a montré que la souris adulte prostate canalaire épithélium et UGM, lorsqu&#39;il est combiné à des recombinants de tissus, connaissent une croissance canalaire et la morphogenèse de ramification 12. Hayward et al. (1988) a montré que l&#39;épithélium de la prostate humain répond à inductifs m fœtaleesenchyme de la même façon 13. Un modèle hormonal de la carcinogenèse de la prostate, en combinant la lignée de cellules épithéliales de prostate humaine immortalisée BPH-1 avec UGM, a d&#39;abord été rapporté par Wang et al. 14 (2001) et a été largement utilisé dans notre laboratoire 15. Ce modèle est bien adapté pour la compréhension de la progression érythroblastopénie parce épithélium bénigne de la prostate se transforme en maladie métastatique, la modélisation avancée érythroblastopénie chez l&#39;homme 5. Parce que les composants spécifiques peuvent être manipulées génétiquement, cellule greffe recombinant est particulièrement utile comme une approche pour évaluer les interactions stroma-épithéliales. Autres sites appropriés pour la xénogreffe sont intradermique, sous-cutanée et lieux orthotopiques 16. Selon le procédé de l&#39;intérêt du tissu et de la maladie, ceux-ci peuvent être d&#39;autres méthodes appropriées. Pour l&#39;étude de la carcinogenèse hormonale de la prostate et de la réglementation de tumeur bénigne, nous choisissons la capsule rénalesite pour xénogreffe en raison de ses supérieurs greffe prenne taux, l&#39;approvisionnement en sang en abondance, et la capacité à implanter un plus grand nombre de xénogreffes dans un seul site confiné 16. De plus, la manipulation hormonale de la souris de l&#39;hôte qui donne lieu à une atrophie de la prostate limite l&#39;utilisation de la prostate greffe orthotopique 16. Ce protocole définit les techniques de fabrication comprimé hormone / médicament culot et l&#39;implantation chirurgicale, de même que la capsule rénale xénogreffe de greffes de cellules et de tissus de la prostate humaine. Ensemble, ces techniques fournissent un dosage sensible pour déterminer si une souris génétiquement modifiée est plus sensible à l&#39;érythroblastopénie et / ou à la BPH initiation de souches témoins. Xénogreffe est une technique puissante pour l&#39;évaluation in vivo du potentiel des cellules expérimentales pour développer histologique et les caractéristiques moléculaires des tumeurs malignes, ainsi que d&#39;un essai pour de nouvelles stratégies thérapeutiques pour une large variété de maladies bénignes et malignes.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT &amp; MATERIALS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pellet press</td>
			<td>PARR Industries </td>
			<td>2815</td>
			<td>3mm Punch &amp; Die set</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>1918302</td>
			<td>Voyager or other</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-962Q</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>L2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Deltaphase Pad Kit (reheatable wax)</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>39DP</td>
			<td>Alternative to an electric heating pad</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hot Bead sterilizer</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflurane Vaporizer</td>
			<td>Supera Anesthesia Innov</td>
			<td>VAP3000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Induction Chamber</td>
			<td>Supera Anesthesia Innov</td>
			<td>RES644</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>F/AIR Canister</td>
			<td>Supera Anesthesia Innov</td>
			<td>80120</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4 port Manifold</td>
			<td>Supera Anesthesia Innov</td>
			<td>RES536</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rebreathing Circuits</td>
			<td>Supera Anesthesia Innov</td>
			<td>CIR529</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inlet/Outlet Fittings</td>
			<td>Supera Anesthesia Innov</td>
			<td>VAP203/4</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pressure Reg/Gauge</td>
			<td>Supera Anesthesia Innov</td>
			<td>OXY508</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Oxygen Flowmeter</td>
			<td>Supera Anesthesia Innov</td>
			<td>OXY660</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>21mm Clear Tubing</td>
			<td>Supera Anesthesia Innov</td>
			<td>301-150</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Small Mice Nose Cone</td>
			<td>Supera Anesthesia Innov</td>
			<td>ACC526</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile surgical gown</td>
			<td>Midwest Vet Supply</td>
			<td>350.79866.2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Surgical mask</td>
			<td>Midwest Vet Supply</td>
			<td>350.50111.2</td>
			<td>2-ply w/ earloops</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>Midwest Vet Supply</td>
			<td>001.14100.2</td>
			<td>2 x 2 inches</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile Gloves</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>55092</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bouffant</td>
			<td>Midwest Vet Supply</td>
			<td>001.27100.2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cotton Tip Applicator</td>
			<td>Midwest Vet Supply</td>
			<td>001.06220.2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Surgical Scrub Wash</td>
			<td>Midwest Vet Supply</td>
			<td>733.80010.3</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile Fields (Fenestrated)</td>
			<td>General Econopak, Inc</td>
			<td>88VCSTF</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-3292</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Testosterone Proprionate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T-1875</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>17&beta;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E-2758</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Midwest Vet Supply</td>
			<td>193.33161.3</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>Midwest Vet Supply</td>
			<td>193.70200.3</td>
			<td>Injectable (Rimadyl)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Webster Veterinary</td>
			<td>07-836-3379</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>Midwest Vet Supply</td>
			<td>193.74504.3</td>
			<td>NaCl 0.9%, Injectable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SURGICAL INSTRUMENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Straight Sharp/Blunt Scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools (F.S.T.)</td>
			<td>14054-13</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved)</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11055-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fine Iris scissors</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Graefe Scalpel</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>10071-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glass Pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S67050</td>
			<td>5" length</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Graefe forceps (Serrated, Curved)</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11052-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Graefe forceps (Serrated, Straight)</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11050-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vicryl Suture</td>
			<td>Midwest Vet Supply</td>
			<td>295-92100.2</td>
			<td>4-0, FS-2, Absorbable</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Needle Holder w/ scissor action</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>12002012</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Wound Clips</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>ACS CS</td>
			<td>May use 7mm or 9mm clips</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Reflex Wound Clipper</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>12031-09</td>
			<td>Correspond w/ wound clip size</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Would Clip Remover</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>12033-00</td>
			<td>Universal</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sterilization Container</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>20810-01</td>
			<td>Any autoclavable container will do</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Syringe w/ needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>148292C</td>
			<td>1cc, 25Gx1</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ear Tag Applicator</td>
			<td>National Band &amp; Tag Co.</td>
			<td>1005s1</td>
			<td>Alternative to ear notching</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Small Animal Ear Tags</td>
			<td>National Band &amp; Tag Co.</td>
			<td>1005-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

renal capsule xenografting and subcutaneous pellet implantation for the evaluation of prostate carcinogenesis and benign prostatic hyperplasia

Nouvelles thérapies pour les deux maladies courantes de la prostate, le cancer de la prostate (AEPA) et l&#39;hyperplasie bénigne de la prostate (HBP), dépendent de façon critique sur les expériences évaluant leur régulation hormonale. Hormones stéroïdes sexe (notamment les androgènes et oestrogènes) sont importants dans érythroblastopénie et l&#39;HBP; nous sondons leurs rôles respectifs dans l&#39;induction de la croissance de la prostate et la cancérogenèse chez la souris avec des expériences à l&#39;aide de pastilles d&#39;hormones compressés. Hormones et / ou de drogues pastilles sont facilement fabriqués avec une presse à pellets, et chirurgicalement implantés dans le tissu sous-cutané de l&#39;hôte chez les souris mâles. Nous décrivons également un protocole pour l&#39;évaluation de la carcinogenèse hormonale sous-cutanée en combinaison avec l&#39;hormone culot implantation de recombinants xénogreffe de cellules de la prostate sous la capsule rénale de souris immunodéprimées. En outre, l&#39;hormone sous-cutanée culot implantation, en combinaison avec capsule rénale xénogreffe de tissu de BPH, est utile pour mieux comprendre la régulation hormonale de prost bénignemangé la croissance, et de tester de nouvelles thérapies ciblant sexe stéroïde voies hormonales.

<html> En fonction de l&#39;hypothèse à tester, capsule rénale xénogreffe de recombinants de tissus ou de cellules peut être effectuée en vase clos ou sous-cutanée en combinaison avec l&#39;hormone culot implantation. Un schéma d&#39;une expérience hypothétique combinant rénale expérience capsule de xénogreffe sous-cutanée de l&#39;hormone culot implantation est illustrée sur la figure 1. Une variété de substances pulvérulentes et / ou cristallins peut être utilisé dans la fabrication...

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Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

Nous décrivons la fabrication de pastilles comprimées d&#39;hormones, ainsi que l&#39;implantation chirurgicale sous-cutanée à des souris. Cette stratégie peut être combinée avec la croissance de xénogreffes de cellules et de tissus sous la capsule rénale de souris nudes athymiques pour évaluer la carcinogenèse hormonale et la régulation de la croissance bénigne de la prostate.

Rénale Capsule xénogreffe sous-cutanée et Pellet implantation pour l&#39;évaluation de la carcinogenèse prostatique et l&#39;hyperplasie prostatique bénigne

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

renal-capsule-xenografting-subcutaneous-pellet-implantation-for

Research

JoVE Journal

Medicine

24.9K vues.  University of Wisconsin-Madison.  Nous décrivons la fabrication de pastilles comprimées d'hormones, ainsi que l'implantation chirurgicale sous-cutanée à des souris. Cette stratégie peut être combinée avec la croissance de xénogreffes de cellules et de tissus sous la capsule rénale de souris nudes athymiques pour évaluer la carcinogenèse hormonale et la régulation de la croissance bénigne de la prostate. 

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Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluation de la fixation des nanoparticules dans les tumeurs en temps réel par imagerie intravitale

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Recherche

Médecine

Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Cancer development is a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor cells, immune cells, fibroblasts and endothelial cells. Each type of cells undergoes signaling and functional changes during carcinogenesis. The current challenge for many cancer researchers is to dissect these changes in each cell type during the multiple-step process in vivo. In the last few years, the authors have developed a set of procedures to isolate different cell populations during skin cancer development using K14creER/R26-SmoM2YFP mice. The procedure is divided into 6 parts: 1) generating appropriate mice for the study (K14creER+ and R26-SmoM2YFP+ mice in this protocol); 2) inducing SmoM2YFP expression in mouse skin; 3) preparing mouse skin biopsies; 4) isolating epidermis from skin; 5) preparing single cells from epidermis; 6) labeling single cell populations for flow cytometry analysis. Generation of sufficient number of mice with the right genotype is the limiting step in this protocol, which may take up to two months. The rest of steps take a few hours to a few days. Within this protocol, we also include a section for troubleshooting. Although we focus on skin cancer, this protocol may be modified to apply for other animal models of human diseases.

Carcinogenesis is a process involving interactions between cancer cells and the cancer microenvironment. To dissect the molecular events, one needs to isolate different cell populations at different stages during cancer development. Using a mouse model for basal cell carcinoma, we describe a protocol for cell analyses during carcinogenesis.

Analyses de la population de cellules pendant la carcinogenèse cutanée

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

Murin endoscopie pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Guérison multimodale d&#39;imagerie de la cancérogenèse et de l&#39;évaluation de la plaie intestinale et l&#39;inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Évaluation des leucocytes infiltrant les tumeurs sous-ensembles dans un Modèle de tumeur sous-cutanée

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine balloon denudation model, which is comparable with established vessel injury models in large animals. The aorta denudation model with balloon catheters mimics the clinical setting and leads to comparable pathobiological and physiological changes. Briefly, after performing a horizontal incision in the aorta abdominalis, a balloon catheter will be inserted into the vessel, inflated, and introduced retrogradely. Inflation of the balloon will lead to intima injury and overdistension of the vessel. After removing the catheter, the aortic incision will be closed with single stiches. The model shown in this article is reproducible, easy to perform, and can be established quickly and reliably. It is especially suitable for evaluating expensive experimental therapeutic agents, which can be applied in an economical fashion. By using different knockout-mouse strains, the impact of different genes on MH development can be assessed.

This article demonstrates a murine model to study the development of myointimal hyperplasia (MH) after aortic balloon injury.

Blessure axée sur le ballon pour provoquer l’hyperplasie Myointimal dans l’aorte abdominale de souris

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...

Surgical Treatment for Benign Prostatic Hyperplasia: Holmium Laser Enucleation of the Prostate (HoLEP).

Benign prostatic hyperplasia (BPH) commonly occurs among elderly males. The condition causes symptoms in the lower urinary tract, thereby reducing the quality of life. BPH includes 2 major treatments: medication and surgery. Surgical treatment is often the most effective and final intervention. Holmium laser enucleation of the prostate (HoLEP), one of the most efficient surgical procedures for BPH, is conducted transurethrally. During surgery, the most important and most difficult part is to locate the surgical capsule of the prostate, which is consistent to the idea of anatomic surgery. Different skills may be needed in treating different parts of the prostate. HoLEP tends to be efficient and safe with good hemostatic properties, and able to treat bladder calculus, which may be the complications of BPH. The technique is particularly suitable for prostate of varying volumes and sizes. Indeed, HoLEP also presents certain disadvantages, such as a long learning curve and costly equipment. Regardless, this method may be the "new standard" and the excellent method for the surgical treatment of BPH.

Surgical Treatment for Benign Prostatic Hyperplasia: Holmium Laser Enucleation of the Prostate HoLEP.

Here we present a safe and efficient protocol, holmium laser enucleation of the prostate, to treat benign prostatic hyperplasia.

Traitement chirurgical de l’hyperplasie bénigne de la prostate : énucléation Laser Holmium de la Prostate (HoLEP).

Benign prostatic hyperplasia (BPH) commonly occurs among elderly males. The condition causes symptoms in the lower urinary tract, thereby reducing the ...

Enucleation of the Prostate for the Treatment of Benign Prostatic Hyperplasia Using a 980 nm Diode Laser

In the aging male population, the occurrence of lower urinary tract symptoms (LUTS) caused by benign prostatic hyperplasia (BPH) is a common problem. Here, we introduce a new technique called 980 nm diode laser enucleation (DiLEP) to treat BPH1. Diode lasers can absorb both water and hemoglobin at the same time, so they are good for cutting and hemostasis2. The diode laser was approved by the FDA in 2007, and has been used in the treatment of BPH because of its effective cutting and hemostasis effect3. DiLEP presents several advantages over other techniques, such as TURP, HoLEP, and PVP. During the procedure, we define the boundary of a high-volume prostate and separate it into three lobes with a diode laser by burning two rings and one groove (like a Cupid&#39;s arrow). Compared to other procedures, mDiLEP has fewer intraoperative complications, a shorter learning curve, and achieves more tissue resection.

Here, we present a protocol for modified 980 nm diode laser enucleation to treat large volume benign prostatic hyperplasia.

Enucléation de la prostate pour le traitement de l’hyperplasie bénigne de la prostate à l’aide d’un laser à diode de 980 nm

In the aging male population, the occurrence of lower urinary tract symptoms (LUTS) caused by benign prostatic hyperplasia (BPH) is a common problem. ...

Direct Drug Delivery to Kidney via the Renal Artery

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research field. Accumulation of drugs in certain organs may give rise to adverse and unwanted effects, depending on the nature of injectate. To minimize spillover and/or accumulation in other tissues, the herein described method directs the formulation into the renal artery bloodstream by inserting a catheter in the infra renal aorta, just below where it branches into the renal artery, resulting in the kidney as first reached organ and distributing of formulation throughout the kidney.
This manuscript provides a detailed description of the method, as well as its challenges and difficulties. It guides the experimenter to become skillful with this type of microsurgery that requires accuracy under sterile conditions. Speed is crucial for minimizing the ischemia and practicing the procedure will increase the chance of successful injections without adverse effects. By modulating the time between injection and reperfusion as well as the injected volume, the risk of spillover to other organs is mitigated. 
Note that this technique is suitable for single dosing strategies.

This manuscript describes a method for targeted delivery to a single kidney via a catheter placed in the infrarenal abdominal aorta in the mouse.

Livraison directe de médicaments au rein par l’intermédiaire de l’artère rénale

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to detect drug exposure. The rat blood sampling method determines the quality of the plasma and further affects the precision of the test results. The subclavian vein blood collection method described in this protocol collects blood samples repeatedly in the conscious state of animals to meet the needs of PK and TK tests. The skills of restraint handling and appropriate procedure of needle incision ensure the success rate of blood collection. It is easy to operate while ensuring the quality of plasma and at the same time catering to animal welfare. However, this method requires skilled operation, and an improper one may cause animal weakness, pain, lameness, and even mortality. The current method has been used in the testing facility for a 4-week oral toxicity study in Sprague Dawley (SD) rats with TK. The maximum amount of blood collected within 24 h did not exceed 20% of the animal's total blood. The animals' body weight was more than 200 g for males and females. The data showed that the animals' bodyweight increased steadily every week, and the clinical observation was normal after repetitive sample collection.

The present protocol describes a simple and efficient method for collecting blood from the subclavian vein in rats. It enables rapid, timely, and easily identifiable sampling without anesthesia and obtains high-quality blood through repetitive sample collection.

Prélèvement sanguin répétitif dans la veine sous-clavière d’un rat conscient

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...

A Retrograde Implantation Approach for Peritoneal Dialysis Catheter Placement in Mice

Murine models are employed to probe various aspects of peritoneal dialysis (PD), such as peritoneal inflammation and fibrosis. These events drive peritoneal membrane failure in humans, which remains an area of intense investigation due to its profound clinical implications in managing patients with end-stage kidney disease (ESKD). Despite the clinical importance of PD and its related complications, current experimental murine models suffer from key technical challenges that compromise the models&#39; performance. These include PD catheter migration and kinking and usually warrant earlier catheter removal. These limitations also drive the need for a greater number of animals to complete a study. Addressing these drawbacks, this study introduces technical improvements and surgical nuances to prevent commonly observed PD catheter complications in a murine model. Moreover, this modified model is validated by inducing peritoneal inflammation and fibrosis using lipopolysaccharide injections. In essence, this paper describes an improved method to create an experimental model of PD.

This article describes modifications of a procedure to implant a peritoneal dialysis catheter in a murine model to avoid major technical issues observed with the conventional techniques.