Ce travail a été soutenu par Innovative jeune biologiste Prix BT/BI/12/040/2005 et BT/PR13289/BRB/10/745/2009 subvention du Département de biotechnologie, gouvernement de l&#39;Inde et les ressources de base de Centre pour empreintes génétiques et diagnostics, Hyderabad. MRN et GB sont les bénéficiaires de bourses de recherche junior et senior du Conseil de recherche scientifique et industrielle vers la poursuite d&#39;un diplôme de l&#39;Université de Manipal de doctorat. SB est le récipiendaire du Junior et Senior Research Fellowship du Département de biotechnologie vers la poursuite d&#39;un diplôme de l&#39;Université de Manipal de doctorat.

Il est recommandé d&#39;effectuer C. glabrata expériences d&#39;infection dans un laboratoire avec un niveau de biosécurité de confinement 2 (BSL-2). <ol><li> Préparation des cellules THP-1 macrophage monocouche. </li><li> C. Préparation d&#39; glabrata suspension cellulaire. </li><li> L&#39;infection des macrophages THP-1 avec C. cellules glabrata. </li><li> Mesure du taux de phagocytose et de la réplication intracellulaire par l&#39;intermédiaire de formation de colonies dosage unitaire. </li><li> Surveillance de la réplication intracellulaire en utilisant la microscopie confocale à balayage laser. </li></ol> Une. Préparation de THP-1 macrophages monocouche <ol><li> THP-1 est une lignée de cellules monocytes humains provenant du sang périphérique d&#39;un 1 ans garçon atteint de leucémie aiguë monocytaire 14. THP-1, une lignée de cellules en suspension, est habituellement maintenue à 37 ° C humidifié à 5% de CO2 dans du milieu de culture RPMI-1640 supplémenté avec 10% de FBS (sérum bovin fœtal). Le traitement avec du phorbol 12-myrista13-acétate de te (PMA, un ester de phorbol) aboutit à une différenciation terminale des cellules THP-1 de monocytes en macrophages. Fait important, le traitement PMA n&#39;affecte pas la viabilité des cellules et les cellules différenciées ne se divisent pas. </li><li> Graine d&#39;environ 1,5 x 10 6 cellules THP-1 de monocytes dans 100 boîtes de culture mm de milieu RPMI-1640 complet (milieu RPMI-1640 additionné de 10% de sérum, 2 mM de glutamine et 1x antibiotiques; 10 ml / boîte) et laisser les cellules se développent à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant 2 jours. </li><li> Une fois cellules THP-1 ont atteint une densité de 8 x 10 5 cellules / ml, transférer la boîte de culture de la hotte à flux laminaire de culture cellulaire et agiter doucement pour remettre les cellules installées. </li><li> Introduire à la pipette la suspension cellulaire, placez dans un tube stérile de 15 ml et centrifuger à 1000 rpm (130 xg) pendant 4 min. Rejeter le surnageant et suspendre THP-1 culot cellulaire dans 5 ml, préchauffé, milieu complet RPMI-1640 frais. </li><li> Énumérer les cellules avec un hémocytomètre et diluer le cell suspension à une densité finale de 10 6 cellules / ml avec du milieu complet préchauffé RPMI-1640 </li><li> Ajouter 1 pl de 160 mM PMA actions (phorbol 12-myristate 13-acétate solution préparée dans du diméthylsulfoxyde) à 10 ml THP-1 cellule suspension (concentration finale de 16 nM) et bien mélanger. Distribuer 1 ml de suspension cellulaire dans chaque puits d&#39;une plaque de culture tissulaire à 24 puits et incuber la plaque dans l&#39;incubateur maintenu à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 12 heures. </li><li> Enlever le vieux médium, ajouter 1 ml préchauffé milieu RPMI-1640 complet et permettent aux cellules de récupérer pendant 12 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2. </li><li> Observer les cellules sous un microscope inversé pour s&#39;assurer que les cellules THP-1 monocytaires de forme ovale en suspension ont été différenciés en macrophages aplatis, en forme de fuseau et adhérentes. Ces cellules différenciées sont maintenant prêts à mener C. études d&#39;infection glabrata. </li></ol> 2. C. Préparation d&#39; glabrata &amp; #160; suspension cellulaire C. glabrata souche sauvage Bg2 sera utilisé pour infecter les macrophages THP-1. C. glabrata cellules sont cultivées en routine en milieu YPD liquide (extrait de levure (1%)-peptone (2%), de dextrose (2%)) moyenne. Milieu YPD solide est préparé en ajoutant 2% de gélose avant l&#39;autoclavage milieu. <ol><li> Pour préparer une culture de C. glabrata, choisissez une seule colonie à partir de la plaque de gélose avec une boucle stérile à usage unique et inoculer dans 10 ml de milieu liquide YPD et incuber pendant 14-16 heures avec agitation (200 rpm) à 30 ° C. </li><li> Centrifugeuse de cette culture (1 ml) à 4 000 tours par minute (1800 x g) pendant 5 min dans une microcentrifugeuse de table, de lavage des cellules trois fois avec du PBS (solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,4) et la suspension stérile culot cellulaire dans 1 ml de PBS. </li><li> Mesurer la DO 600 C. glabrata suspension de cellules et on dilue avec un volume approprié de PBS stérile pour obtenir une densité de 2 x 10 6 cellules / ml (DO600= 0,1). En variante, la densité de cellules désirée peut être obtenue par comptage des cellules de levure en utilisant un hémocytomètre. </li></ol> 3. L&#39;infection des macrophages THP-1 avec C. Cellules glabrata <ol><li> Ajouter 50 ul C. glabrata suspension de cellules THP-1 pour les macrophages (10 6 cellules ensemencées par puits d&#39;une plaque de culture à 24 puits) pour obtenir une MOI (multiplicité d&#39;infection) de 0,1 et incuber la plaque à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Pour déterminer les chiffres de levure viables, diluer 50 pi C. glabrata cellule suspension de 100 fois dans du PBS stérile et de la plaque 100 pl sur milieu YPD solide. Incuber les plaques à 30 ° C et compter manuellement le nombre de colonies de levures apparaissant après 1-2 jours. Ces chiffres seront, désormais, être appelés à 0 h C. glabrata UFC (unités formant colonie). </li><li> Après 2 heures de co-culture des cellules THP-1 avec C. glabrata cellules, le milieu de culture des rejets en inversant la plaque à 24 puits pour culture de tissus iréservoir na et lavez doucement trois fois avec PBS préchauffé stérile pour éliminer nonphagocytosed extracellulaire C. cellules glabrata. Lavages doux avec du PBS sont absolument essentiels pour accomplir l&#39;élimination complète de toute la levure extracellulaire sans causer aucun dommage à la THP-1 macrophages monocouche. </li></ol> 4. Mesure de la phagocytose taux intracellulaire et Réplication via Colony Forming Unit Test <ol><li> Lyse C. glabrata infecté THP-1 macrophages dans 1 ml de H 2 O stérile pendant 2 min, gratter doucement pour enlever les débris des macrophages du bien et de recueillir lysat de cellules dans un tube à centrifuger. Vérification microscopique de lyse complète des macrophages est essentiel pour la récupération de toute la levure intériorisé. </li><li> Préparer une dilution de 100 fois de lysat dans du PBS stérile, la plaque 100 pi sur milieu YPD solide et incuber les plaques à 30 ° C. </li><li> Après 1-2 jours, compter manuellement le nombre de C. glabrata colonies qui appeared sur milieu YPD, multiplier par le facteur de dilution (2 h de UFC) et de calculer le taux de phagocytose qui se réfère au pour cent de C. glabrata cellules qui sont ingérés par les cellules THP-1 macrophages après co-incubation de 2 h à l&#39;aide de la formule suivante. % Phagocytose = [(UFC à 2 h) / (UFC à 0 h)] X 100 </li><li> Pour mesurer le taux de réplication intracellulaire de C. cellules glabrata dans les macrophages THP-1, recueillir la levure intracellulaire à des moments différents de points après l&#39;infection dire. 4, 6, 8, 10, 12, et 24 heures, en répétant les étapes 3.3 à 4.3. </li><li> Calculer fois survie / reproduction de C. cellules glabrata dans les macrophages THP-1 en divisant UFC total, à tout point de temps donné avec ceux à 2 h (levure phagocytés). </li></ol> 5. Surveillance de la réplication intracellulaire confocale Laser microscopie à balayage <ol><li> Suivant les étapes décrites dans la section 1, de semences traitées au PMA 5 x 10 5 cellules THP-1 dans chaque puits de deux lames de chambre de quatre puits et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 12 heures. </li><li> Remplacer ancien milieu de préchauffé milieu RPMI-1640 complet et permettent aux cellules de se remettre de traitement au PMA pendant 12 heures. </li><li> Préparer la GFP (green fluorescent protein) marqués C. glabrata suspension cellulaire tel que décrit à la section 2 et à infecter les macrophages THP-1 à une MOI de 1. Si C. glabrata souches exprimant la GFP ne sont pas disponibles, les cellules de levure marqués au FITC (isothiocyanate de fluorescéine) peuvent être utilisés pour surveiller les événements précoces après l&#39;infection savoir. taux de phagocytose et phagolysosomique maturation à 2 h. </li><li> Incuber les lames pendant 2 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2, inverser les soigneusement à jeter moyen et laver 3 fois avec stérile, préchauffé PBS. </li><li> Ajouter 500 ul préchauffé RPMI-1640 medi completum à chaque chambre d&#39;un toboggan et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 22 heures. </li><li> Pour fixer 2 h C. glabrata infectés macrophages THP-1, ajouter 500 ul de 3,7% de formaldéhyde (préparé dans du PBS) pour chaque chambre de l&#39;autre lame et incuber à température ambiante pendant 20 minutes dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver glisser trois fois avec du PBS, ajouter 500 ul de Triton-X (0,7%), et incuber à température ambiante pendant 5 min dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les diapositives 3x avec PBS, supprimer chambre de lame de culture et sécher à l&#39;air pour 3-5 minutes dans l&#39;obscurité. </li><li> Enfoncer délicatement une lamelle en utilisant un milieu Vectashield montage contenant du DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole) sur la glissière en évitant la formation de bulles. Retirez doucement le liquide en excès avec Kimwipe et sceller les bords de lamelle avec du vernis à ongles. glissière de magasin dans l&#39;obscurité à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Répétez les étapes 5.4 et 5.6 à 5.9 pour traiter cellules THP-1 24 h post infection. </li><li> les cellules de l&#39;éditeur en utilisant un confo à balayage lasercal microscope (60X objectif à immersion d&#39;huile, une excitation à 405 nm et 488 nm pour la GFP et DAPI tache, respectivement). </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+THP-1+Cells:+an+attractive+model+for+the+assessment+of+intracellular+growth+rates+of+Mycobacterium+tuberculosis+isolates.">Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates.</a> Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).</li><li>Murayama, T., Ohara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Cytomegalovirus+induces+Interleukin-8+production+by+a+human+monocytic+cell+line,+THP-1,+through+acting+concurrently+on+AP-1-+and+NF-kB-binding+sites+of+the+Interleukin-8+gene.">Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene.</a> J. 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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Système immunitaire inné joue un rôle important dans le contrôle des infections fongiques opportunistes. Macrophages contribuent à la défense antifongique par ingestion et la destruction de l&#39;agent pathogène fongique. Ainsi, l&#39;élucidation des facteurs qui sont nécessaires pour la survie et / ou contrecarrer les fonctions antimicrobiennes des macrophages fera progresser notre compréhension des stratégies de virulence des champignons. Dans ce contexte, nous avons établi un système modèle in vitro...

Espèces de Candida sont la principale cause des infections fongiques invasives potentiellement mortelles chez les patients immunodéprimés 1. Candida glabrata, un pathogène nosocomial émergents, est la deuxième ou troisième plus fréquemment isolés espèces de Candida chez des patients de l&#39;unité de soins intensifs en fonction de la situation géographique 1-3. Phylogénétiquement, C. glabrata, une levure bourgeonnante haploïde, est plus étroitement liée aux Saccharomyces non pathogène modèle cerevisiae que de pathogène Candida spp., y compris C. albicans 4. Conformément à cela, C. glabrata manque quelques traits de virulence fongiques clés, y compris l&#39;accouplement, l&#39;activité protéolytique sécrétée et la plasticité morphologique 4-5. Bien que C. glabrata ne fait pas hyphes, il peut survivre et se répliquer dans les macrophages murins et humains 6-8 suggérant qu&#39;il a développé des mécanismes de pathogenèse uniques. Peu d&#39;informations sont disponibles sur les stratégies que C. glabrata emploie pour survivre environnement macrophages intracellulaire pauvres en éléments nutritifs et de contrer oxydation et réponses de l&#39;hôte non oxydants montés par les cellules immunitaires de l&#39;hôte 5. Un système de modèle de macrophage pertinente est une condition préalable pour délimiter l&#39;interaction de C. glabrata avec des cellules phagocytaires de l&#39;hôte par des approches génomiques et protéomiques fonctionnels. Les cellules mononucléées du sang (PBMC) et des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) d&#39;origine humaine et murine, respectivement, ont précédemment été utilisées pour étudier l&#39;interaction de C. glabrata avec des cellules immunitaires de l&#39;hôte 7,9. Cependant, la difficulté à obtenir les CMSP et BMDMs, leur durée de vie limitée et variation intrinsèque entre les différents bailleurs de fonds de mammifères limitent l&#39;utilisation de ces cellules des systèmes modèles comme polyvalents. Ici, nous décrivons une méthode pour l&#39;établissement d&#39;un système in vitro pour étudier la intracellulcomportement ar de C. glabrata cellules dans les macrophages issus de la lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1. L&#39;objectif global de ce protocole était d&#39;adopter un système de modèle de culture cellulaire simple, peu coûteux, rapide et reproductible qui peut être facilement manipulé pour étudier différents aspects du pathogène interaction hôte-fongique. Cellules THP-1 ont déjà été utilisées pour déchiffrer la réponse immunitaire de l&#39;hôte contre une large gamme d&#39;agents pathogènes, notamment des bactéries, des virus et des champignons 10-12. Cellules monocytaires THP-1 sont faciles à entretenir et peuvent être différenciées, par traitement de l&#39;ester de phorbol, de macrophages qui imitent les macrophages dérivés de monocytes humains et des macrophages expriment des marqueurs appropriés 13. Les principaux avantages de THP-1 système de modèle de macrophage sont la facilité d&#39;usage et l&#39;absence d&#39;exigence d&#39;un équipement sophistiqué. Le protocole présenté ici est facilement adaptable pour étudier l&#39;interaction d&#39;autres agents pathogènes fongiques humains avec host cellules immunitaires. La procédure de courant peut également être utilisée pour identifier des facteurs de virulence de l&#39;agent pathogène d&#39;intérêt en utilisant des écrans de mutants à haut débit. Cette preuve de concept a été illustré par l&#39;utilisation réussie de THP-1 système de modèle de culture pour identifier un ensemble de 56 gènes qui sont nécessaires pour la survie de C. glabrata dans les macrophages humains 8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:40px;width:163px;">THP-1</td>
			<td style="width:105px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:85px;">TIB 202</td>
			<td style="width:243px;">Human acute monocytic leukemia cell line</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:105px;">Hyclone</td>
			<td style="width:85px;">SH30096.01</td>
			<td style="width:243px;">For maintaining THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:105px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:85px;">P 8139</td>
			<td style="width:243px;">Caution: Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">YPD&#160;</td>
			<td style="width:105px;">BD-Difco</td>
			<td style="width:85px;">242710</td>
			<td style="width:243px;">For growing Candida glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:105px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:85px;">F8775</td>
			<td style="width:243px;">For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,&#160; pH 7.4) for washes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Saline-sodium citrate (SSC)&#160;</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Prehybridization buffer</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (50% formamide, 5x Denhardt&#8217;s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">VECTASHIELD mounting medium</td>
			<td style="width:105px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:85px;">H-1200</td>
			<td style="width:243px;">For mounting slides for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">32P-labeled &#945;-dCTP</td>
			<td style="width:105px;">JONAKI-BARC</td>
			<td style="width:85px;">LCP-102</td>
			<td style="width:243px;">For radiolabeling of signature tags</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">100 mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:105px;">Corning</td>
			<td style="width:85px;">430167</td>
			<td style="width:243px;">To culture THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">24-well tissue culture plate</td>
			<td style="width:105px;">Corning</td>
			<td style="width:85px;">3527</td>
			<td style="width:243px;">To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">4-chamber tissue culture-treated glass slide</td>
			<td style="width:105px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:85px;">REF354104</td>
			<td style="width:243px;">To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:105px;">Rohem India</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">For enumeration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Table top microcentrifuge</td>
			<td style="width:105px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:85px;">Microfuge 18</td>
			<td style="width:243px;">For spinning down cells in microtubes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Table top centrifuge</td>
			<td style="width:105px;">Remi</td>
			<td style="width:85px;">R-8C</td>
			<td style="width:243px;">For spinning down cells in 15 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:105px;">Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:85px;">Ultraspec 10</td>
			<td style="width:243px;">To monitor absorbance of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Plate incubator</td>
			<td style="width:105px;">Labtech</td>
			<td style="width:85px;">Refrigerated</td>
			<td style="width:243px;">To grow C. glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Shaker incubator</td>
			<td style="width:105px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:85px;">Innova 43</td>
			<td style="width:243px;">To grow C. glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Water jacketed CO2&#160; incubator</td>
			<td style="width:105px;">Thermo Electron Corporation</td>
			<td style="width:85px;">Forma series 2</td>
			<td style="width:243px;">To culture THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:105px;">Carl Ziess</td>
			<td style="width:85px;">Ziess LSM 510 meta&#160;</td>
			<td style="width:243px;">To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td style="width:85px;">CKX 41</td>
			<td style="width:243px;">To observe C. glabrata and THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">PCR machine</td>
			<td style="width:105px;">BioRad&#160;</td>
			<td style="width:85px;">DNA Engine</td>
			<td style="width:243px;">To amplify unique tags from input and output genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Hybridization oven</td>
			<td style="width:105px;">Labnet</td>
			<td style="width:85px;">Problot 12S</td>
			<td style="width:243px;">For hybridization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PhosphorImager</td>
			<td style="width:105px;">Fujifilm</td>
			<td style="width:85px;">FLA-9000</td>
			<td style="width:243px;">For scanning hybridized membranes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:85px;">Thermomixer Comfort</td>
			<td style="width:243px;">For denaturation of radiolabeled signature tags</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:163px;">Gel documentation unit</td>
			<td style="width:105px;">Alphainnontech</td>
			<td style="width:85px;">Alphaimager</td>
			<td style="width:243px;">To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an in vitro system to study intracellular behavior of candida glabrata in human thp-1 macrophages

Un système modèle de culture cellulaire, si un synoptique proche des conditions d&#39;environnement de l&#39;hôte, peut servir comme une alternative peu coûteuse, facilement manipulable et reproductible pour des systèmes de modèles animaux pour l&#39;étude d&#39;une étape spécifique de l&#39;infection par le pathogène microbien. Une lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 qui, lors du traitement de l&#39;ester de phorbol, se différencie en macrophages, a déjà été utilisé pour étudier les stratégies de virulence de nombreux pathogènes intracellulaires, y compris Mycobacterium tuberculosis. Ici, nous discutons d&#39;un protocole d&#39;adopter un modèle in vitro de culture cellulaire dans système à l&#39;aide de macrophages THP-1 pour délimiter l&#39;interaction d&#39;un agent pathogène opportuniste humain de la levure Candida glabrata avec des cellules phagocytaires de l&#39;hôte. Ce système de modèle est simple, rapide, prête à écrans mutantes à haut débit, et ne nécessite pas de matériel sophistiqué. Un THP-1 expérience d&#39;infection des macrophages typique prend environ 24 heures avec un 24-48 heures supplémentaires pour permettre intracellulaire récupérélevure de se développer sur un milieu riche pour colony forming analyse de la viabilité à base de parts. Comme d&#39;autres systèmes modèles in vitro dans une éventuelle limitation de cette approche est la difficulté d&#39;extrapoler les résultats obtenus à un circuit de cellule immunitaire très complexe existant dans l&#39;hôte humain. Cependant, malgré cela, le protocole actuel est très utile pour élucider les stratégies d&#39;un agent pathogène fongique peut employer pour échapper / contrecarrer réponse antimicrobienne et survivre, s&#39;adapter, et de proliférer dans l&#39;environnement pauvre en nutriments des cellules immunitaires de l&#39;hôte.

Analyse infection de PMA-traités macrophages THP-1 avec C. les cellules de type sauvage glabrata (wt) ont révélé que les cellules wt ont été phagocytés par des macrophages à un taux de 55-65% au bout de 2 h co-incubation. En outre, C. glabrata cellules étaient capables de résister à mort par les macrophages THP-1 et ont subi une moyenne de 5 - à 7 fois plus dans UFC après 24 heures de co-culture avec des macrophages THP-1 8. La réplication intracellulaire de c...

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Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Le présent article décrit un protocole pour établir un système de modèle de culture cellulaire in vitro pour étudier l&#39;interaction d&#39;un champignon pathogène intracellulaire facultatif humain Candida glabrata avec les macrophages humains qui sera un outil utile pour faire progresser notre connaissance des mécanismes de virulence des champignons.

Mise en place d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Système d&#39;étudier le comportement intracellulaire de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En droits macrophages THP-1

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

11.5K vues.  Centre for DNA Fingerprinting and Diagnostics, Andhra Pradesh, India.  Le présent article décrit un protocole pour établir un système de modèle de culture cellulaire in vitro pour étudier l'interaction d'un champignon pathogène intracellulaire facultatif humain Candida glabrata avec les macrophages humains qui sera un outil utile pour faire progresser notre connaissance des mécanismes de virulence des champignons. 

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piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

Modification piggyBac système transposon des cellules T humaines primaires

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Recherche

Immunologie et infection

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Une<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour étudier l&#39;hétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Étude de phagolysosome biogenèse dans les macrophages en direct

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

La transfection très efficace des droits de THP-1 par les macrophages nucléofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

Application de nanoparticules fluorescentes pour étudier Rénovation du système Endo-lysosomale par des bactéries intracellulaires

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

L&#39;application d&#39;un système d&#39;expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

Transfection très efficace des macrophages primaires avec ARNm transcrit in vitro

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...