This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.

1. Génération de lignées cellulaires stables exprimant la protéine d&#39;intérêt <ol><li> Préparer les médias par l&#39;ajout de FCS inactivé à la chaleur et 1% de pénicilline / streptomycine à disponibles dans le commerce Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplémenté avec du GlutaMAX-I, le pyruvate, et 4,5 g / L de D-glucose. </li><li> Cultiver des cellules HEK293 dans un milieu à 37 ° C dans 5% de CO2. Sous-cultiver les cellules tous les trois jours. Retirez les médias et remettre les cellules dans 15 ml de médias fraîches. Pipette de 1 ml dans un nouveau 75 cm 2 de culture cellulaire ballon et ajouter 14 ml médias. </li><li> Analyser le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Seed cellules HEK293 dans une plaque à 6 puits à une densité de 2 x 10 5 cellules par puits et incuber pendant 24 heures. </li><li> Pour la transfection en utilisant le protocole fourni par le fabricant du réactif de transfection. Transfecter des cellules avec pEGFP-C2 ou pEGFP-C2-CAEB en utilisant le réactif de transfection. Avant d&#39;utiliser, réchauffer le GCI de transfectionent et les médias nécessaires à la RT. Utiliser un ratio de 3: 1 de réactif de transfection à l&#39;ADN. <ol><li> Dans le détail, une pipette 1,5 ul de réactif de transfection directement dans 50 ul de milieu DMEM exempt de sérum. Pour la formation du complexe, une pipette 0,5 pg d&#39;ADN codant pour la GFP ou GFP-CAEB au mélange réactif contenant transfection et incuber pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Transfecter des cellules en ajoutant le mélange réactionnel d&#39;une manière goutte à goutte et laisser incuber à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant 24 heures. </li></ol></li><li> Ajouter 1 mg / ml de généticine pour la sélection de clones GFP-positives à 37 ° C dans 5% de CO2. </li><li> Après 6 jours, isoler des cellules uniques par cytométrie de flux de tri dans une plaque de 96 puits hébergeant moyen et HEK293 surnageant dans un rapport de 1: 1. Générer à partir de cellules HEK293 surnageant de culture confluente HEK293 qui ont été centrifugées pendant 15 min à 4966 x g. </li><li> Le jour suivant, remplacer le milieu de culture avec du milieu contenant 1,50; mg / ml de généticine. Changer les médias une fois par semaine. Si les cellules forment une monocouche confluente, les transférer sur une plaque de 24 puits. Sous-cultiver les cellules deux fois par semaine dans un rapport de 1: 5 dans un milieu contenant 1,5 mg / ml de généticine. Enfin, l&#39;analyse du pourcentage de cellules positives pour la GFP par analyse par immunotransfert et cytométrie de flux. </li></ol> 2. Analyse des lignées cellulaires stables par analyse immunoblot <ol><li> Retirer le surnageant et laver les cellules adhérentes une fois avec du PBS chaud. Reprendre les cellules dans 100 ul de 2x Laemmli tampon d&#39;échantillon, de la chaleur pendant 5 min à 95 ° C et à -20 ° C. </li><li> Charge d&#39;environ 4 x 10 4 cellules par échantillon sur un gel SDS-PAGE à 12%. En outre, la charge 6 ul d&#39;une échelle de protéines commercial en tant que marqueur de poids moléculaire. Exécuter gels dans un système d&#39;électrophorèse sur gel dans une tension constante de 180 V pendant 45 à 60 min avec du tampon Laemmli 1x fonctionnement. </li><li> Blot protéines sur des membranes de PVDF (taille des pores de 0.45 pm) à une tension constante de 16 V pendant 60 min en utilisant un Trans-Blot SD cellule de transfert semi-sec. </li><li> membranes de blocs dans 10 ml de lait en poudre écrémé 5% dans PBS / 0,05% de Tween 20 (MPT) pour 1 heure à température ambiante. </li><li> Diluer 4 ul d&#39;anticorps anti-GFP dans 4 ml de MPT et incuber les membranes O / N à 4 ° C. </li><li> Effectuer trois 10 min étapes de lavage avec 10 ml de PBS / Tween 20 0,05%. </li><li> Incuber les membranes avec 0,8 ul d&#39;anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort-dans 4 ml de MPT. </li><li> Après 1 heure d&#39;incubation à température ambiante, laver les membranes trois fois avec du PBS / 0,05% de Tween 20 (comme décrit dans 2.6) et détecter l&#39;activité de la peroxydase de raifort avec un kit commercial selon le protocole du fabricant. Appliquer équipement standard pour le développement du film à visualiser les bandes de protéines. </li></ol> 3. Analyser les cellules en utilisant un cytomètre de flux. <ol><li> Remettre en suspension les cellules dans du PBS. Utiliser des cellules HEK293 comme contrôle négatif pour ajuster avant scAtter (FSC) et de la diffusion latérale (SSC), de sorte que les cellules sont à l&#39;échelle. Tracer une grille sur des cellules vivantes en excluant les doublets de cellules, les agrégats et les débris cellulaires. </li><li> Ajustez le tube photomultiplicateur (PMT) gain de sorte que les cellules non colorées sont à l&#39;extrême gauche de l&#39;histogramme pour le canal FL1 (488 nm laser argon). </li><li> Pour analyser l&#39;intensité de fluorescence des cellules HEK293-GFP et HEK293-GFP-CAEB ouvrir l&#39;histogramme du canal FL1 et acquérir 10.000 événements de la population fermée. </li><li> Analyser les données en utilisant FACS commerciales logiciel d&#39;analyse. </li></ol> 4. La transfection de la lignée cellulaire stable avec le système de vecteur d&#39;expression inductible <ol><li> cellules HEK293 de semences exprimant de manière stable la GFP ou la GFP-CAEB dans une plaque à 12 puits à une densité de 1 x 10 5 cellules / puits. </li><li> 19 heures après l&#39;ensemencement, co-transfecter les cellules avec régulateur plasmide et la réponse plasmide codant soit Bax ou caspase 3. <ol><li> Co-transfecter les cellules HEK293 stablesavec 100 ng de pWHE125 plasmide régulateur-P (figure 2) et 100 ng de plasmides d&#39;intervention pWHE655-hBax ou pWHE655-revCasp3 (figure 3) et 0,4 ul de polyéthylène-imine. </li><li> Préparer l&#39;ADN et polyéthylènimine réactif de transfection chacun dans 75 pi de milieu Opti-MEM et incuber pendant exactement 5 minutes à température ambiante. Pour la formation du complexe, les deux mélanges incuber ensemble pendant 15 min à température ambiante. </li></ol></li><li> Ajouter la solution goutte à goutte aux cellules polyéthylèneimine / ADN et incuber à 37 ° C dans 5% de CO2. </li></ol> 5. induction de l&#39;apoptose <ol><li> 5 heures après la transfection, induire l&#39;expression des protéines pro-apoptotiques par addition de 1 ug / ml de doxycycline dans le milieu de culture. Incuber les cellules pendant 18 heures à 37 ° C dans 5% de CO2. </li></ol> 6. Analyse de la cellule hôte apoptose par analyse immunoblot <ol><li> Inspectez cellules avant harvesting sous le microscope optique pour vérifier la mort des cellules induction. Les cellules apoptotiques sont détectables par la présence de corps apoptotiques qui entourent la cellule meurt. </li><li> Retirer le surnageant et laver les cellules adhérentes une fois avec du PBS chaud. Reprendre les cellules dans 100 ul de 2x Laemmli tampon d&#39;échantillon, de la chaleur pendant 5 min à 95 ° C et à -20 ° C. </li><li> Charge d&#39;environ 4 x 10 4 cellules par échantillon sur un gel SDS-PAGE à 12%. En outre, la charge 6 ul d&#39;une échelle de protéines commercial en tant que marqueur de poids moléculaire. Exécuter gels dans un système d&#39;électrophorèse sur gel dans une tension constante de 180 V pendant 45 à 60 min avec du tampon Laemmli 1x fonctionnement. </li><li> Blot protéines sur des membranes de PVDF (taille de pores de 0,45 um) à une tension constante de 16 V pendant 60 min en utilisant une cellule de transfert semi-sec Trans-Blot SD. </li><li> membranes de blocs dans 10 ml de lait en poudre écrémé 5% dans PBS / 0,05% de Tween 20 (MPT) pour 1 heure à température ambiante. </li><li> Diluer 4 μl d&#39;anticorps anti-poly clivé ADP-ribose polymerase (PARP) dans 4 ml de MPT et incuber O / N à 4 ° C. </li><li> Effectuer trois 10 min étapes de lavage avec 10 ml de PBS / Tween 20 0,05%. </li><li> Incuber membranes avec 0,8 Anticorps secondaires ul de la peroxydase de raifort conjugué dilué dans 4 ml MPT. </li><li> Après 1 heure d&#39;incubation à température ambiante, laver les membranes trois fois avec du PBS / 0,05% de Tween 20 (comme décrit dans 6.7) et détecter l&#39;activité de la peroxydase de raifort avec un kit commercial selon le protocole du fabricant. Appliquer équipement standard pour le développement du film à visualiser les bandes de protéines. </li><li> Éliminer les anticorps liés par incubation de 30 min à température ambiante avec 7 ml Western Blot Décapage tampon. </li><li> Après trois lavages avec du PBS / 0,05% de Tween 20 (comme décrit dans 6.7), la sonde les membranes avec 4 ul d&#39;anticorps anti-actine dans 4 ml de MPT O / N à 4 ° C. </li><li> Après trois étapes de lavage avec MPT (comme décrit dans 6.7), incuber les membranes avec 0,8 ul d&#39;hodes anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de rseradish dilués dans 4 ml de MPT. </li><li> Après 1 heure d&#39;incubation à température ambiante, laver les membranes trois fois avec du PBS / 0,05% de Tween 20 (comme décrit dans 6.7 et détecter l&#39;activité de la peroxydase de raifort avec un kit commercial selon le protocole du fabricant. Appliquer équipement de série pour le développement de films à visualiser les bandes de protéine. Remarque: Toutes les étapes d&#39;incubation ont été réalisées sur un agitateur de plaque pendant le temps indiqué et la température. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

De nombreuses bactéries pathogènes hébergent des systèmes de sécrétion ou de sécréter des protéines effectrices translocation bactérienne dans la cellule hôte. Ces protéines effectrices ont la capacité de moduler les processus et les voies dans la cellule hôte, ce qui permet aux bactéries de survivre et de se répliquer à l&#39;intérieur de leur niche intracellulaire respectif. Comprendre les activités biochimiques et les mécanismes moléculaires des protéines effectrices aidera à une meilleure comp...

La virulence de nombreuses bactéries pathogènes Gram négatif dépend de systèmes de sécrétion spécialisés de détourner des cellules hôtes eucaryotes. Les bactéries utilisent ces systèmes de sécrétion d&#39;injecter des protéines de virulence bactérienne (effecteurs) dans la cellule hôte afin de moduler une variété d&#39;activités cellulaires et biochimiques. L&#39;étude des protéines effectrices a non seulement fourni un remarquable aperçu sur les aspects fondamentaux de interactions hôte / pathogène mais aussi dans la biologie fondamentale des cellules eucaryotes 1. La modulation de l&#39;apoptose de la cellule hôte a été démontré être un mécanisme de virulence important pour de nombreux agents pathogènes intracellulaires, et un certain nombre de protéines effectrices de modulation de l&#39;apoptose ont été identifiés 9.2. Cependant, les mécanismes moléculaires précis d&#39;activité demeurent insaisissables dans de nombreux cas. Apoptose, une forme de mort cellulaire programmée, joue un rôle important dans les réponses immunitaires à l&#39;infection 10. Deux principales voies conduisant à l&#39;apoptose ontété identifiés: le ciblage des mitochondries (apoptose intrinsèque) ou la transduction directe du signal par les récepteurs de mort cellulaire à la membrane plasmique (apoptose extrinsèque). La voie de la mort cellulaire intrinsèque ou à médiation par les mitochondries est déclenché par des signaux intracellulaires et implique l&#39;activation de Bax et Bak, deux membres pro-apoptotiques de la famille Bcl-2. Cette famille est composée de protéines régulatrices pro- et anti-apoptotiques qui contrôlent la mort des cellules 11-14. L&#39;activation de l&#39;apoptose conduit à une oligomérisation de Bax et Bak suivi ultérieur par perméabilisation de la membrane externe des mitochondries, ce qui entraîne la libération du cytochrome C dans le cytoplasme. Libération de cytochrome c initie l&#39;activation des caspases effectrices 3 et 7 par activation de la caspase 9 dans le apoptosome 15. Cela conduit à la protéolyse de substrats sélectionnés qui, entre autres, des résultats de l&#39;exposition de la phosphatidylsérine sur la surface de la cellule 16 et libère une DNase dédié qui fragmente chromatin 17,18. Afin de déterminer l&#39;emplacement dans la cascade apoptotique une protéine effectrice individuel gêne, un système d&#39;expression inductible a été utilisé 19. Les systèmes de régulation pour l&#39;expression conditionnelle de transgènes ont été un outil précieux dans l&#39;analyse de la fonction d&#39;une protéine dans la cellule ou de son importance pour les tissus, organes et le développement de l&#39;organisme, ainsi que lors de l&#39;initiation, la progression et l&#39;entretien de la maladie 20-23. Typiquement, les systèmes de contrôle inductibles, tels que le système Tet 24 employée ici, forment une unité de transcription artificielle (voir Figure 1). Un composant est un facteur de transcription appelé tTA conçue artificiellement (transcription activateur tétracycline-dépendant), formé par fusion de répresseur de la transcription bactérienne 25 TetR à un domaine de protéine de mammifère qui médie l&#39;activation transcriptionnelle ou taire 24,26. Le deuxième composant est un hybridepromoteur, appelé TRE (élément de tetracycline sensible), consistant en un promoteur minimal eucaryote, contenant au moins une boîte TATA et un site d&#39;initiation de transcription, reliée à plusieurs répétitions de la site de liaison à l&#39;ADN apparenté pour TetR, tetO 24,25. Le troisième composant est le ligand naturel de TetR, la tétracycline ou un de ses dérivés, tels que la doxycycline ou 25 anhydrotétracycline. Lors de l&#39;addition de ligand dans le milieu de culture, TetR perd son affinité pour tetO et se dissocie du TRE. De ce fait, la transcription du gène cible est supprimée. L&#39;expression du transgène peut, ainsi, être étroitement contrôlé d&#39;une manière temps et dose-dépendante à la fois dans la culture cellulaire et chez les animaux 20,23,24. Avec tTA, l&#39;expression du transgène se produit de manière constitutive, sauf en présence d&#39;une tetracycline. Cela peut être un inconvénient dans l&#39;étude des protéines cytotoxiques ou oncogènes parce tétracycline doit d&#39;abord être retiré du système, avant transgène expression se produit et les effets de la protéine cible sur la cellule peut être surveillé. Cela peut prendre beaucoup de temps et ne sont pas toujours complète, en particulier dans 27 des animaux transgéniques. Pour remédier à cette limitation, un mutant avec TetR une réponse inverse de la présence de doxycycline a été utilisé pour générer un nouveau facteur de transcription, rtTA (tTA inverse) 28. Il se lie uniquement au TRE et, de façon concomitante, active la transcription en présence de doxycycline. Perméabilité résiduelle du système, à savoir., L&#39;expression du transgène en l&#39;absence de TRE lié facteur de transcription, provenant soit (i) d&#39;effets de position à un site d&#39;intégration génomique, (ii) à partir du TRE lui-même 29, ou (iii) de non spécifique de la liaison de tTA / rtTA 28, a été adressée par l&#39;introduction d&#39;un silencieux de transcription supplémentaire, appelée TTS (dépendant de la tétracycline silencieux transcription) 30 dans le système. Il forme un réseau de régulateur double avec rtTA (voir Figure 1).En l&#39;absence de doxycycline, TTS se lie à TRE et arrête toute transcription reste activement. En présence de doxycycline, TTS dissocie de TRE et rtTA lie induire simultanément l&#39;expression du gène cible. Cette couche supplémentaire de rigueur est souvent nécessaire pour exprimer des protéines cytotoxiques très actifs 31-34. Grâce à ce système à double régulateur étroitement contrôlé, la cascade apoptotique peut être initié à une étape définie permettant l&#39;analyse de savoir si la protéine effecteur donné peut interférer avec induction d&#39;apoptose. Cette méthode ne peut pas être utilisé pour étudier l&#39;activité anti-apoptotique des protéines effectrices bactériennes mais également pour l&#39;expression inductible de protéines pro-apoptotiques ou toxiques, ou pour disséquer les interférences avec d&#39;autres voies de signalisation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365752001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>CP11.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscienes</td>
			<td>23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-8000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-3940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP&#160;</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>A6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cleaved PARP</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>611038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG (H+L)-HRPO</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Plus Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying an inducible expression system to study interference of bacterial virulence factors with intracellular signaling

La technique présentée ici permet d&#39;analyser une étape au cours de laquelle une protéine cible, ou en variante, une petite molécule, interagit avec les composants d&#39;une voie de signalisation. La méthode est basée, d&#39;une part, sur l&#39;expression inductible d&#39;une protéine spécifique pour initier un événement de signalisation à un pas prédéterminé et défini dans la cascade de signalisation sélectionné. Expression concomitante, d&#39;autre part, du gène d&#39;intérêt permet alors l&#39;investigateur d&#39;évaluer si l&#39;activité de la protéine cible exprimée est situé en amont ou en aval de l&#39;événement de signalisation initiée, en fonction de l&#39;affichage de la voie de signalisation qui est obtenue. Ici, la cascade apoptotique a été choisi comme une voie de signalisation définis pour démontrer la fonctionnalité de protocole. Les bactéries pathogènes, telles que Coxiella burnetii, translocation des protéines effectrices qui interfèrent avec l&#39;induction de la mort de la cellule hôte dans la cellule hôte afin d&#39;assurer la survie des bactéries dans la cellule et pour promouvoir leurla diffusion dans l&#39;organisme. Les C. protéines effectrices burnetii CAEB inhibe efficacement la mort de la cellule hôte après l&#39;induction de l&#39;apoptose avec la lumière UV ou à la staurosporine. Pour affiner à quelle étape CAEB interfère avec la propagation du signal apoptotique, protéines sélectionnées ayant une activité pro-apoptotique bien caractérisé ont été exprimés de manière transitoire dans une manière de doxycycline inductible. Si CAEB agit en amont de ces protéines, l&#39;apoptose se dérouler librement. Si CAEB agit en aval, la mort cellulaire sera inhibée. Les protéines d&#39;essai ont été sélectionnés Bax, qui agit au niveau de la mitochondrie, et de la caspase 3, ce qui est la principale protease exécuteur. CAEB interfère avec la mort cellulaire induite par l&#39;expression de Bax, mais pas par la caspase 3 expression. CAEB, par conséquent, coopère avec la cascade apoptotique entre ces deux protéines.

Premièrement, des lignées de cellules HEK293 exprimant de manière stable la protéine d&#39;intérêt (CAEB) en tant que protéine de fusion GFP ont été établies. A titre de témoin, les lignées cellulaires HEK293 exprimant de manière stable GFP ont également été générées. L&#39;expression de la GFP et GFP-CAEB a été vérifiée par analyse par immunotransfert. Le représentant immunoblot (figure 4A) démontre l&#39;expression stable et clairement détectable de la GFP et GFP-CAEB. Cepend...

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Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

L&#39;application d&#39;un système d&#39;expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.1K vues.  Friedrich-Alexander-Universität. The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

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Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

L&#39;infection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Recherche

Immunologie et infection

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and tomato. The susceptibility of M. sexta larvae to a variety of entomopathogenic bacterial species1-5, as well as the wealth of information available regarding the insect's immune system6-8, and the pending genome sequence9 make it a good model organism for use in studying host-microbe interactions during pathogenesis. In addition, M. sexta larvae are relatively large and easy to manipulate and maintain in the laboratory relative to other susceptible insect species. Their large size also facilitates efficient tissue/hemolymph extraction for analysis of the host response to infection.
The method presented here describes the direct injection of bacteria into the hemocoel (blood cavity) of M. sexta larvae. This approach can be used to analyze and compare the virulence characteristics of various bacterial species, strains, or mutants by simply monitoring the time to insect death after injection. This method was developed to study the pathogenicity of Xenorhabdus and Photorhabdus species, which typically associate with nematode vectors as a means to gain entry into the insect. Entomopathogenic nematodes typically infect larvae via natural digestive or respiratory openings, and release their symbiotic bacterial contents into the insect hemolymph (blood) shortly thereafter10. The injection method described here bypasses the need for a nematode vector, thus uncoupling the effects of bacteria and nematode on the insect. This method allows for accurate enumeration of infectious material (cells or protein) within the inoculum, which is not possible using other existing methods for analyzing entomopathogenesis, including nicking11 and oral toxicity assays12. Also, oral toxicity assays address the virulence of secreted toxins introduced into the digestive system of larvae, whereas the direct injection method addresses the virulence of whole-cell inocula.
The utility of the direct injection method as described here is to analyze bacterial pathogenesis by monitoring insect mortality. However, this method can easily be expanded for use in studying the effects of infection on the M. sexta immune system. The insect responds to infection via both humoral and cellular responses. The humoral response includes recognition of bacterial-associated patterns and subsequent production of various antimicrobial peptides7; the expression of genes encoding these peptides can be monitored subsequent to direct infection via RNA extraction and quantitative PCR13. The cellular response to infection involves nodulation, encapsulation, and phagocytosis of infectious agents by hemocytes6. To analyze these responses, injected insects can be dissected and visualized by microscopy13, 14.

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

The method described here utilizes direct injection of entomopathogenic bacteria into the hemocoel of Manduca sexta insect larvae. M. sexta is a commercially available and well-studied insect. Thus, this method represents a simple approach to analyzing host-bacterial interactions from the perspective of one or both partners.

L&#39;élevage et de l&#39;injection de<em&gt; Manduca sexta</emLes larves&gt; pour évaluer la virulence bactérienne

Manduca sexta, commonly known as the tobacco hornworm, is considered a significant agricultural pest, feeding on solanaceous plants including tobacco and ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Mise en place d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Système d&#39;étudier le comportement intracellulaire de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En droits macrophages THP-1

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

Après en temps réel l&#39;impact des facteurs de virulence contre le pneumocoque dans une souris modèle pneumonie aiguë avec bactéries bioluminescentes

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

Application de nanoparticules fluorescentes pour étudier Rénovation du système Endo-lysosomale par des bactéries intracellulaires

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Mise en place d&#39;un programme d&#39;installation à haut débit pour le criblage de petites molécules qui modulent c-di-GMP Signalisation dans<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse des Lymphocytes extravasation L&#39;utilisation d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

Identification de marqueurs de Virulence de Mycobacterium abscessus de réplication intracellulaire dans les Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to visceral lesions. Currently, 12 million people are estimated to be infected with Leishmania worldwide and over 1 billion people live at the risk of infection. Leishmania amazonensis is endemic in Central and South America and usually leads to the cutaneous form of the disease, which can be directly visualized in an animal model. Therefore, L. amazonensis strains are good models for cutaneous leishmaniasis studies because they are also easily cultivated in vitro. C57BL/6 mice mimic the L. amazonensis-driven disease progression observed in humans and are considered one of the best mice strains model for cutaneous leishmaniasis. In the vertebrate host, these parasites inhabit macrophages despite the defense mechanisms of these cells. Several studies use in vitro macrophage infection assays to evaluate the parasite infectivity under different conditions. However, the in vitro approach is limited to an isolated cell system that disregards the organism&#39;s response. Here, we compile an in vivo murine infection method that provides a systemic physiological overview of the host-parasite interaction. The detailed protocol for the in vivo infection of C57BL/6 mice with L. amazonensis comprises parasite differentiation into infective amastigotes, mice footpad cutaneous inoculation, lesion development, and parasite load determination. We propose this well-established method as the most adequate method for physiological studies of the host immune and metabolic responses to cutaneous leishmaniasis.

In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice

Here, we present a compiled protocol to evaluate the cutaneous infection of mice with Leishmania amazonensis. This is a reliable method for studying parasite virulence, allowing a systemic view of the vertebrate host response to the infection.

Infection in vivo avec l’amazonense de Leishmania pour évaluer la virulence parasite chez les souris

Leishmania spp. are protozoan parasites that cause leishmaniases, diseases that present a wide spectrum of clinical manifestations from cutaneous to ...