Nous sommes reconnaissants à Lonza Group Ltd pour le parrainage de cette publication en couvrant les frais de publication. Nous remercions la Deutsche Infarktforschungshilfe, Wilhelm-Vaillant-Stiftung, Ernest-Solvay-Stiftung, et la Thüringer Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Kultur soutien financier pour SL.

1. Predifferentiation de THP-1 macrophages <ol><li> Cultiver cellules THP-1 dans du milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10% (v / v) de sérum de veau foetal (FCS) et 1% (v / v) de pénicilline / streptomycine / L-glutamine (PSG) en CO 2 (5% ) incubateur à 37 ° C. </li><li> Avant la transfection, les cellules diviser et de les transférer à un milieu RPMI fraîche comme avant. Cultiver des cellules pendant 24 heures. </li><li> Graine de 1,0 à 1,5 x 10 7 cellules dans une culture 75 cm ² de tissu ou de ballon 2,5 x 10 7 cellules dans un tissu de 150 cm ² flacon de culture dans du milieu RPMI-1640 et ajouter 10% (v / v) de SVF, 1% (v / v) le PSG, 1% (v / v) de pyruvate de sodium, 1% (v / v) d&#39;acides aminés non essentiels, 10 ng / ml de PMA et 50 uM β-mercaptoéthanol pendant 48 heures. </li></ol> 2 Préparation de nucléofection <ol><li> Placez Accutase I et tous les médias dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Aspirer le milieu de culture de ballon et de le remplacer avec 6 ml (75 cm ² ballon) ou 12 ml (150 cm ²) de ballonAccutase I et incuber pendant 30 min à 37 ° C pour le plein détachement des cellules. Observer la morphologie des cellules après le traitement Accutase je faire en sorte que les cellules ont une apparence ronde. Si certaines cellules semblent encore être fixée, rincer soigneusement le ballon avec une micropipette ou tapotez doucement à compléter détachement. Ne pas utiliser de grattoirs de cellules, car cela aura un effet négatif sur la vitalité des cellules. Transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml. </li><li> Pendant le traitement Accutase I, préparer les supports suivants: <ol><li> Préparer milieu de transfection: supplément de milieu de culture de cellules avec 1% (v / v) de PSG, 1% (v / v) d&#39;acides aminés non essentiels, 1% (v / v) de pyruvate de sodium et 5% (v / v) de sérum humain (par siRNA) ou 20% (v / v) de sérum humain (pour l&#39;ADN de plasmide); préparer un volume final soit de 3 ml / échantillon pour une plaque à 6 puits ou 4 ml / échantillon pour deux plaques de 12 puits. </li><li> Préparer milieu de culture: milieu de culture de complément à 1% (v / v) de PSG, 1% (v / v) d&#39;acides aminés non essentiels, 1% (v / v) de pyruvate de sodium et 5% (v / v) hul&#39;homme du sérum (par siRNA) ou 20% (v / v) de sérum humain (pour le plasmide), 2,5 ng / ml de PMA et 50 uM β-mercaptoéthanol; préparer un volume final soit de 3 ml / échantillon pour une plaque à 6 puits ou 4 ml / échantillon pour deux plaques de 12 puits. </li></ol></li><li> Centrifuger la suspension de cellules pendant 5 min à 300 x g à température ambiante. </li><li> Aspirer Accutase cellules I et remettre en suspension dans 1 ml de milieu RPMI préchauffé à 37 ° C; compter les cellules pour déterminer le nombre de cellules. REMARQUE: Lorsque les procédures de comptage de cellules automatiques rapides sont utilisés, les étapes 2.4 et 2.5 peuvent être omis et les cellules peuvent être prises en compte immédiatement après détachement à condition que l&#39;exposition prolongée à Accutase I est évitée. </li><li> Pour chaque échantillon de transfection préparer des aliquotes dans des tubes à centrifuger contenant de 2,0 à 2,5 x 10 6 cellules. </li></ol> 3. nucléofection de THP-1 macrophages <ol><li> Centrifuger les aliquotes de 10 min à 250 x g à température ambiante. </li><li> Diluer l&#39;ADN plasmidique ou siRNA sans nucléasede l&#39;eau ou un tampon approprié. Maintenir le volume requis d&#39;ADN plasmidique ou siRNA aussi faible que possible. </li><li> Préparer une cuvette Nucleofector avec soit 1 ug d&#39;ARNsi ou 0,5 pg d&#39;ADN de plasmide pour chaque transfection. </li><li> Effectuez l&#39;une transfection à la fois. Aspirer le surnageant de aliquote de cellules. </li><li> Remettre en suspension culot de cellules en solution Nucleofector pour obtenir un volume total de 100 ul d&#39;ADN / siRNA et solution Nucleofector. Maintenir le temps d&#39;exposition à la solution pure Nucleofector à un minimum et de veiller à ce que le temps d&#39;exposition ne dépasse pas 15 min. </li><li> Mélanger les cellules remises en suspension et de l&#39;ADN / siRNA Nucleofector cuvette en tapotant légèrement. </li><li> transfecter des cellules en effectuant programme Y-001 dans le dispositif de 2b Nucleofector. </li><li> Transférer les cellules transfectées dans un flacon de réaction à l&#39;aide de pipettes Pasteur en matière plastique jetable. </li><li> Immédiatement ajouter 500 ul de milieu de transfection préparée. </li><li> Répéter les étapes 3.4 à 3.9 pour chaque échantillon de transfection. </li></ol><ol><li> Préparer une ou l&#39;autre de 6 puits ou des plaques de 12 puits pour les cellules transfectées. Introduire à la pipette 2,5 ml de milieu de transfection dans chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits (puits 1 / transfection) ou 1,75 ml de milieu de transfection dans chaque puits d&#39;une plaque de 12 puits (2 puits / transfection). </li><li> Mélanger soigneusement les suspensions de cellules avec une micropipette. </li><li> Transférer les cellules transfectées dans les puits préparés (soit un puits dans une plaque à 6 puits ou deux dans une plaque à 12 puits). </li><li> Incuber les plaques pendant 4 heures dans un incubateur humidifié (5% de CO 2, 37 ° C). </li><li> Vérifiez rattachement des cellules au microscope. NOTE: La majorité des cellules doit être adhérente à nouveau. De temps en temps, l&#39;extension de la période d&#39;incubation de 1 h augmente le nombre de cellules adhérentes en cas de rattachement insuffisant. </li><li> Aspirer soigneusement milieu de transfection avec une micropipette et la remplacer par la même quantité de milieu de culture. Aspirer ainsi seulement une à la fois. </li> &lt;li&gt; Incuber les cellules pendant la période de temps nécessaire pour que l&#39;effet maximal de plasmide ou de siRNA (24-72 h). Si les périodes d&#39;incubation dépasse pas 48 heures, remplacez moyen après 48 heures. </li><li> Pour un traitement supplémentaire avec les effecteurs (par exemple., Les cytokines, agonistes, antagonistes et inhibiteurs) utilisent milieu sans sérum sans PMA et β-mercaptoéthanol. Le temps de la fin de la période d&#39;incubation de l&#39;effecteur à la fois de l&#39;effet maximal de plasmide ou de siRNA et de planifier le changement de milieu et addition de l&#39;effecteur en conséquence. Ne pas maintenir les cellules dans des conditions sans sérum pendant plus de 24 heures. </li></ol>

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Le protocole décrit ici présente un moyen fiable et efficace pour la transfection de cellules THP-1 macrophages qui sont généralement assez difficiles à transfecter. La transfection peut être réalisée avec des efficacités de transfection supérieures à 90% pour les siRNA sans réduction significative de la vitalité des cellules. Efficacité de plasmides peuvent être moins en raison de leur taille, mais transfection efficacité de l&#39;ordre de 70% peuvent être généralement obtenus. L&#39;efficacité de l&#39;effet de choc induite par le siRNA peut atteindre 80 à 90% en fonction du siRNA appliqué. Un avantage majeur de ce protocole est que cela n&#39;interfère pas avec la différenciation cellulaire. Après transfection, les cellules répondent toujours normalement à l&#39;agent de différenciation PMA (Figure 1A à 1B et figure 4) 12. De plus la polarisation cellulaire par des stimuli tels que des cytokines IL-10 ou LPS / IFN 12 n&#39;est pas affectée, même si cela dépend également fortement sur ​​le support sélectionné pour une culture après transfections indique la figure 4. Il ya plusieurs options dans la procédure qui peut être modifié afin d&#39;adapter le protocole à des exigences spécifiques. Les cellules Comme le montre la Figure 4 réagissent différemment au même stimulus IL10 selon le milieu de culture choisi après la transfection. Ceci indique que la composition du milieu a une forte influence sur le comportement cellulaire. Comme l&#39;effet imposée par le milieu peut être différente pour différents stimuli expérimentaux, il est possible que le milieu optimal peut changer et par conséquent il est nécessaire de vérifier l&#39;aptitude du moyen de différentes expériences de façon indépendante. Toutefois, le milieu RPMI-1640, qui est le moyen par défaut utilisé pour la culture de cellules THP-1, s&#39;est avérée peu adaptée à la culture après la transfection par une perte significative de la vitalité des cellules a été observée. En outre, le protocole peut également être appliqué à des monocytes THP-1 sans la différenciation induite par le PMA-avant, cettesupprime évidemment la nécessité pour le détachement des cellules au cours de la procédure, mais les étapes restantes ne doivent pas être ajustés. Les monocytes THP-1 peuvent être différenciés par la suite si nécessaire. Les éléments les plus critiques du protocole sont d&#39;une part le détachement et d&#39;autre part le temps nécessaire pour la transfection. Le détachement doit être effectuée le plus doucement possible, afin de maintenir la viabilité des cellules haute. Par conséquent, nous vous recommandons le détachement enzymatique relativement doux par Accutase je cours Méthodes très agressifs tels que la trypsine. D&#39;autres procédés tels que le traitement de détachement de lidocaïne ou de raclage sont avérées plutôt nuisible et ne doivent pas être utilisés. Dans le cas que de 30 min de traitement Accutase je ne devrait pas être suffisante pour détacher les cellules correctement ce qui est généralement une indication de la solution a été mal enregistré ou expiré Accutase I ou de trop nombreux cycles de gel-dégel. Nous avons obtenu de bons résultats par le stockage de petites fractions de Accutase je à -20 °C pour réduire le nombre de cycles de gel-dégel. Cependant, quand il ya détachement insuffisante soit remplacer Accutase I avec Accutase frais ou augmenter le temps d&#39;incubation allant jusqu&#39;à 1 h. En outre tapotant doucement ou de rinçage de la fiole ou de la plaque peut aider détachement. En ce qui concerne le temps nécessaire à la transfection, le temps d&#39;exposition des cellules à la solution pure Nucleofector a obtenu fort impact sur la survie des cellules et par conséquent doit être aussi courte que possible. La meilleure façon d&#39;y parvenir est d&#39;effectuer chaque transfection à la fois (étapes 2.10 à 2.15) et non plusieurs transfections en parallèle. Si knockdown efficacité est faible, ce n&#39;est pas habituellement causée par une faible efficacité de transfection, mais ceci peut être facilement vérifiée en utilisant la cytométrie en flux ou microscopie à fluorescence et siRNA marqué par fluorescence ou un plasmide codant pour la GFP. La plupart du temps la cause est un ADN plasmidique siRNA ou inefficace. Dans ces conditions, il doit être considéré pour augmenter la quantité de siRNA (jusqu&#39;à 3.2 pg) oul&#39;ADN plasmidique (jusqu&#39;à 1-2 pg) ou d&#39;utiliser un siRNA ou vecteur d&#39;expression différente si disponible. En variante, des résultats satisfaisants peuvent également être obtenus en utilisant un pool de plusieurs ARNsi différents dirigés contre la même cible. En outre, des expériences de cours à temps pourraient être nécessaires pour déterminer avec précision la durée de l&#39;effet maximal, qui est généralement atteint après 24 à 72 heures après transfection. En dehors de la transfection par électroporation il existe en outre des techniques bien établies pour la transfection de cellules de mammifères. Fréquemment les systèmes utilisés sont des agents de transfection chimiques qui peuvent former des complexes avec l&#39;acide nucléique de la cargaison et de faciliter le transport dans les cellules. Les réactifs les plus fréquemment utilisés sont soit basés sur différentes espèces lipidiques ou peuvent être choisis parmi un certain nombre de polymères cationiques 3. Pour les deux approches, une sélection variée est disponible dans le commerce. Ces réactifs de transfection ont l&#39;avantage qu&#39;ils sont habituellementfacile à utiliser, ne nécessitent pas beaucoup de temps, et de travailler avec des cellules adhérentes ainsi, éliminant ainsi la nécessité de détachement. Malheureusement, les macrophages sont plutôt difficiles à transfecter par ces méthodes car elles ne prolifèrent pas de manière significative in vitro et possèdent des mécanismes de défense à l&#39;encontre de l&#39;ADN étranger cytosolique de 13 à 15. Ainsi, les méthodes de transfection chimique ont souvent pour résultat une forte réduction de la viabilité des cellules. Toutefois, comme indiqué sur la figure 2 il existe des agents de transfection chimiques qui peuvent transférer avec succès siRNA dans les macrophages, mais aussi par cytométrie de flux (Figure 2A) et au microscope à fluorescence (Figure 2B), les analyses indiquent qu&#39;ils ne parviennent pas à atteindre la même répartition homogène de siRNA dans les cellules en tant que obtenu par nucléofection. En fait, les données de cytométrie en flux, indiquent que deux populations différentes de cellules transfectées produisent tout d&#39;abord une population de fluorescence similaire à celle des cellules après Nucleofectisur la détection et d&#39;autre part il ya une population avec une fluorescence plus intense. Confirmation définitive est toujours nécessaire, mais nous supposons que la première population est dans la microscopie à fluorescence identique à ces cellules qui présentent une répartition homogène des siRNA fluorescent dans le cytosol tandis que la seconde population correspond probablement à des cellules avec des agglomérats très lumineux. Les données de cytométrie en flux de la Figure 2A suggèrent que les résultats de nucléofection en moins siRNA par cellule que l&#39;approche de lipofection alternative. Cependant, les données de la figure 3 montre que la même quantité relativement faible de siRNA constituée par nucléofection est déjà suffisant pour 80 à 90% de l&#39;effet de choc gène cible. Par conséquent, le montant supplémentaire de siRNA constituée par la deuxième population après transfection chimique est très probable excédent et est donc plus susceptible de causer des effets secondaires indésirables que d&#39;accroître encore l&#39;efficacité de knockdown. En dehors de celaformation d&#39;agglomérats intracellulaires est déjà en soi indésirable puisque ces molécules de siARN sont susceptibles de ne pas fonctionnelle ou au moins moins efficace que les molécules de siARN libres et peuvent provoquer des effets ponctuels de cibles. En outre, la vraie nature de ces agglomérats n&#39;est pas encore clair. Il est possible que ces points lumineux représentent endosomes indiquant que le siRNA a été internalisée par les cellules, mais par la suite libérer des endosomes et n&#39;ont pas le siRNA reste piégé et donc inefficace. En variante, les points peuvent être des agglomérats qui sont formés de manière intracellulaire. Évaluations fonctionnelles de la transfection chimique sont en cours, donc pas de conclusions définitives sur l&#39;efficacité knockdown peuvent être encore faites, encore l&#39;existence de deux populations distinctes est déjà défavorable, cela signifie que tous les résultats décrivent la moyenne des deux populations, cela ne correspond donc pas à ou l&#39;autre des populations. Pour cette raison nucléofection est la meilleure approche. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Mais il ya aussi des limites à la procédure de transfection décrit ici. Etant donné que les cellules doivent être en suspension pour les cellules adhérentes nucléofection doivent être détaché, qui présente un facteur de stress supplémentaire pour les cellules. En outre, l&#39;ensemble du protocole est plutôt chronophage. Depuis transfections ne peuvent pas être réalisées simultanément, mais devra être réalisée rapidement afin d&#39;éviter d&#39;endommager la cellule, le nombre d&#39;échantillons est limitée à environ 8 - 10 par expérience. Ainsi, ce protocole n&#39;est pas adapté pour les projets de criblage à haut débit. Pour les applications à haut débit des systèmes de Nucleofector différents sont disponibles. Tout d&#39;abord, il ya le système 4D-Nucleofector qui offre un format de bande 16 de bien. Pour encore plus le débit, il ya le système de navette à 96 puits et 384 puits système HT Nucleofector. Cependant, comme ces nouveaux systèmes fonctionnent avec des électrodes conductrices de polymère à la place de l&#39;aluminium et donc des conditions électriques, à savoir les programmes et les composition de solution Nucleofector, ont évolué en conséquence, il doit être déterminé si notre protocole peut être transféré à ces systèmes. Cependant, malgré ces limitations du protocole présenté ici ne donne une transfection fiable et efficace des cellules THP-1 qui est supérieure à toutes les autres approches non virales. Ce protocole permet à l&#39;enquête sur les effets de l&#39;expression du gène altéré dans cellules THP-1 qui, dans tous les autres aspects de différencier et de polariser normalement et ainsi montrer que peu d&#39;effets secondaires de transfection que possible.

Parmi les composants cellulaires du système immunitaire humain, les macrophages sont d&#39;une grande importance pour la réponse immunitaire innée. Leurs tâches sont diverses; elles sont impliquées dans la phagocytose des agents pathogènes et des tissus nécrotiques, ils jouent un rôle important dans l&#39;homéostasie tissulaire et produisent et sécrètent un grand nombre de cytokines et de réguler orchestrer la réponse immunitaire 1. Par conséquent macrophages sont intégralement impliqués dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques conditions. En raison de la diversité de leurs tâches, les macrophages sont un type de cellule très hétérogène et multiforme. Ce résultat est obtenu par des polarisations différentes; selon les macrophages de stimuli externes peut se développer en différents phénotypes 2. La variabilité et de l&#39;impact de macrophages sur la réponse immunitaire en font un très intéressant sujet de recherche. Afin d&#39;élucider leur métabolique complexe et les fonctions de réglementation, de macrophages approprié dans des modèles in vitro sont required qui reflètent correctement macrophages hétérogénéité et la variabilité. La transfection de cellules avec des vecteurs d&#39;ADN plasmidique ou de petits ARN interférents (siRNA) afin de modifier l&#39;expression des gènes cellulaire est devenu un outil largement utilisé et puissant en biologie cellulaire pour étudier la fois la régulation des gènes et la fonction des gènes. Actuellement, il ya un grand choix de différents outils disponibles pour la transfection de cellules eucaryotes. Ces outils comprennent l&#39;application des vecteurs viraux, des procédés mécaniques (telles que canons à gènes), les approches chimiques (qui dépendent de polymères ou de lipides qui peuvent former des complexes avec les acides nucléiques), et l&#39;électroporation de cellules 3. Toutes ces approches ont leurs avantages et inconvénients et le choix les mieux adaptés à partir de ce large éventail pour un type cellulaire spécifique et de l&#39;application peut être un processus long et difficile. Les macrophages sont notoirement difficiles à transfecter transfe comme presque tous bien établieapproches ction de réduire considérablement la viabilité de macrophages ou interférer avec leur comportement, c&#39;est à dire la différenciation et polarisation particulière. Par conséquent, nous présentons ici, un protocole non-viral efficace pour transfecter humains THP-1 macrophages en utilisant la technologie Nucleofector base électroporation, qui représente une approche d&#39;électroporation optimisé exigeant la réduction des quantités d&#39;ADN. Nucléofection est bien adapté pour des cellules sensibles, telles que les monocytes et les macrophages. Ce protocole est une adaptation de versions précédemment publiées 4,5. En bref, le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) est utilisé pour différencier les droits de monocytes THP-1 pendant 48 heures dans les macrophages prématurée avant la transfection avec le siRNA ou d&#39;ADN plasmidique. Pour la transfection, les macrophages predifferentiated sont détachés par voie enzymatique par traitement Accutase I. La transfection est réalisée en utilisant un dispositif d&#39;électroporation 2b Nucleofector pour des cellules. Après transfection, différerciation est poursuivi pour une autre de 24 à 48 heures selon les besoins. Enfin, les macrophages matures transfectées sont incubées avec différents types de composés pour des études fonctionnelles. Cette approche permet la transfection de lignées cellulaires telles que les humains THP-1 et les monocytes et les macrophages a été appliquée avec succès dans le passé de 6 à 10. Contrairement à la plupart des méthodes de transfection chimique, notre procédure nucléofection modifié en utilisant des macrophages prématurés donne de hauts rendements de transfection, en combinaison avec la viabilité de la cellule intacte, sans avoir besoin d&#39;utiliser des vecteurs viraux ou d&#39;ajouter d&#39;autres composés porteurs d&#39;effets secondaires inconnus. En outre, les macrophages conservent leur plein potentiel de différenciation ainsi que la polarisation permettant ainsi explorations fonctionnelles sans entrave après transfection 11. En outre, le milieu de culture cellulaire appliqué après nucléofection influe fortement sur les études fonctionnelles suivant transfection; en particulier, la capacité des macrophages de polarisation peut être influencée en fonction du milieu de culture appliquées. Voici quatre différents types de milieux de culture cellulaire (IMDM, X-VIVO 20, LGM3 et de la souris des cellules T moyen Nucleofector) ont été testés dans des conditions de désactivation utilisant l&#39;interleukine (IL) 10 Utilisation de THP-1 macrophages, nous avons observé que la cellule de réaction à l&#39;IL10 est la plus forte lorsque le milieu cellulaire de souris Nucleofector T est utilisée par rapport à l&#39;autre milieu de culture mentionné ci-dessus. Ces résultats montrent que l&#39;optimisation de l&#39;ensemble des conditions appropriées de culture cellulaire est essentielle pour la transfection réussie des études fonctionnelles suivantes und car ils peuvent améliorer de manière significative les résultats expérimentaux. Que les macrophages sont impliqués dans diverses maladies humaines, beaucoup de recherches se concentre sur l&#39;élucidation comportement des macrophages ainsi que des mécanismes régulateurs qui influent sur les macrophages ou, à son tour contrôlée par les macrophages. Par conséquent, ce protocole est de pertinence dansnombreux domaines de recherche différents.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Accutase I</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">A6964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Amino acids, nonessential</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">M11-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal calf serum (FCS gold)</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Human Monocyte Nucleofector Kit</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">VPA-1007</td>
			<td>Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Human serum off the clot</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">C11-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Isove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3)</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">CC-3211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Mouse T Cell Nucleofector Medium</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">VZB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nucleofector 2b</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">AAD-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100&#215;)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640)</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">siRNA / plasmid</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">THP-1 human leukemia monocytes</td>
			<td style="width:145px;">CLS</td>
			<td style="width:145px;">300356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue culture flasks (75 cm&#178;; 150 cm&#178;)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP90076/TPP90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue culture plates (6-well; 12-well)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP92406/TPP92012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tubes (1.5 ml)</td>
			<td style="width:145px;">StarLab</td>
			<td style="width:145px;">S 1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">X-Vivo 20 with Gentamycin</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">BE04-448Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of human thp-1 macrophages by nucleofection

Macrophages, comme des acteurs clés de la réponse immunitaire innée, sont au centre de recherche portant sur l&#39;homéostasie tissulaire ou diverses pathologies. Transfection avec le siRNA et l&#39;ADN plasmidique est un outil efficace pour l&#39;étude de leur fonction, mais transfection des macrophages n&#39;est pas une mince affaire. Bien que de nombreuses approches différentes pour la transfection de cellules eucaryotes sont disponibles, seuls quelques-uns permettent la transfection efficace et fiable des macrophages, mais la vitalité des cellules et réduit le comportement des cellules sévèrement altérée comme une diminution de la capacité de différenciation ou de la polarisation sont fréquemment observées. Par conséquent, un protocole de transfection est nécessaire, qui est capable de transférer les siRNA et de l&#39;ADN plasmidique dans les macrophages sans provoquer d&#39;effets secondaires graves, permettant ainsi l&#39;investigation de l&#39;effet de l&#39;ARNsi ou plasmide dans le cadre du comportement normal de la cellule. Le protocole présenté ici fournit un procédé fiable et efficace pour transfecter des humains THP-1 et des macrophages monocytes avec vitalité cellulaire élevée, une haute efficacité de la transfection, et des effets minimes sur le comportement des cellules. Cette approche est basée sur nucléofection et le protocole a été optimisé pour maintenir une capacité maximale pour l&#39;activation des cellules après transfection. Le protocole est suffisant pour les cellules adhérentes après détachement ainsi que des cellules en suspension, et peut être utilisée pour de petits nombres d&#39;échantillons de taille moyenne. Ainsi, le procédé présenté est utile pour étudier les effets de régulation de gènes au cours de la différenciation des macrophages et de la polarisation. Outre la présentation des résultats caractérisant les macrophages transfectées selon ce protocole par rapport à une méthode chimique de remplacement, l&#39;impact de la culture cellulaire milieu de sélection après transfection sur le comportement des cellules est également discutée. Les données présentées indiquent l&#39;importance de valider la sélection pour les différents paramètres expérimentaux.

En utilisant ce protocole de transfection de THP-1 macrophages avec des siRNA nous obtenons habituellement des taux de plus de 90% de transfection sans réduction significative de la vitalité des cellules. Figure 1 présente des données représentatives caractérisant l&#39;état des cellules 24 heures après transfection avec marqué par fluorescence siRNA contre un non transfectées contrôle, qui n&#39;ont pas été traités avec des réactifs nucléofection et le pouls ou siRNA mais a reçu tous les changements de milieux de culture, les échantillons transfectées. Sur la figure 1A la morphologie cellulaire est représentée en fonction de la mesure par cytométrie en flux. Les images microscopiques sont présentés dans la figure 1B figures 1C et 1D représentent les taux bas pour l&#39;apoptose (contrôle: 1,5%; nucléofection: 5,4%). Et une nécrose (contrôle: 2,0%; nucléofection: 3,2%) indiquant la vitalité des cellules inchangées. Nécrose et l&#39;apoptose sont légèrement plus élevés pour l&#39;échantillon transfectées comme transfectées macrophages THP-1 sont plusdifficile à détacher de cellules non transfectées, donc la probabilité de dommages aux cellules lors d&#39;augmentations de détachement. Enfin l&#39;efficacité de transfection est présenté dans la figure 1E. Comme l&#39;ensemble de la population transfectée est décalé par rapport au témoin, ce qui indique que toutes les cellules sont transfectées qui est confirmé par les images au microscope à fluorescence (Figure 2B). Les deux cytométrie de flux de données ainsi que des images microscopiques de fluorescence indiquent que toutes les cellules sont transfectées avec constante une répartition homogène de siRNA parmi les cellules, ainsi que dans les cellules. Ceci est en contraste avec de nombreux réactifs de transfection chimiques, par comparaison figures 2A et 2B montrent les données de cytométrie en flux et la fluorescence respectifs des images microscopiques d&#39;un agent de transfection chimique en utilisant une approche à base de lipides. Ces figures montrent que les deux populations distinctes de cellules transfectées peuvent être détectés. La première population est similaire aux cellules transfectées folloaile nucléofection. Ils sont caractérisés par une faible fluorescence globale et une répartition homogène de siRNA dans les cellules. La deuxième population est marquée par une fluorescence plus intense qui provient de agglomérats intracellulaires très lumineux de siRNA. La morphologie cellulaire n&#39;est pas affectée par les deux méthodes de transfection, comme indiqué par contraste interférentiel différentiel de la figure 2C. Transfections utilisant rendement de l&#39;ADN plasmide efficace des résultats similaires, pour des exemples s&#39;il vous plaît se référer à Robenek et al. (2009) 9 ou Xie et al. (2006) 7. Le choix du milieu de culture de cellules après transfection est d&#39;une grande importance; donc différents milieux de culture cellulaire ont été testés en comparaison. Les médias sélectionnés sont tous adaptés à la culture des cellules THP-1 et ont été choisis selon les recommandations de Lonza que les médias applicable pour la post-nucléofection culture. Figure 3 représente la mediat siRNAed knockdown efficacité en utilisant un siRNA dirigé contre IL10RB (interleukine chaîne d&#39;β du récepteur 10) ARNm. Pour tous les milieux testés IL10RB de l&#39;expression a été considérablement réduite à environ 10 à 20% du niveau de commande (Figure 3). Cependant, les cellules transfectées sont différentes en fonction du milieu de culture dans leur potentiel de polarisation. Macrophages THP-1 transfectées avec le siRNA soit de siRNA de contrôle non spécifique ou IL10RB spécifiques ont été cultivées dans différents médias après la transfection et traités avec IL10. Ensuite, les niveaux de la SOCS3 génique induite par l&#39;IL10 (suppresseur de signalisation des cytokines 3) au niveau de l&#39;expression de l&#39;ARNm ont été mesurés par RT-qPCR. Les différences entre les milieux de culture se produisent en ce qui concerne la mesure de l&#39;induction de l&#39;expression de l&#39;ARNm SOCS3 (figure 4), les inductions pour chacun des milieux testés cellules T de souris Nucleofector moyen, LGM3, X-VIVO 20 et IMDM étaient 19,5 [17,7 à 21,5 ], 11.5 [8,5 à 15,7], 8,0 [4,6 à 14,2] et 7.2 [5.6 à 9.5] plier, respectivement. Laapplication refore du milieu Nucleofector souris T Cell est vitale. En outre, les différences de l&#39;effet de l&#39;inactivation de l&#39;expression de IL10RB SOCS3 après traitement IL10 sont observables, les niveaux d&#39;ARNm d&#39;expression SOCS3 a été réduit à 9,5 [8.8 à 10.3] replier dans des cellules T de souris moyen Nucleofector, 2,1 [1.1 à 4.1] replient dans LGM3, 4.8 [3.2 à 7.2] plier dans X-VIVO 20 et 3.3 [2.7 à 3.9] plier en IMDM. Ces valeurs correspondent à des réductions d&#39;expression SOCS3 dans les différents médias à 49%, 18%, 60% et 45%, respectivement. Réduction de SOCS3 expression de l&#39;IL-10 induit après transfection de siARN IL10RB confirme la régulation à la baisse succès de IL10RB par la transfection. <img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" width="300" /> Figure 1: Caractérisation des THP-1 transfectées macrophages. L&#39;état caractéristique des cellules n&#39;est pas affectée révélée par microscopie optique et analyse par cytométrie de flux non transfectées control cellules THP-1 par rapport aux macrophages transfectées selon le protocole présenté. THP-1 ont été différenciées macrophages avec 10 ng / ml de PMA pendant 48 heures et transfectées avec marquage fluorescent (Alexa 488) non spécifique, siRNA contrôle. 24 h après la transfection, soit des images de cellules vivantes ont été prises (B), ou les cellules ont été détachées par traitement Accutase I et analysées par cytométrie de flux (A). L&#39;apoptose et la nécrose coloration a été réalisée en utilisant l&#39;annexine V-phycoérythrine (PE) (C) et 7-aminoactinomycine (7-AAD) (D). L&#39;efficacité de transfection (E) a été déterminée par cytométrie de flux en utilisant le marqueur fluorescent attaché au siRNA. Le signal de fluorescence des cellules transfectées (noir) est représenté par le signal de commande (gris). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width = &quot;4in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51960 / 51960fig2highres.jpg&quot; width = &quot;400&quot; /&gt; Figure 2: Comparaison de la distribution intracellulaire de siRNA après nucléofection contre lipofection THP-1. Cellules sont différenciées pendant 48 heures selon ce protocole et ensuite transfectées soit par nucléofection ou par lipofection. Les résultats de lipofection présentés ont été obtenus en utilisant le kit Xtremegene siRNA selon les recommandations du fabricant avec un rapport de charge de réactif de siRNA de 4: 1. 24 h après la transfection, les cellules ont été soit détaché avec Accutase I pour l&#39;analyse par cytométrie de flux ou au microscope évaluée avec des cellules vivantes. (A) L&#39;efficacité de transfection et la distribution de siRNA par cellule au sein de la population a été déterminée par cytométrie de flux en utilisant l&#39;étiquette de fluorescence attaché au siRNA, contrôles transfectées sans siARN sont affichées en gris, les échantillons transfectées avec le siRNA sont représentés en noir. (B) La microscopie à fluorescenceimages montrant la distribution intracellulaire de siRNA marqué par fluorescence (Alexa Fluor 488); la barre d&#39;échelle représente 40 um. (C) de l&#39;image différentielle de contraste d&#39;interférence correspondant à l&#39;image de fluorescence; la barre d&#39;échelle représente 40 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" width="500" /> Knockdown de IL10RB Figure 3 siRNA médiation dans THP-1 transfectées macrophages. Macrophages THP-1 ont été transfectées selon le protocole décrit. Après transfection, les cellules ont été cultivées dans quatre différents supports de culture, à savoir milieu Nucleofector souris des cellules T (A), IMDM (B), LGM3 (C), et X-VIVO 20 (D), complétées de la manière décrite dans la section de protocole. Caunes ont été soit transfectées avec contrôle non spécifique siRNA (Ctrl) ou IL10RB spécifique siRNA (IL10RB). Comme des contrôles supplémentaires des échantillons suivants ont été inclus: Commande d&#39;impulsion, c&#39;est à dire. les cellules qui ont subi une transfection en l&#39;absence de siRNA (Pulse), et un moyen de contrôle, c&#39;est à dire. cellules qui ont reçu seulement les changements de milieux de culture, mais qui restent non traitées autrement. 24 h après la transfection, les cellules ont été incubées dans un milieu sans sérum, avec ou sans 50 ng / ml de IL-10 pour plus de 24 heures. Expression IL10RB a été mesurée par RT-qPCR; diagrammes montrent la moyenne de trois expériences indépendantes, les barres d&#39;erreur représentent l&#39;erreur type de la moyenne; * P &lt;0,05; ** P &lt;0,01; *** P &lt;0,001 vs Ctrl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" width= &quot;500&quot; /&gt; Figure 4 de régulation de SOCS3 IL10-dépendante après inactivation de IL10RB dans THP-1 transfectées macrophages. Macrophages THP-1 ont été transfectées selon le protocole décrit. Après transfection, les cellules ont été cultivées dans quatre différents milieux de culture des cellules T de souris Nucleofector milieu (A), IMDM (B), LGM3 (C) et X-VIVO 20 (D) complété comme décrit dans la section de protocole. Les cellules ont été transfectées avec soit le contrôle non spécifique siRNA (Ctrl) ou IL10RB spécifique siRNA (IL10RB). Comme des contrôles supplémentaires des échantillons suivants ont été inclus: Commande d&#39;impulsion, c&#39;est à dire des cellules qui ont subi la transfection en l&#39;absence de ARNAS (Pulse), et un milieu de contrôle, c&#39;est à dire. cellules qui ont reçu seulement les changements de milieux de culture, mais qui restent non traitées autrement. 24 h après la transfection, les cellules ont été incubées dans un milieu sans sérum, avec ou sans 50 ng / ml de IL-10 pour plus de 24 heures. SOCS3 expression a été mesurée par RT-qPCR; diagrammes montrent la moyenne de trois expériences indépendantes, les barres d&#39;erreur représentent l&#39;erreur type de la moyenne; *, # P &lt;0,05; **, ## P &lt;0,01; ***, ### P &lt;0,001 vs Ctrl et contre Ctrl + IL-10, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Ce protocole présente une méthode efficace et fiable pour la transfection humains THP-1 macrophages avec siRNA ou de l&#39;ADN plasmidique par électroporation à haut rendement de transfection tout en maintenant la vitalité des cellules haute capacité et des macrophages plein de différenciation et polarisation.

La transfection très efficace des droits de THP-1 par les macrophages nucléofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

highly-efficient-transfection-human-thp-1-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

46.2K vues.  Friedrich Schiller University Jena.  Ce protocole présente une méthode efficace et fiable pour la transfection humains THP-1 macrophages avec siRNA ou de l'ADN plasmidique par électroporation à haut rendement de transfection tout en maintenant la vitalité des cellules haute capacité et des macrophages plein de différenciation et polarisation. 

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A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Une méthode simple et efficace pour isoler les macrophages de mixte cultures primaires de cellules hépatiques adultes

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Recherche

Immunologie et infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Protocole optimisé pour une transfection efficace des cellules dendritiques, sans maturation cellulaire

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

Une méthode simple et efficace pour détecter l&#39;activation du facteur nucléaire dans les neutrophiles humains par cytométrie en flux

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Mise en place d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Système d&#39;étudier le comportement intracellulaire de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En droits macrophages THP-1

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolement des monocytes humains par double centrifugation en gradient et leur différenciation en macrophages en téflon de culture cellulaire Sacs

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Protéomique profilage des macrophages par électrophorèse 2D

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

Caractérisation phénotypique des macrophages du Rat Kidney par cytométrie de flux

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Petit ARN primaire dans Transfection Th17 cellules humaines par électroporation Next Generation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-lapse imagerie 3D de phagocytose par les Macrophages de souris

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

Analyse expérimentale de l’Engloutement des thymocytes apoptotiques par les macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...