carillon électronique Parce que les macrophages se spécialisent dans la détection de molécules de non-auto-origine, ils sont particulièrement difficiles à transfecter. Nous décrivons un protocole qui permet une transfection très efficace des macrophages primaires avec l’ARNm généré à partir de modèles d’ADN tels que les plasmides. Le principal avantage de notre méthode est que des taux élevés de transfection sont atteints en l’absence de cytotoxicité ou d’immunogénicité détectable.
La démonstration de la procédure sera Marc Herb un postdoc de mon laboratoire. Commencez par décongeler tous les composants du kit de transcription arn. Vortex les reagents pendant cinq secondes et faites-les tourner vers le bas pendant deux secondes à 2000 fois g, puis gardez-les sur la glace jusqu’à utilisation.
Préparez la réaction in vitro de transcription d’ARN dans un tube de microcentrifugeuse de 0,5 microliter selon les directions manuscrites. Vortex le tube et tournez-le vers le bas. Puis l’incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes tout en mélangeant à 400 rpm sur un mélangeur thermique.
Après l’incubation, ajouter deux microlitres de DNase I directement dans le mélange de réaction. Vortex et faire tourner le tube vers le bas, et l’incuber dans le mélangeur thermique pendant encore 15 minutes. Réservez un aliquot à deux microlitres du produit traité à l’Adn pour le gel de contrôle et conservez-le à moins 80 degrés Celsius.
Pour le résidus de polyA, ajouter cinq microlitres de tampon de réaction de polymésase de 10X polyA et cinq microlitres de polymésexe polyA à la réaction traitée par dnase. Vortex et faire tourner le mélange. Puis l’incuber dans le mélangeur thermique pendant 30 minutes.
Lorsque la réaction est terminée, prendre un aliquot de deux microlitres pour le gel de contrôle et le stocker à moins 80 degrés Celsius. Ajouter des reagents de déphosphorylation à 5 premiers directement au produit à queue polyA selon les instructions manuscrites. Vortex et tourner le tube, et l’incuber dans le mélangeur thermique pendant encore 30 minutes.
Suivez la réaction de déphosphorylation avec une incubation de deux minutes à 80 degrés Celsius afin de chauffer l’inactivation de la phosphatase antarctique. Puis purifier l’ARNm transcrit in vitro à l’aide d’un kit de purification dédié à l’ARN. Mesurer la concentration et la pureté de l’ARNm éluqué à l’aide d’un spectrophotomètre microvolume.
Exécutez un gel d’agarose dénaturant avec les aliquots précédemment recueillis pour vérifier la présence d’un seul produit, la longueur correcte de transcription, et le suivi de polyA. Préparez-vous à la transfection en ajoutant le volume pré-calculé du tampon de transfection de l’ARNm moins les volumes de réaccfection de l’ARNm et de l’ARNm à un tube de réaction. Décongeler le bouillon d’ARNm et le mélanger délicatement en retournant le tube.
Ajoutez ensuite le volume pré-calculé de l’ARNm au tube de réaction. Vortex et faire tourner le mélange de réaction et le réaccfection de transfection de l’ARNm, puis ajouter le volume approprié du réaccfection de l’ARNm au tube de mélange de réaction. Vortex le tube et tournez-le vers le bas.
Puis l’incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Pendant ce temps, remplacer le milieu culturel des macrophages par un milieu de culture fraîche et chaude. Une fois l’incubation du mélange de transfection terminée, ajouter le mélange aux puits de plaque contenant les macrophages dans le sens de la goutte et en cercle de l’extérieur au milieu du puits.
Pour assurer une distribution uniforme du mélange de transfection, secouez doucement la plaque dans une direction verticale et horizontale. Puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant au moins six heures. Après l’incubation, analyser l’efficacité de la transfection par microscopie fluorescence, cytométrie d’écoulement ou immunoblot.
La partie la plus importante de cette procédure est d’assurer une distribution uniforme du mélange de transfection afin que tous les macrophages entrent en contact avec la même quantité d’ARNm. Ce protocole a été utilisé avec succès pour générer l’ARNm codant les variantes NEMO et IKK-bêta marquées flag pour la transfection des macrophages primaires. La taille correcte et le suivi de polyA de l’ARNm ont été vérifiés par électrophoresis de gel d’agarose.
L’efficacité de transfection a été confirmée en générant l’ARNm codant GFP et en effectuant l’analyse de cytométrie de flux. Le taux de transfection a augmenté avec la quantité d’ARNm transfecté, atteignant 50 à 65 % pour les PM et 80 à 85 % pour le BMDM. Dans pm et BMDM, le niveau d’expression d’EGFP dans les cellules transfected a augmenté d’une manière de temps et de dose-dépendante.
Fait important, l’analyse des macrophages propidium iodés positifs ou annexin V-positifs a confirmé que la procédure de transfection n’induise pas la mort cellulaire lytique ou apoptotique. L’efficacité de transfection des mRNAs codant des variantes flag-marquées Nemo ou IKK-bêta ont été analysées avec la microscopie d’immunofluorescence. Les taux étaient d’environ 60 % pour les ARNM de Nemo et de 55 % pour les ARNM IKK-bêta.
Ce protocole a également été utilisé pour générer l’ARNm codant Cre recombinase. La transfection de 400 000 BMDM avec 400 nanogrammes d’ARNm cre recombinase a entraîné un épuisement presque complet de la protéine Nemo après 48 heures, ce qui indique une transfection très efficace. L’absence de toutes les quantités détectables d’Interleukin 1 bêta, Interleukin-6 et facteur de nécrose tumorale indiquent que la procédure de transfection n’active pas la signalisation pro-inflammatoire.
Notre méthode relativement simple permet enfin d’exprimer efficacement les protéines mutées ou étiquetées dans les macrophages primaires. Cela permettrait de poursuivre considérablement l’analyse des fonctions macrophages au niveau moléculaire.
