O. Kurtulus et D. Dimlioglu sont pris en charge par un laboratoire Frais de recherche Award Program Université de Californie 12-LR-237197. P. Daggumati est soutenu par l&#39;Université de Californie à Davis investissements dans la recherche en sciences et ingénierie Award (RISE). CA Chapman est soutenu par un ministère de l&#39;Éducation zones d&#39;assistance supérieures de Besoin Bourse Nationale. Ce travail a été soutenu par UC Lab Honoraires Programme de recherche, UC Davis RISE et UC Davis College de fonds ingénierie start-up.

1. Nanoporeux Fabrication d&#39;or <ol><li> Substrats propres dans une solution Piranha <ol><li> Ajouter 25 ml de peroxyde d&#39;hydrogène (30%) à 100 ml d&#39;acide sulfurique (96%) dans une boite de Pétri et porter le mélange à 65 ° C sur une plaque chauffante. ATTENTION: Les liquides sont extrêmement corrosifs et doivent être manipulés avec soin. La solution passé ne devrait pas être conservé dans un récipient hermétique, elle pourrait exploser. </li><li> La place de 1 pouce par des lames de microscope de 3 pouces dans le mélange en utilisant une pince résistant à l&#39;acide et les nettoyer pendant 10 min. Utilisez un bateau de immunohistochimique de porcelaine pour le lot de nettoyage de petites lamelles. Traiter de petites lamelles avec plasma d&#39;air à 10 W pour 30 secondes avant l&#39;immersion dans la solution. </li><li> Rincer les échantillons nettoyés dans des boîtes de cristallisation sous l&#39;eau déminéralisée (DI) en cours d&#39;exécution pendant 3 min. Échantillons brushing avec un fusil d&#39;azote plus non pelucheux serviettes. </li></ol></li><li> Préparer pochoir (Méthode 1: Utilisez-le pour créer des motifs échelle millimétrique) <ol><li> Poinçon 250 feuilles d&#39;élastomère silicone um d&#39;épaisseur avec des pinces à biopsie et / ou inciser des régions avec un scalpel sur une surface de matière plastique semi-dur. Nettoyer les feuilles d&#39;élastomères transformés à 70% d&#39;isopropanol et sec avec un pistolet d&#39;azote. </li><li> Placez la feuille découpée sur un chiffon non pelucheux serviette de salle blanche et alignez les lamelles piranha nettoyés sur le pochoir avec la surface de l&#39;échantillon face au pochoir. </li></ol></li><li> Motif lift-off photosensible (Méthode 2: Utilisez-le pour créer des motifs sous-millimétrique) <ol><li> Placez un piranha nettoyé lame de microscope sur la filature mandrin et souffler les particules avec un pistolet à azote. Distribuer 1,5 ml de promoteur d&#39;adhérence (hexaméthyldisilazane) sur la lame de verre à l&#39;aide d&#39;une pipette en plastique. Passez le promoteur en faisant tourner le coulisseau successivement à 500 tpm pendant 5 s et 1 500 tours par minute pendant 30 secondes. Cuire la lame sur une plaque chauffante à 115 ° C pendant 7 min et laisser refroidir pendant 5 min. </li><li> Verser 4 ml de résine photosensible sur la lame de verre (3 pouces bY 1 pouce). Répandre la résine photosensible en faisant tourner la lame avec le même protocole que pour le promoteur d&#39;adhérence. Faire cuire la résine photosensible sur une plaque chauffante à 115 ° C pendant 1,5 min et laisser refroidir pendant 10 min. </li><li> Dégager la lame revêtue de résine photosensible avec une lumière UV (intensité: 22 mW / cm 2) à travers un masque de transparence pendant 15 s. Cuire la résine photosensible sur une plaque chauffante à 115 ° C pendant 1,5 min et attendre pendant 45 min. Dissoudre la résine photosensible exposée dans le révélateur pour au moins 3,5 min. Rincez abondamment avec de l&#39;eau DI. Inspectez les modèles développés dans le cadre d&#39;un microscope optique. </li></ol></li><li> métaux précurseurs de dépôt de produire du NP-Au couches minces <ol><li> Charger les échantillons dans une machine de pulvérisation cathodique pouvant indépendamment dépôt d&#39;or, d&#39;argent et de chrome. Pulvérisation nettoyer les échantillons pendant 90 secondes à 50 W de moins de 25 mTorr atmosphère d&#39;argon traitement avant de commencer le dépôt de métal. </li><li> Pulvérisation chrome pendant 10 min à 300 W de moins de 10 mTorr argon. Pulvérisation d&#39;or pendant 90 secondes à 400 W ONUder 10 mTorr argon. Co-pulvérisation d&#39;or et d&#39;argent pendant 10 min avec de l&#39;argent à 200 W et Au puissance à 100 W. Éteignez or source de pulvérisation environ 10 secondes avant d&#39;éteindre l&#39;argent source de pulvérisation. </li></ol></li><li> Obtenir micropatterns métalliques précurseurs <ol><li> Soniquer échantillons revêtus de photoresist en ~ 180 ml de décapant résine photosensible pour 10 cycles de 20 sec ultrasons et 2 min de pause entre les cycles. Rincer les échantillons avec de l&#39;eau DI et séchez avec un pistolet d&#39;azote. Inspectez les motifs métalliques sous un microscope. </li><li> Peler le pochoir en élastomère à partir d&#39;échantillons non revêtus résine photosensible à l&#39;aide de deux pinces pour révéler le métal déposé. </li></ol></li><li> Dealloy précurseur métallique et nanostructure de modification via un traitement thermique <ol><li> Remplir un bécher en verre de 200 à 170 ml d&#39;acide nitrique (70%) et de maintenir la température de la solution à 55 ° C sur une plaque chauffante. ATTENTION: L&#39;acide nitrique est extrêmement corrosif et doit être manipulé avec équipement de protection approprié. </li&gt; <li> Traiter de petites lamelles avec plasma d&#39;air à 10 W pour 30 secondes avant l&#39;immersion dans l&#39;acide nitrique. La place de 1 pouce par des lames de microscope de 3 pouces dans le bécher en utilisant une pince résistant à l&#39;acide et dealloy eux pendant 15 min. Utilisez un bateau de immunohistochimique de porcelaine pour le lot-dealloying petites lamelles. </li><li> Rincer les échantillons dealloyed en les plongeant successivement dans deux béchers remplis d&#39;eau DI frais trois fois. Conserver les échantillons dans de l&#39;eau DI et remplacer l&#39;eau avec de l&#39;eau DI frais tous les jours pendant au moins une semaine. Échantillons brushing avec un fusil d&#39;azote sur des serviettes non pelucheux avant l&#39;utilisation. </li><li> Charger des échantillons sur une plaquette de silicium pur dans un équipement de traitement thermique rapide. Amener la température à entre 200 ° C et 450 ° C et la vitesse de rampe à 10 ° C / s. Exposer les échantillons à la température prescrite pendant 10 min sous azote ambiant. Soit la chambre froide (&lt;100 ° C) et retirer les échantillons. Sinon, placez lentement les échantillons sur la plaque chauffante pour treatm thermiqueent. </li></ol></li></ol> 2. Culture cellulaire <ol><li> Préparer np-Au échantillons pour la culture cellulaire <ol><li> Lieu np-Au échantillons dans des boîtes de polystyrène et traiter avec plasma d&#39;air à 10 W pour 30 sec et transférer les échantillons de plaques de culture tissulaire à 24 puits. </li><li> Ajouter 500 ul de milieu de culture complet (milieu Eagle modifié par Dulbecco avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline / streptomycine) dans chaque puits. Magasin dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de CO2 jusqu&#39;à ce que l&#39;ensemencement des cellules (&lt;1 h). </li></ol></li><li> Maintenir, passage, et des semences cellules <ol><li> Maintenir les cellules d&#39;intérêt (dans ce cas fibroblastes NIH 3T3-ou les astrocytes murins) dans des flacons T75 avec les milieux de culture et de passage lorsque les cellules sont 70% de confluence. </li><li> Pour repiquage des cellules, retirez le support du flacon, laver deux fois avec 10 ml de tampon phosphate salin (PBS), ajouter 2 ml de 1x trypsine / EDTA et incuber jusqu&#39;à ce que le détachement des cellules (environ 5 min). Ajouter 3 ml de milieu frais etcentrifuger à 1200 rpm pendant 3 min. Aspirer le surnageant et suspendre le culot dans 2 ml de milieu. </li><li> Retirez les supports usés du puits et épépiner les cellules sur les lamelles de verre à une densité de 25.000 cellules / cm 2 avec un volume final de 1 ml. Agiter la plaque de culture de l&#39;avant-arrière et droite-gauche afin d&#39;assurer un revêtement uniforme des cellules sur les échantillons. Incuber les cellules jusqu&#39;à l&#39;analyse lors de l&#39;inspection quotidienne. </li></ol></li></ol> 3. Cellulaire et l&#39;analyse des matériaux <ol><li> Colorer les cellules de visualiser cytosquelette et les noyaux <ol><li> Retirez le support dépensé des puits et laver les cellules deux fois avec du PBS. Fixer les cellules dans du paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 15 min. </li><li> Préparer la solution de coloration de 300 nM Alexa Fluor 488 phalloïdine dans PBS avec 1% de sérum albumine bovine. </li><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS, et perméabiliser dans 500 ul de 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min. </li><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS et de les transférer à nettoyer les puits. Blot 50 - 200 solution de coloration ul sur les échantillons et les stocker dans l&#39;obscurité pendant 20 min. </li><li> Laver les cellules avec du PBS et contre-coloration avec 3 nM de DAPI dans PBS pendant 5 min. </li><li> Laver les cellules avec du PBS, et le tremper dans de l&#39;eau déminéralisée avant de monter sur des lames de couverture en verre avec les médias de fixation et joint avec du vernis à ongles transparent. </li></ol></li><li> Acquérir les images de NP-Au échantillons et des cultures cellulaires sur np-Au surfaces <ol><li> Image np-Au surfaces avec microscope électronique à balayage (MEB) avec 50.000 X grossissement à 10 kV énergie des électrons en utilisant un détecteur d&#39;électrons secondaires. </li><li> Capturez des images de cellules composites à différents endroits sur les échantillons à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé à fluorescence à un grossissement de 10X avec les blocs de filtres appropriés. </li></ol></li><li> images de processus pour déterminer la morphologie des pores et des cellules <ol><li> Ouverture d&#39;images dans ImageJ et divisée en canaux individuels le cas échéant. Convertir les images en 8 bits, il faut soustraire le fond, et les lisser par filteri médianeng. Régler seuil soit manuellement, soit par haut-seuillant algorithmes de mettre en évidence les pores (vides) et des organismes cellulaires / noyaux. </li><li> Utilisez la commande bassin versant de séparer pores ou des cellules fusionnées. Définissez les paramètres d&#39;analyse de particules et d&#39;exécuter la commande pour extraire le nombre de particules, superficie moyenne, et la couverture pour cent par des particules. Utiliser des images de cellules DAPI-souillé pour le comptage des cellules et des images de cellules phalloïdine tachés pour quantifier la couverture cellulaire pour cent. </li><li> Modifiez les fichiers de macro inclus, pour effectuer des analyses de lots de plusieurs images. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Biotechnol. 24, 1211-1218 (2006).</li><li>Weissm&#252;ller, J., Newman, R., Jin, H., Hodge, A., Kysar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theme+Article+-+Nanoporous+Metals+by+Alloy+Corrosion:+Formation+and+Mechanical+Properties.">Theme Article - Nanoporous Metals by Alloy Corrosion: Formation and Mechanical Properties.</a> Materials Research Society Bulletin. 34, 577-586 (2009).</li><li>Erlebacher, J., Aziz, M., Karma, A., Dimitrov, N., Sieradzki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+nanoporosity+in+dealloying.">Evolution of nanoporosity in dealloying.</a> Nature. 410, 450-453 (2001).</li><li>Okman, O., Lee, D., Kysar, J. 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Mater. 19, 3902 (2007).</li><li>Shulga, O., Zhou, D., Demchenko, A., Stine, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+free+prostate+specific+antigen+(fPSA)+on+a+nanoporous+gold+platform.">Detection of free prostate specific antigen (fPSA) on a nanoporous gold platform.</a> The Analyst. 133, 319-322 (2008).</li><li>Seker, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fabrication+of+low-impedance+nanoporous+gold+multiple-electrode+arrays+for+neural+electrophysiology+studies.">The fabrication of low-impedance nanoporous gold multiple-electrode arrays for neural electrophysiology studies.</a> Nanotechnology. 21, 125504 (2010).</li><li>Seker, E., Berdichevsky, Y., Staley, K. J., Yarmush, M. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+Nanoporous+Gold.">Microfabrication of Nanoporous Gold.</a> Nanoporous Gold: From an Ancient Technology to a High-Tech Material. 22, 69 (2012).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+and+mechanical+properties+of+nanoporous+gold+at+the+nanoscale.">Microfabrication and mechanical properties of nanoporous gold at the nanoscale.</a> Scripta Mater. 56, 437-440 (2007).</li><li>Seker, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+post-fabrication+annealing+on+the+mechanical+properties+of+freestanding+nanoporous+gold+structures.">The effects of post-fabrication annealing on the mechanical properties of freestanding nanoporous gold structures.</a> Acta Mater. 55, 4593-4602 (2007).</li><li>Parida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+change+during+the+formation+of+nanoporous+gold+by+dealloying.">Volume change during the formation of nanoporous gold by dealloying.</a> Phys. Rev. Lett. 97, 35504-35506 (2006).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun intérêt financier contradictoires.

Nous démontrons deux techniques différentes pour micromotif np-Au films pour étendre l&#39;utilisation de ces films dans des microsystèmes et des études biologiques. Or pulvérisation cathodique et de l&#39;argent est une méthode polyvalente pour créer np-Au modèles, comme la pulvérisation est compatible avec les procédés de microfabrication conventionnelles et la composition de l&#39;alliage et l&#39;épaisseur peut être facilement contrôlée en faisant varier les pouvoirs d&#39;armes à feu de pulvérisat...

<p class="jove_content"&gt; Matériaux avec des fonctionnalités nano-échelle ont montré des résultats prometteurs dans l&#39;amélioration de diverses applications, y compris les piles à combustible<sup&gt; 1</sup&gt; Capteurs,<sup&gt; 2,3</sup&gt; Et dispositifs biomédicaux<sup&gt; 4,5</sup&gt;. Un nouveau matériau est relativement or nanoporeux (np-Au), qui est produite par un procédé d&#39;auto-assemblage à l&#39;échelle nanométrique. Le précurseur de np-Au est un alliage d&#39;or qui se compose le plus souvent de l&#39;argent de 60% à 80% en pourcentage atomique. En bref, la nanostructure à pores ouverts caractéristique est le résultat d&#39;un réarrangement d&#39;atomes d&#39;or dans les amas comme l&#39;argent est dissous par un acide fort (<em&gt; Par exemple</em&gt; Acide nitrique à 70%) ou en vertu d&#39;un potentiel électrochimique<sup&gt; 6-8</sup&gt;. Np-Au bénéficie de plusieurs attributs souhaitables, y compris une grande surface efficace et de haute conductivité électrique, les techniques de fonctionnalisation surface bien établies, et la biocompatibilité<sup&gt; 9</sup&gt;. Même si il ya eu une expansion rapide des études sur np-Au, la plupart d&#39;entre eux se concentrer sur les propriétés mécaniques de np-Au<sup&gt; 10,11</sup&gt;, L&#39;activité catalytique<sup&gt; 12</sup&gt;, Et biomoléculaire performances de détection<sup&gt; 13-15</sup&gt;. Bien que les caractéristiques souhaitables sont très utiles pour plusieurs outils biomédicaux<sup&gt; 16,17</sup&gt; Les applications dans ce domaine ont été limitées. Une raison possible à cela est que la plupart des études ont principalement utilisé des spécimens macro-échelle (<em&gt; Par exemple</em&gt; Feuilles, feuilles, et lingots) et les techniques d&#39;incorporation np-Au dans les systèmes miniaturisés sont restés insuffisants. En fait, il ya seulement une poignée d&#39;exemples de l&#39;utilisation de techniques de microfabrication conventionnelles qui emploient np-Au cinéma<sup&gt; 16-20</sup&gt;. Avec l&#39;avènement de la technologie de la miniaturisation et le besoin de nouveaux outils biomédicaux, il est devenu essentiel d&#39;être en mesure d&#39;intégrer de nouveaux matériaux dans des dispositifs. Cela nécessite généralement que les matériaux peuvent être déposés et modelé avec des techniques de microfabrication conventionnelles. En outre, la quantification rapide des interactions cellule-matériau est généralement nécessaire d&#39;évaluer la biocompatibilité d&#39;un nouveau matériau. Le but de ce papier est de démontrer les techniques de base pour micromotif np-Au films et de quantifier à la fois nanostructure et les interactions cellule-matériau par traitement d&#39;image numérique.</p

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gold target</td>
 <td>Lesker</td>
 <td>EJTAUXX403A2</td>
 <td >Precursor to alloy for producing np-Au</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chrome target</td>
 <td>Lesker</td>
 <td>EJTCRXX353A2</td>
 <td >Adhesive layer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver target</td>
 <td>Lesker</td>
 <td>EJTAGXX403A2</td>
 <td >Precursor to alloy for producing np-Au</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Porcelain boat</td>
 <td>Thomas Scientific </td>
 <td>8542E40</td>
 <td >Used for processing small samples</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nitric acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>43873</td>
 <td >Used at 70% for dealloying</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sulfuric acid</td>
 <td>J.T Baker </td>
 <td>7664-93-9</td>
 <td >Used at 96% for piranha cleaning</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide</td>
 <td>J.T Baker </td>
 <td>7722-84-1</td>
 <td >Used at 30% for piranha cleaning</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biopsy punches</td>
 <td>Ted Pella</td>
 <td>150xx</td>
 <td >Available in several sizes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone elastomer sheets</td>
 <td>Rogers Corporation </td>
 <td>HT 6240</td>
 <td >Available in several thicknesses</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hexamethyldisilazane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>440191-100ML</td>
 <td >Used as adhesion promoter for positive resist</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microposit MF CD26</td>
 <td>Shipley</td>
 <td>38490</td>
 <td >Positive photoresist developer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PRS 3000</td>
 <td>J.T Baker</td>
 <td>JT6403-5</td>
 <td >Positive photoresist stripper</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Circular glass coverslips (12 mm)</td>
 <td>Ted Pella</td>
 <td>26023</td>
 <td >Used as substrate for metal patterns and cell culture</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass slides (1 x 3 inch)</td>
 <td>Ted Pella</td>
 <td>26007</td>
 <td >Used as substrate for metal patterns</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kapton polyimide tape</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82030-950</td>
 <td >Used for securing elastomer</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transparency masks</td>
 <td>Output City</td>
 <td></td>
 <td>Used in photolithography <a href="http://www.outputcity.com/" target="_blank">http://www.outputcity.com/</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plasma cleaner</td>
 <td>Harrick Plasma</td>
 <td>PDC-32G</td>
 <td >Used for activating glass surfaces</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sputtering machine</td>
 <td>Kurt J. Lesker</td>
 <td>LAB18</td>
 <td >Used for depositing metals</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

microfabrication of nanoporous gold patterns for cell-material interaction studies

Les matériaux nanostructurés avec des tailles de fond dans des dizaines de nanomètres ont amélioré la performance de plusieurs technologies, y compris les piles à combustible, les biocapteurs, les revêtements d&#39;appareils biomédicaux et les outils d&#39;administration de médicaments. Or nanoporeux (np-Au), produite par un processus d&#39;auto-assemblage de nano-échelle, est un matériau relativement nouveau qui présente une grande surface effective, une conductivité électrique élevée, et l&#39;activité catalytique. Ces propriétés ont fait np-Au un matériau intéressant pour la communauté scientifique. La plupart des études sur np-Au emploient spécimens macro-échelle et de se concentrer sur la science fondamentale de la matière et ses applications catalytiques et le capteur. Les spécimens macro-échelle limitent le potentiel de np-Au dans les systèmes miniaturisés, y compris les appareils biomédicaux. Afin de répondre à ces questions, nous décrivons d&#39;abord deux méthodes différentes pour micromotif np-Au couches minces sur des substrats rigides. La première méthode utilise des masques pochoir produits manuellement pour créer l&#39;échelle millimétrique np-Au modèles, tout en recueillante la seconde méthode utilise lift-off photolithographie pour motif motifs sub-millimétrique échelle. Comme les films minces np-Au sont obtenus par un procédé de pulvérisation-dépôt, ils sont compatibles avec les techniques de microfabrication conventionnelles, ce qui se prêtent à l&#39;intégration facile dans des microsystèmes. Ces systèmes comprennent électriquement adressables plateformes de biocapteurs qui bénéficient d&#39;une grande zone efficace de la surface, la conductivité électrique, et bioconjugaison de surface à base de thiol-or. Nous décrivons la culture cellulaire, immunologique, et des techniques de traitement d&#39;images pour quantifier l&#39;interaction np-Au avec des cellules de mammifères, ce qui est un paramètre important de la performance pour certains biocapteurs. Nous nous attendons à ce que les techniques illustrées ici vont faciliter l&#39;intégration des np-Au dans les plates-formes à différentes échelles de longueur et dans de nombreuses applications, y compris des biocapteurs, des systèmes de stockage d&#39;énergie, et des catalyseurs.

La figure 1 présente les principales étapes de la procédure, y compris la création des modèles np-Au, la culture de cellules, la quantification de la nanostructure, et la caractérisation des morphologies cellulaires. Le pochoir en élastomère montre la figure 2a (en haut) est utilisé pour créer les modèles np-Au représentés dans les images en dessous. Figure 2b est une photographie du bateau de la porcelaine pour les spécimens de traitement par lots. <stron...

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Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nous rapportons sur les techniques à micromotif nanoporeux films minces d&#39;or via l&#39;impression par stencil et la photolithographie, ainsi que des méthodes pour cultiver des cellules sur les modèles micro-usinés. En outre, nous décrivons des méthodes d&#39;analyse d&#39;images pour caractériser la morphologie du matériau et des cellules cultivées à l&#39;aide électronique à balayage et les techniques de microscopie à fluorescence.

Microfabrication de Patterns d&#39;or nanoporeux d&#39;études sur l&#39;interaction cellule-matériau

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K vues.  University of California, Davis. Nous rapportons sur les techniques à micromotif nanoporeux films minces d'or via l'impression par stencil et la photolithographie, ainsi que des méthodes pour cultiver des cellules sur les modèles micro-usinés. En outre, nous décrivons des méthodes d'analyse d'images pour caractériser la morphologie du matériau et des cellules cultivées à l'aide électronique à balayage et les techniques de microscopie à fluorescence.

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Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new devices for label-free separation and analysis of cells1. Such devices may use lateral displacement for continuous-flow separation, or receptor patterns that modulate adhesion to distinguish between different cell phenotypes or levels of receptor expression. Understanding the nature of cell rolling trajectories on receptor-patterned substrates is necessary for engineering of the substrates and design of such devices.
Here, we demonstrate a protocol for studying cell rolling trajectories on asymmetric receptor patterns that support cell rolling adhesion2. Well-defined, &mu;m-scale patterns of P-selectin receptors were fabricated using microcontact printing on gold-coated slides that were incorporated in a flow chamber. HL60 cells expressing the PSGL-1 ligand 3were flowed across a field of patterned lines and visualized on an inverted bright field microscope. The cells rolled and tracked along the inclined edges of the patterns, resulting in lateral deflection1. Each cell typically rolled for a certain distance along the pattern edges (defined as the edge tracking length), detached from the edge, and reattached to a downstream pattern. Although this detachment makes it difficult to track the entire trajectory of a cell from entrance to exit in the flow chamber, particle-tracking software was used to analyze and yield the rolling trajectories of the cells during the time when they were moving on a single receptor-patterned line. The trajectories were then examined to obtain distributions of cell rolling velocities and the edge tracking lengths for each cell for different patterns.
This protocol is useful for quantifying cell rolling trajectories on receptor patterns and relating these to engineering parameters such as pattern angle and shear stress. Such data will be useful for design of microfluidic devices for label-free cell separation and analysis.

We describe a protocol to observe and analyze cell rolling trajectories on asymmetric receptor-patterned substrates. The resulting data are useful for engineering of receptor-patterned substrates for label-free cell separation and analysis.

Etudier Trajectoires Cellule roulant sur les Patterns récepteur asymétrique

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Recherche

Bio-ingénierie

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Synthèse, l&#39;Assemblée, et caractérisation des nanoparticules Monocouche protégées Films d&#39;or pour Electrochimie monocouche de protéines

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

A Novel tridimensionnelle chambre d&#39;écoulement périphérique pour étudier chimiokine dirigée extravasation des cellules circulantes des conditions d&#39;écoulement physiologiques

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Electronic Tongue Generating Continuous Recognition Patterns for Protein Analysis

In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of electronic tongues (eT) for protein analysis. By mixing a small number of simple and easily accessible molecules with different physicochemical properties, used as building blocks (BBs), in varying and controlled proportions and allowing the mixtures to self-assemble on the gold surface of a prism, an array of combinatorial surfaces featuring appropriate properties for protein sensing was created. In this way, a great number of cross-reactive receptors can be rapidly and efficiently obtained. By combining such an array of combinatorial cross-reactive receptors (CoCRRs) with an optical detection system such as surface plasmon resonance imaging (SPRi), the obtained eT can monitor the binding events in real-time and generate continuous recognition patterns including 2D continuous evolution profile (CEP) and 3D continuous evolution landscape (CEL) for samples in liquid. Such an eT system is efficient for discrimination of common purified proteins.

A novel approach is described for construction of electronic tongue (eT), which greatly simplifies the design and production of sensing materials, and allows the eT to generate continuous evolution profiles and landscapes for samples in liquid. The obtained eT is efficient for common protein analysis such as discrimination.

Langue Electronique Génération Schémas de reconnaissance continue pour l&#39;analyse des protéines

In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of ...

Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. However in vivo, most of the cells are completely surrounded by the extracellular matrix (ECM), resulting in a three-dimensional (3D) distribution of receptors. This may trigger differences in the outside-in signaling pathways and thus in cell behavior.
This article shows that stimulating the dorsal receptors of cells already adhered to a 2D substrate by overlaying a film of a new material (a sandwich-like culture) triggers important changes with respect to standard 2D cultures. Furthermore, the simultaneous excitation of ventral and dorsal receptors shifts cell behavior closer to that found in 3D environments. Additionally, due to the nature of the system, a sandwich-like culture is a versatile tool that allows the study of different parameters in cell/material interactions, e.g., topography, stiffness and different protein coatings at both the ventral and dorsal sides. Finally, since sandwich-like cultures are based on 2D substrates, several analysis procedures already developed for standard 2D cultures can be used normally, overcoming more complex procedures needed for 3D systems.

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

Microenvironnements sandwich à exploiter cellulaires / Interactions matérielles

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to their intense optical absorbance in the near-infrared window, low cytotoxicity and potential to home into tumors. However, their delivery to tumors still remains an issue. An innovative approach consists of the exploitation of the tropism of tumor-associated macrophages that may be loaded with gold nanorods in vitro. Here, we describe the preparation and the photoacoustic inspection of cellular vehicles containing gold nanorods. PEGylated gold nanorods are modified with quaternary ammonium compounds, in order to achieve a cationic profile. On contact with murine macrophages in ordinary Petri dishes, these particles are found to undergo massive uptake into endocytic vesicles. Then these cells are embedded in biopolymeric hydrogels, which are used to verify that the stability of photoacoustic conversion of the particles is retained in their inclusion into cellular vehicles. We are confident that these results may provide new inspiration for the development of novel strategies to deliver plasmonic particles to tumors.

We show the preparation and address the feasibility of cellular vehicles containing gold nanorods for the photoacoustic imaging of cancer.

Préparation et Photoacoustique Analyse des véhicules cellulaires contenant de l&#39;or nanorods

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting and drug delivery are some of the applications of these AuNPs, but endothelial extracellular matrices&#39; defensive properties hamper particle uptake. To address this issue, we describe a synthesis method for ultrasmall gold nanoparticles to improve vascular delivery, with customizable functional groups and polymer lengths for further adjustments. The protocol yields 2.5 nm AuNPs that are capped with tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC). The replacement of THPC with hetero-functional polyethylene glycol (PEG) on the surface of the AuNP increases the hydrodynamic radius to 10.5 nm while providing various functional groups on the surface. The last part of the protocol includes an optional addition of a fluorophore to allow the AuNPs to be visualized under fluorescence to track nanoparticle uptake. Dialysis and lyophilization were used to purify and isolate the AuNPs. These fluorescent nanoparticles can be visualized in both in vitro and in vivo experiments due to the biocompatible PEG coating and fluorescent probes. Additionally, the size range of these nanoparticles render them an ideal candidate for probing the glycocalyx without disrupting normal vasculature function, which may lead to improved delivery and therapeutics.

We describe a method of synthesizing biocompatible 10-nm gold nanoparticles, functionalized by coating poly-ethylene glycol onto the surface. These particles can be used in vitro and in vivo for delivering therapeutics to nanoscale cellular and extracellular spaces that are difficult to access with conventional nanoparticle sizes.

Synthèse des fonctionnalisées 10 nm revêtement polymère des particules d’or pour le ciblage de l’endothélium et MEDICAMENTS

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabrication d’un réseau multiplexé microenvironnement cellulaire artificiel

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been devoted to their development. In this protocol, a recently developed, facile method for preparation of water soluble, biocompatible, and colloidally stable near-infrared emitting AuNCs have been described in detail. This room-temperature, bottom-up chemical synthesis provides easily functionalizable AuNCs capped with thioctic acid and thiol-modified polyethylene glycol in aqueous solution. The synthetic approach requires neither organic solvents or additional ligand exchange nor extensive knowledge of synthetic chemistry to reproduce. The resulting AuNCs offer free surface carboxylic acids, which can be functionalized with various biological molecules bearing a free amine group without adversely affecting the photoluminescent properties of the AuNCs. A quick, reliable procedure for flow cytometric quantification and confocal microscopic imaging of AuNC uptake by HeLa cells also been described. Due to the large Stokes shift, proper setting of filters in flow cytometry and confocal microscopy is necessary for efficient detection of near-infrared photoluminescence of AuNCs.

A reliable and easily reproducible method for preparation of functionalizable, near-infrared emitting photoluminescent gold nanoclusters and their direct detection inside HeLa cells by flow cytometry and confocal laser scanning microscopy is described.

Synthèse des nanoamas d’or électroluminescents électroluminescents pour les applications biologiques

Over the past decade, fluorescent gold nanoclusters (AuNCs) have witnessed growing popularity in biological applications and enormous efforts have been ...

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and size distribution of nanoparticles is of utmost importance for various applications. The size range is also important, as it defines the most &#8220;active&#8221; component of a nanoparticle dose.
Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AF4) is a powerful technique for sizing of particles in suspension in the size range of approximately 1&#8211;1000 nm. There are several ways to derive size information from an AF4 experiment. Besides coupling AF4 online with size-sensitive detectors based on the principles of Multi-Angle Light Scattering or Dynamic Light Scattering, there is also the possibility to correlate the size of a sample with its retention time using a well-established theoretical approach (FFF theory) or by comparing it with the retention times of well-defined particle size standards (external size calibration).
We here describe the development and in-house validation of a standard operating procedure (SOP) for sizing of an unknown gold nanoparticle sample by AF4 coupled with UV-vis detection using external size calibration with gold nanoparticle standards in the size range of 20&#8211;100 nm. This procedure provides a detailed description of the developed workflow including sample preparation, AF4 instrument setup and qualification, AF4 method development and fractionation of the unknown gold nanoparticle sample, as well as the correlation of the obtained results with the established external size calibration. The SOP described here was eventually successfully validated in the frame of an interlaboratory comparison study highlighting the excellent robustness and reliability of AF4 for sizing of nanoparticulate samples in suspension.

This protocol describes the use of Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation coupled with UV-vis detection for the determination of the size of an unknown gold nanoparticle sample.

Fractionnement asymétrique de flux de champ-flux pour le dimensionnement des nanoparticules d’or dans la suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...