Nous tenons à remercier l&#39;ensemble du groupe Maurer à l&#39;Université Washington, dont la connaissance collective a fait de ce protocole possible. Le financement de ce travail est fourni par le National Institute of Mental Health (1R01MH085495).

1. Préparation du Master motifs (figure 1) <ol><li> Centre de la plaquette de silicium sur le spin-coucheuse et rincer la plaquette avec de l&#39;acétone pendant l&#39;étape initiale du programme de rotation en deux cycles dans le tableau 1. L&#39;acétone va s&#39;évaporer durant la deuxième étape du programme de tour en laissant un endroit propre, galette sèche. </li><li> Appliquer environ 1 mL AZ9245 photorésine / en (de diamètre) à la plaquette et de spin-coat en utilisant les conditions décrites dans le Tableau 1. </li><li> Soft-cuire la galette résine photosensible enduit à 110 ° C pendant 2 m en utilisant une plaque chauffante de haute uniformité. </li><li> Photopattern le substrat en utilisant soit un système de photolithographie écriture directe ou d&#39;un système aligneur de masque et masque approprié. Les masques peuvent être achetés à partir d&#39;un certain nombre de sources commerciales. En outre, les transparents imprimés avec une encre UV absorbantes, scotchée à une plate optique, peut être utilisé pour produire des modèles avec des caractéristiques importantes. </li><li> Développer la plaquette à motifs 01:02 400K développeur: semi-conducteurs de l&#39;eau déminéralisée de qualité pour 1 m 45 s avec une agitation douce. Rincez abondamment à l&#39;eau de semi-conducteurs de qualité déminéralisée et sécher avec un flux d&#39;azote (N 2) de gaz. Motif de développement peut être vérifiée en utilisant un microscope avec un filtre UV. Si le motif n&#39;est pas complètement développée, la plaquette peut être retourné à la solution de développement pour le temps supplémentaire. </li></ol> Note: Pour de meilleurs résultats, photopatterning doit être effectuée dans un environnement de salle blanche. 2. Préparation de PDMS Stamp (figure 2) <ol><li> Préparer un 10:1 en poids de résine: mélange durcisseur de Sylgard 182 (PDMS) et couvrir complètement le maître (wafer photopatterned) avec le mélange dans un plat de Pétri jetables. </li><li> Dégazer le PDMS-couverte de maître dans un dessicateur sous vide jusqu&#39;à ce qu&#39;aucune bulle sont visibles et permettent le timbre de guérir dans un four à 65 ° C pendant 1,5 h. Avant de se guérir, il est important s&#39;assurer que le maître est au fond du plat car il peut remonter à la surface pendant l&#39;étape de dégazage. </li><li> Couper le PDMS éradiquer du maître et de garniture à la taille appropriée. Boutique du timbre dans un récipient couvert (côté caractéristique vers le haut) pour le protéger de la poussière et les débris. </li></ol> 3. Préparation du substrat d&#39;or à motifs (Figure 3) <ol><li> Préparer 25 mm non. Une des lamelles en verre rond pour le dépôt de métal en les traitant avec un plasma d&#39;oxygène pour 10 m. Rincer deux fois avec de l&#39;eau 18,2 MQ déminéralisée suivie par deux fois avec de l&#39;éthanol, le séchage avec un courant de gaz N 2 entre chaque étape. </li><li> En utilisant le système d&#39;une poche multi-dépôt par faisceau d&#39;électrons, dépôt de 50 Å de titane suivie par 150 pièces d&#39;or Å. Ne pas jeter de l&#39;évaporateur entre le dépôt de la couche de titane et la couche d&#39;or. Alternativement, recouvert d&#39;or lamelles peuvent être achetés auprès de divers fournisseurs, cependant, il est important que les couches métalliques sont préparés par évaporation par faisceau d&#39;électrons et l&#39;évaporation non thermique. Si acheté auprès d&#39;une source extérieure, des substrats d&#39;or peut être nettoyé par oxydation plasma ou &quot;piranha&quot; (07h03 Conc H 2 SO 4:. 30% de H 2 O 2) 11 avant de l&#39;utiliser. </li></ol> Note: &quot;Piranha&quot; solution est explosif en présence de composés organiques. <ol start="3"><li> Préparer la solution d&#39;emboutissage, 10 mM hexadecanethiol dans l&#39;éthanol absolu, et la solution de remblayage, de 1 mM de glycol résilié thiol dans l&#39;éthanol absolu. </li><li> Rincer le timbre à l&#39;éthanol et sécher soigneusement avec du gaz N 2. Appliquer emboutissage solution au goutte à goutte jusqu&#39;au timbre de PDMS entièrement enduit. Sécher le fond avec de timbre gaz N 2. Passez à 5a ou 5b, le cas échéant sur la base des caractéristiques du timbre de PDMS. </li><li><ol class="lalpha"><li> Appuyez doucement sur le timbre sur le substrat d&#39;or et de permettre la monocouche pour former pendant 15 s. </li><li> Placez le substrat d&#39;or dans une boîte de Pétri contenant de l&#39;eau 18,2 MQ déminéralisée, assurant le substrat est immergé. Appuyez doucement sur le timbre sur le substrat d&#39;or et de permettre la monocouche pour former pendant 15 s. </li></ol></li><li> Rincez le substrat estampillé fois avec de l&#39;éthanol, le séchage à gaz N 2 après chaque rinçage et placer le substrat dans une boîte de Pétri. </li><li> Couvrir le substrat avec le remblayage solution et sceller le plat avec du parafilm pour éviter l&#39;évaporation. </li><li> Autoriser la monocouche de fond à se former dans l&#39;obscurité pour 12-14 h. </li><li> Retirer la lamelle à motifs de la solution de remblayer et rincer deux fois avec de l&#39;éthanol, le séchage à gaz N 2, après chaque rinçage. </li></ol> 4. Application des protéines et des cellules au substrat Patterned <ol><li> Placer la lamelle à motifs dans une petite boîte de Petri ou de la chambre de culture cellulaire et couvrir avec 500 ul à 1 ml de phosphate de Dulbecco saline tamponnée (DPBS). Le DPBS doit couvrir complètement le substrat pendant l&#39;incubation des protéines pour assurer une couverture en protéines, même. </li><li> Ajouter une solution concentrée de protéines de la DPBS et mélanger la solution par le tuyauTing fois plusieurs années. Incuber le mélange de protéines avec le substrat à 37 ° C pendant 1 h. Les concentrations finales des laminine et la fibronectine sont typiquement 12 pg / ml et 20 pg / mL, respectivement. Les protéines peuvent être étiquetés avec un colorant fluorescent amines réactives pour permettre la visualisation modèle simple. Cependant, les protéines étiquetées doivent être mélangés avec des protéines non étiquetés 01h01 que l&#39;étiquetage de protéines peuvent interférer avec l&#39;activité biologique. </li><li> Après incubation, laver abondamment avec le substrat DPBS (4-5x) pour éliminer les protéines non liées, en prenant soin de ne pas sécher le substrat ou l&#39;apporter à travers l&#39;interface air-eau. Après les trois premiers rinçages, ajouter environ 500 pi de médias complet croissance cellulaire afin de maintenir un substrat humide. </li><li> Remplacez le support de croissance utilisé pour rincer le substrat avec des milieux frais. </li><li> Dissocier les cellules et compter pour le placage sur le substrat. Soit cellules dissociées primaires, comme les neurones hippocampiques, ou des lignées cellulaires immortalisées, telles que cellules CHO-K1, peuvent être utilisés. </li><li> Plate cellules dissociées sur le substrat. Typiquement de 30 à 200 cellules / mm 2 sont utilisés. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Schéma général pour la préparation de photolithographie d&#39;un maître à motifs. Dans ce processus, une plaquette de silicium est nettoyée avec de l&#39;acétone, enduits de résine photosensible, exposées à la structure d&#39;intérêt, et le motif est développé. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Schématique générale pour la préparation de timbre de PDMS. Dans ce processus, le maître est couverte de motifs Sylgard (10h01 résine: durcisseur), dégazée dans un dessiccateur à vide, traité dans une étuve à 60 ° C, et coupé à la taille. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Schéma général pour la modélisation du substrat. Dans ce processus, des substrats de verre sont recouvert de titane (50A) et or (150A) à l&#39;aide d&#39;un évaporateur par faisceau d&#39;électrons, modelé par hexadecanethiol impression par microcontact utilisant un timbre en PDMS, remblayé avec des thiols glycol alcane résilié, et revêtu de la protéine fluorescente-étiquetés. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Patterned maître (A) et de timbre en PDMS (B) préparés en utilisant les méthodes décrites. Barres d&#39;échelle sont 100 microns. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig5.jpg" alt="Figure 5"/> Figure 5. SAMs Patterned visualisées avec AlexaFluor 647-étiquetés fibronectine (A) et CHO-K1 isolement cellulaire (B). Barres d&#39;échelle sont à 100 um. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig6.jpg" alt="Figure 6"/> Figure 6. Patterned laminine ensemencé avec E18 neurones de souris hippocampe à 4 jours in vitro. AlexaFluor 350-anticorps anti-laminine anticorps est utilisé pour la visualisation motif (A) et les neurones de souris E18 hippocampe sont colorées avec Mitotracker Rouge 580 (B). Barres d&#39;échelle sont à 100 um. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig7.jpg" alt="Figure 7"/> Figure 7. Pièges potentiels dans la préparation du substrat motifs visualisés par AlexaFluor 647-conjugué fibronectine adsorption. (A) insuffisant entraîne le mélange à la protéine inégale d&#39;adsorption. (B) Une application inégale de la pression pendant estampage entraîne partielle Patten transfert. (C) Une pression excessive au cours d&#39;emboutissage peut conduire à l&#39;effondrement de timbre. (D) l&#39;exposition de la surface de motifs à l&#39;interface air-eau lors du rinçage peut entraîner des protéines de fond d&#39;adsorption. Barres d&#39;échelle sont à 100 um. <img src="/files/ftp_upload/3164/3164fig8.jpg" alt="Figure 8"/> Figure 8. Patterning submergées peuvent produire des modèles avec des caractéristiques petites qui sont difficiles à imprimer en impression par microcontact conventionnelles dans l&#39;air. Images (A) et (B) montrent les différentes régions du même modèle, imprimés avec le même timbre de PDMS dans l&#39;air (A) ou de l&#39;eau déminéralisée (B). Lignes de soutien à l&#39;échelle 10 microns qui entourent le motif (ajouté pour aider à prévenir l&#39;effondrement de timbre) sont considérés en (A), cependant, les caractéristiques points inférieur, comme indiqué en (B) ne sont pas vus. Cela démontre que l&#39;impression dans l&#39;air fonctionne bien pour les grandes fonctionnalités, mais l&#39;impression dans l&#39;eau peut être nécessaire pour les modèles avec de plus petites fonctionnalités. Barres d&#39;échelle sont de 20 um. <table border="1"><tbody><tr><td> Cycle </td><td> Taux d&#39;accélération (rpm / s) </td><td> Vitesse finale (rpm) </td><td> Temps (s) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 500 </td><td> 1000 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 3800 </td><td> 3800 </td><td> 30 </td></tr></tbody></table> Tableau 1.Programme de rotation de deux cycles utilisé pour créer un revêtement épais de 4,5 um AZ9245 sur un wafer de silicium. Pour préparer des timbres de PDMS pour la formation des motifs substrats, un master en résine photosensible est d&#39;abord fabriquée (figures 1 et 4A). Le maître est l&#39;inverse du cachet et est créé en utilisant soit un système de lithographie à écriture directe ou d&#39;un aligneur de masque. Quand une résine photosensible positive, comme le AZ9245, est utilisé pour la production de maître, la plaquette résistent-enduit est exposé à la lumière avec le même motif qui apparaîtra sur le substrat final. Alors qu&#39;il n&#39;est pas toujours possible, il a été rapporté que le ratio d&#39;aspect idéal (taille caractéristique de résister à l&#39;épaisseur) pour les maîtres de timbre en PDMS est de 1:2. 13 Nous avons constaté que les ratios aspect de 01h40 sont possibles, selon la nature du motif. AZ9245 wafers de silicium revêtue dans les conditions décrites ici donnent résine photosensible avec une épaisseur nominale de 4,5 um. Nous avons trouvé que cette épaisseur de AZ9245 peut être utilisé pour produire des maîtres PDMS avec des fonctionnalités allant de&gt; 100 um à 2 um. Timbres de PDMS sont moulés à partir Sylgard 182 (ou Sylgard 184) à l&#39;aide du maître fabriqués à partir de résine photosensible (figure 2). Maîtres Photoresist peut être utilisée plusieurs fois afin de créer de nombreuses copies du même timbre. Après le durcissement du PDMS, les timbres sont retirés de la maîtrise en utilisant une lame de rasoir et le cachet qui en résulte peut être visualisé sous un microscope en plaçant côté caractéristique de timbre sur une lamelle de verre (figure 4B) Une bonne résultats estampage dans un dièse, profil protéique claires qui peuvent être visualisés par l&#39;application de protéines marquées par fluorescence (Figures 3 et 5). Alternativement, l&#39;immunohistochimie peut être utilisé pour visualiser le modèle de protéine après fixation cellulaire (figure 6). La croissance cellulaire est bien limitée à la structure de protéines pour les deux lignées cellulaires immortalisées et les cellules primaires (figures 5 et 6). Bien que cette technique est facilement maîtrisé, plusieurs problèmes communs peuvent surgir. L&#39;application de protéines sans mélange suffisant de la solution de protéines concentrées dans le DPBS peut conduire à des motifs protéiques inégale (figure 7A). Estampage incorrecte peut conduire à transfert de motif partielle ou l&#39;effondrement de timbre (figure 7B-C). En outre, en exposant les motifs substrat contenant des protéines adsorbées à l&#39;air peut perturber la monocouche provoquant diminution de la résistance dans le fond (figure 7D). Patterns composé de fonctionnalités très faible (&lt;5 um) et des ratios d&#39;aspect élevé nécessitent souvent l&#39;utilisation de l&#39;impression par microcontact submergé. Dans cette procédure (3.5b) de l&#39;eau est utilisée comme une barrière pour empêcher hexadecanethiol de déposer sur le substrat en dehors du motif (figure 8). 14

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	<li>Wilbur, J., Kumar, A., Biebuyck, H., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+self-assembled+monolayers:+Applications+in+microfabrication.">Microcontact printing of self-assembled monolayers: Applications in microfabrication.</a> Nanotechnology. 7, 452-457 (1996).</li><li>Chang, J., Brewer, G., Wheeler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+microstamping+technique+enhances+polylysine+transfer+and+neuronal+cell+patterning.">A modified microstamping technique enhances polylysine transfer and neuronal cell patterning.</a> Biomaterials. 24, 2863-2870 (2003).</li><li>Lange, S., Benes, V., Kern, D., Horber, J., Bernard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+DNA+molecules.">Microcontact printing of DNA molecules.</a> Analytical Chemistry. , 1641-1647 (2004).</li><li>Xia, Y., Mrksich, M., Kim, E., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+octadecylsiloxane+on+the+surface+of+silicon+dioxide+and+its+application+in+microfabrication.">Microcontact printing of octadecylsiloxane on the surface of silicon dioxide and its application in microfabrication.</a> J. Am. Chem. Soc. , 9576-9577 (1995).</li><li>Mrksich, M., Dike, L., Tien, J., Ingber, D., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver.">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental Cell Research. , 305-313 (1997).</li><li>Prime, K. L., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+proteins+onto+surfaces+containing+end-attached+oligo(ethylene+oxide)+-+a+model+system+using+self-assembled+monolayers.">Adsorption of proteins onto surfaces containing end-attached oligo(ethylene oxide) - a model system using self-assembled monolayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 115, 10714-10721 (1993).</li><li>Raghavan, S., Desai, R., Kwon, Y., Mrksich, M., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+Dynamically+Adhesive+Substrates+for+Cell+Migration.">Micropatterned Dynamically Adhesive Substrates for Cell Migration.</a> Langmuir. , 17733-17738 (2010).</li><li>Rogers, J., Bao, Z., Baldwin, K., Dodabalapur, A., Crone, B., Raju, V. R., Kuck, V., Katz, H., Amundson, K., Ewing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-like+electronic+displays:+Large-area+rubber-stamped+plastic+sheets+of+electronics+and+microencapsulated+electrophoretic+inks.">Paper-like electronic displays: Large-area rubber-stamped plastic sheets of electronics and microencapsulated electrophoretic inks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4835-4840 (2001).</li><li>Yanker, D., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+printing+of+trichlorosilanes+on+glass+for+selective+protein+adsorption+and+cell+growth.">Direct printing of trichlorosilanes on glass for selective protein adsorption and cell growth.</a> Molecular Biosystems. 4, 502-504 (2008).</li><li>Johnson, D., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+and+reusing+patterned+self-assembled+monolayers+for+cell+culture.">Recycling and reusing patterned self-assembled monolayers for cell culture.</a> Chemical Communications. , 520-522 (2011).</li><li>Herne, T., Tarlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+DNA+probes+immobilized+on+gold+surfaces.">Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. , 8916-8920 (1997).</li><li>Hanson, E., Schwartz, J., Nickel, B., Koch, N., Danisman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bonding+self-assembled,+compact+organophosphonate+monolayers+to+the+native+oxide+surface+of+silicon.">Bonding self-assembled, compact organophosphonate monolayers to the native oxide surface of silicon.</a> J. Am. Chem. Soc. , 16074-16080 (2003).</li><li>Johannes, M., Cole, D., Clark, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscope+based+nanofabrication+of+master+pattern+molds+for+use+in+soft+lithography.">Atomic force microscope based nanofabrication of master pattern molds for use in soft lithography.</a> Applied Physics Letters. , (2007).</li><li>Bessueille, F., Pla-Roca, M., Mills, C. A., Martinez, E., Samitier, J., Errachid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submerged+microcontact+printing+(S&#x03BC;CP):+An+unconventional+printing+technique+of+thiols+using+high+aspect+ratio,+elastomeric+stamps.">Submerged microcontact printing (S&#x03BC;CP): An unconventional printing technique of thiols using high aspect ratio, elastomeric stamps.</a> Langmuir. , 12060-12063 (2005).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+microcontact+printing+as+a+microlithographic+technique.">Extending microcontact printing as a microlithographic technique.</a> Langmuir. , 2059-2067 (1997).</li><li>Biasco, A., Pisignano, D., Krebs, B., Pompa, P. P., Persano, L., Cingolani, R., Rinaldi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+of+microcontact-printed+proteins+by+atomic+force+miroscopy+molecular+sizing.">Conformation of microcontact-printed proteins by atomic force miroscopy molecular sizing.</a> Langmuir. , 5154-5158 (2005).</li><li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+of+proteins+for+cell+biology.">Microcontact printing of proteins for cell biology.</a> J Vis Exp. (22), e1065-e1065 (2008).</li><li>Piner, R., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Dip-pen"+nanolithography.">"Dip-pen" nanolithography.</a> Science. 283, 661-663 (1999).</li><li>Ryan, D., Parviz, B. A., Linder, V., Semetey, V., Sia, S. K., Su, J., Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+multiple+aligned+self-assembled+monolayers+using+light.">Patterning multiple aligned self-assembled monolayers using light.</a> Langmuir. , 9080-9088 (2004).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Un certain nombre de questions peuvent surgir dans la production lithographique de maître utilisé pour la création de timbre de PDMS. Sous-exposition des résultats plaquette résister à revêtement dans les modèles flous et indistincts et la surexposition des résultats plaquette résister à revêtement en fonctionnalités élargie ou manquant. En général, les maîtres avec des tailles disposent de grandes (&gt; 10 mm) sont relativement faciles à motif et se développer, alors que les maîtres avec de petites ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Plaquette de silicium </td><td> Wafer Reclaim services </td><td></td><td> 2 pouce </td></tr><tr><td> Spin coucheuse / plaque chauffante </td><td> Brewer Science </td><td> Cee 200CB Spin-Cuire système </td><td></td></tr><tr><td> AZ9245 Photoresist </td><td> Mays Chemical Company </td><td> 105880034-1160 </td><td></td></tr><tr><td> Système de photolithographie à écriture directe </td><td> Microtech srl </td><td> LW325 Système LaserWriter </td><td></td></tr><tr><td> Masque de géométrie </td><td> HTG </td><td> 3HR </td><td></td></tr><tr><td> Développeur 400K AZ </td><td> Mays Chemical Company </td><td> 105880018-1160 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 182 Kit élastomère de silicone </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25 mm non. Une des lamelles en verre ronds </td><td> VWR </td><td> 16004-310 </td><td></td></tr><tr><td> Oxydant Plasma </td><td> Diener </td><td> Femto </td><td></td></tr><tr><td> Titane pièces Kamis </td><td> Incorporated </td><td></td><td> 99,95% </td></tr><tr><td> Granules d&#39;or </td><td> Kamis Incorporated </td><td></td><td> Pur à 99,999% </td></tr><tr><td> Par faisceau d&#39;électrons d&#39;évaporateur </td><td> Kurt J. Lesker </td><td> PVD 75 Système de dépôt de couches minces </td><td> avec des faisceaux d&#39;électrons d&#39;accessoires </td></tr><tr><td> Hexadecanethiol </td><td> Alfa Aesar </td><td> A11362 </td><td></td></tr><tr><td> 1-mercaptoundec-11-yl) tétra (éthylène glycol) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 674508 </td><td></td></tr><tr><td> Éthanol </td><td> Pharmco-AAPER </td><td> 111000200 </td><td> 200 preuve, absolue </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> VWR </td><td> 52858-000 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> VWR </td><td> 4500-434 </td><td> Sans calcium et de magnésium </td></tr><tr><td> Souris Laminine I </td><td> VWR </td><td> 95036-762 </td><td></td></tr><tr><td> La fibronectine de plasma humain </td><td> Invitrogen </td><td> 33016-015 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 647 d&#39;acide carboxylique, ester succinimidyle </td><td> Invitrogen </td><td> A-20006 </td><td></td></tr><tr><td> Mitotracker Rouge 580 </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td><td></td></tr><tr><td> AlexaFluor ® 350 carboxylique succinimidyle </td><td> Invitrogen </td><td> A-10168 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-laminine d&#39;anticorps </td><td> Fisher Scientific </td><td> AB2034MI </td><td></td></tr></tbody></table>

creating two-dimensional patterned substrates for protein and cell confinement

Impression par microcontact fournit une méthode rapide, hautement reproductible pour la création de substrats motifs bien définis. 1 Pendant l&#39;impression par microcontact peut être employée pour imprimer directement un grand nombre de molécules, y compris les protéines, l&#39;ADN 2, 3 et silanes, 4 la formation de l&#39;auto -assemblés monocouches (SAM) de longues alcane thiols sur l&#39;or offre un moyen simple de limiter les protéines et les cellules pour des modèles spécifiques contenant des régions adhésif et résistant. Ce confinement peut être utilisé pour contrôler la morphologie cellulaire et est utile pour l&#39;examen d&#39;une variété de questions en protéines et en biologie cellulaire. Ici, nous décrivons une méthode générale pour la création de motifs protéiques bien définis pour les études cellulaires 5 Ce processus comprend trois étapes:. La production d&#39;un maître à motifs en utilisant la photolithographie, impression de la création d&#39;un timbre en PDMS, et microcontact d&#39;un or- substrat revêtu. Une fois modelée, ces substrats de culture de cellules sont capables de confiner les protéines et / ou de cellules (cellules primaires ou de lignées cellulaires) pour le motif. L&#39;utilisation de la chimie monocouche auto-assemblée permet un contrôle précis sur les régions à motifs adhésifs protéines / cellules et non-adhésive régions, ce qui ne peut être réalisée à l&#39;aide d&#39;emboutissage directe des protéines. Hexadecanethiol, la longue chaîne alcane thiols utilisés dans l&#39;étape d&#39;impression par microcontact, produit une surface hydrophobe qui adsorbe facilement protéines de la solution. Le glycol terminée par un thiol, utilisés pour le remblayage des régions non-imprimées du substrat, crée une monocouche qui est résistant à l&#39;adsorption des protéines et donc la croissance cellulaire. 6 Ces monomères thiol produisent des monocouches hautement structurés qui définissent précisément les régions du substrat qui peuvent soutenir l&#39;adsorption des protéines et la croissance cellulaire. En conséquence, ces substrats sont utiles pour une large variété d&#39;applications de l&#39;étude du comportement intercellulaire 7 à la création de la microélectronique. 8 Alors que d&#39;autres types de chimie monocouche ont été utilisés pour des études de culture de cellules, y compris les travaux de notre groupe en utilisant trichlorosilanes pour créer des motifs directement sur ​​des substrats en verre, 9 monocouches à motifs formés à partir de thiols alcane sur l&#39;or sont simples à préparer. Par ailleurs, les monomères utilisés pour la préparation monocouche sont disponibles dans le commerce, stable, et ne nécessitent pas de stockage ou la manipulation sous atmosphère inerte. Substrats préparés à partir de thiols Patterned alcane peuvent également être recyclés et réutilisés plusieurs fois, le maintien de l&#39;isolement cellulaire. 10

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Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Monocouches auto-assemblées (SAM) formé à partir de thiols à long alcane sur l&#39;or de fournir des substrats bien définis pour la formation de motifs protéiques et de l&#39;isolement cellulaire. D&#39;impression par microcontact hexadecanethiol l&#39;aide d&#39;un polydiméthylsiloxane (PDMS) de timbre suivie par remblayage avec un glycol terminée alcane thiols monomère produit un modèle où les protéines et les cellules s&#39;adsorbent seulement pour la région estampillé hexadecanethiol.

Créer deux dimensions Substrats motifs pour le confinement des protéines et de cellules

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K vues.  Washington University in St. Louis. Monocouches auto-assemblées (SAM) formé à partir de thiols à long alcane sur l'or de fournir des substrats bien définis pour la formation de motifs protéiques et de l'isolement cellulaire. D'impression par microcontact hexadecanethiol l'aide d'un polydiméthylsiloxane (PDMS) de timbre suivie par remblayage avec un glycol terminée alcane thiols monomère produit un modèle où les protéines et les cellules s'adsorbent seulement pour la régi...

Vidéo: Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

Création transitoires pores de la membrane cellulaire à l&#39;aide d&#39;une imprimante jet d&#39;encre standard

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

Recherche

Bio-ingénierie

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Création de dégradés et adhésifs solubles pour la migration des cellules d&#39;imagerie par microscopie à fluorescence

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Cellule structuration par photolithographie sur Défini Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrats

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Commande de cellules simples et simple Embryons en 3D Confinement: un nouveau dispositif de criblage à haut débit

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Récupération de fluorescence après Fusionner une Droplet mesurer la Diffusion bidimensionnelle d&#39;une monocouche de phospholipides

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Extension nanostructurées Substrats utilisant la technique de point pour Nanotopographical Modulation of Cell Comportement

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

Évaluation de la prolifération des kératinocytes sur deux et trois dimensions des substrats de collagène de Type I

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

Modelage de la géométrie des colonies de cellules souches embryonnaires humaines sur des substrats conformes pour contrôler la mécanique de niveau tissulaire

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Préparation des cellules synthétiques produisant des protéines à l’aide d’extraits bactériens exempts de cellules, de liposomes et de transfert d’émulsion

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

Analyse spatio-temporelle bidimensionnelle automatisée de sondes FRET mobiles à molécule unique

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...