Ce travail a été soutenu par un Wellcome Trust doctorat clinique bourse (ECAT).

Une. Fabrication de modèles Parylene sur SiO 2: Déroulement (voir la figure 1) <ol><li> Conception souhaite configuration parylène-C en utilisant un logiciel de l&#39;éditeur de mise en page, capable de lire / écrire CIF (Caltech forme intermédiaire) ou fichiers GDS-II (base de données système graphique II). CIF et GDS-II sont l&#39;industrie des formats de fichier standard pour la mise en page intégré circuit artistique. </li><li> Commission masque de photo la production à une installation de la microélectronique appropriées, ou de faire à l&#39;interne si les installations existent. </li><li> Oxyder une plaquette de silicium dans un four horizontal atmosphérique (H 2 1,88 SLM et O 2 1,25 SLM) à 950 ° C pendant 40 min pour produire une couche de SiO 2 de 200 nm (confirmer épaisseur avec une petite tache spectroscopique réflectomètre). </li><li> Premier la plaquette oxydée avec un promoteur d&#39;adhérence silane. Maintenant dépôt de parylène-C à 22 ° C à une vitesse de 1,298 nm / mg de dimère en utilisant un système de dépôt sous vide spécifiquement conçue pour déposer du parylène. A 100nm d&#39;épaisseur revêtement de parylène-C a été utilisé pour tous les exemples présentés ci-dessous. </li><li> Suivant dépôt hexaméthyldisilazane (HMDS), le promoteur d&#39;adhérence sur la plaquette revêtue de parylène en utilisant un système de revêtement de résine photosensible appropriée. </li><li> Maintenant tourner la tranche à 4000 tpm pendant 30 secondes tout en appliquant une laque photosensible positif (conduisant à une épaisseur théorique de 1 pm), en utilisant le même système de revêtement de résine photosensible comme ci-dessus. </li><li> Doux cuire la galette pendant 60 secondes à 90 ° C. </li><li> Insérez les deux la plaquette et préfabriqué masque de photo dans un alignement de masque. </li><li> Exposer la plaquette de résine photosensible revêtue d&#39;une représentation négative des UV la configuration souhaitée parylène-C. </li><li> Cuire tranche exposée pendant 60 secondes à 110 ° C. </li><li> Retirez tous les exposés de résine photosensible de la plaquette par le développement d&#39;une solution de développement approprié. </li><li> Graver au large de la parylène non protégés. Utilisation d&#39;un système de plasma d&#39;oxygène à la gravure (à une pression de chambre de 50 mTorr, 49 sccm d&#39;O 2, une puissance de 100 W RF à 13,56 MHz, etune vitesse de gravure de 100 nm / min) pour révéler le SiO 2 sous-jacente. </li><li> Couper la tranche en utilisant une scie de découpe approprié (vitesse de broche 30000 rpm, vitesse d&#39;avance de 7 mm / s). </li><li> Rincer puces en H 2 O déminéralisée et sécher avec de l&#39;azote. </li><li> puces de magasins (indéfiniment) dans des boîtes de poussière libre jusqu&#39;au moment. </li></ol> 2. Chip Nettoyage et activation: Protocole <ol><li> Retirer résine photosensible résiduelle à partir de copeaux par lavage dans de l&#39;acétone pendant 10 sec. </li><li> Rincer à l&#39;eau distillée déminéralisée 2 O 3x. </li><li> Maquillage acide piranha frais (un ratio 05:03 de 30% de peroxyde d&#39;hydrogène et d&#39;acide sulfurique à 98%). ATTENTION: Préparer acide piranha avec grand soin. Il est un oxydant très puissant, est fortement acide, et le mélange de peroxyde d&#39;hydrogène avec de l&#39;acide sulfurique est une réaction exothermique. Effectuez cette étape dans une hotte acide. Laisser 2 min de passer après le mélange de l&#39;acide piranha mais utilisent moins de 20 min. </li><li> Puces propres et gravure par immersion dans piacide Ranha pendant 10 min. </li><li> Rincer puces 3x en H 2 O déminéralisée et transférer dans un plat de culture stérile. </li><li> Maintenant activer puces pour un patron de cellules. Par exemple, ajouter deux puces par puits dans une plaque à 6 puits, puis ajouter 2 ml de sérum fœtal bovin de manière à immerger pleinement toutes les puces. Effectuer ceci, et toutes les étapes de culture de cellules suivantes, dans des conditions stériles dans une culture tissulaire hotte à flux laminaire. </li><li> Incuber les copeaux dans le sérum de 3-12 heures à 37 ° C. REMARQUE: Les étapes 02.04 à 02.07 doit être effectuée de manière séquentielle et sans délai entre les étapes. Si l&#39;activation de sérum est retardée par ≥ 24 heures après le traitement piranha, un patron de cellules est compromise en raison de la réduction de répulsion de la cellule de SiO 2 régions. Des solutions de remplacement d&#39;activation contenant des protéines spécifiques d&#39;adhésion cellulaire peuvent être utilisés à la place du sérum de veau fœtal. Ces solutions modifient les caractéristiques d&#39;adhérence cellulaire des deux substrats contrastées (voir résultats représentatifs pour un exemple). </li&gt; </ol> 3. Placage lignées cellulaires sur-puce: Protocole <ol><li> Enlevez les morceaux de leur solution d&#39;activation et laver une fois pendant 10 secondes dans une solution saline équilibrée de Hank. </li><li> Placer la puce dans un puits de culture et de la plaque type cellulaire choisi sous forme de suspension dans son milieu de culture habituel. Densité de placage de cellule optimale dépend à la fois du type de cellule et de motifs géométriques de parylène-C sur la puce. Une densité de 5 x 10 4 cellules / ml est un point de départ raisonnable. </li><li> L&#39;imagerie est adaptée à la motivation sous-jacente pour produire un patron de cellules, mais le comportement réel de la cellule peut facilement être évaluée à l&#39;aide d&#39;un microscope à dissection et un appareil photo numérique avec une lentille de relais approprié. </li></ol>

<ol>
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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+adhesion+and+growth+of+long+term+glial+and+neuronal+cultures+on+parylene-C.">Controlled adhesion and growth of long term glial and neuronal cultures on parylene-C.</a> PLoS One. 6 (9), (2011).</li><li>Hughes, M. A., Bunting, A., Cameron, K., Murray, A. F., Shipston, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+patterned+adhesion+and+repulsion+of+HEK+293+cells+on+micro-engineered+parylene-C/SiO2+substrates.">Modulating patterned adhesion and repulsion of HEK 293 cells on micro-engineered parylene-C/SiO2 substrates.</a> J. Biomed. Mat. Res. Mater. A. 101 (2), 349-357 (2013).</li><li>Unsworth, C. P., Graham, E. S., Delivopoulos, E., Dragunow, M., Murray, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+human+hNT+neurons+patterned+on+parylene-C/silicon+dioxide+substrates:+Combining+an+accessible+cell+line+and+robust+patterning+technology+for+the+study+of+the+pathological+adult+human+brain.">First human hNT neurons patterned on parylene-C/silicon dioxide substrates: Combining an accessible cell line and robust patterning technology for the study of the pathological adult human brain.</a> J. Neurosci. Methods. 194, 154-157 (2010).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Immersion dans de l&#39;acide de puces de piranha sert non seulement de supprimer toute matière organique résiduelle, mais aussi attaque chimiquement les surfaces du substrat. Cela est essentiel pour permettre l&#39;activation efficace avec du sérum de veau fœtal. Ne pas le faire empêche la cellule de motifs et modifie le comportement des cellules sur puce profondément. Il n&#39;est pas nécessaire de stériliser les puces après le nettoyage avec de l&#39;acide de piranha. En effet, la stérilisation par exposition aux UV a été montré pour miner un patron de cellules dans un mode dépendant de la dose 13. Il faut veiller à enlever toute résine photosensible résiduelle après le processus de photolithographie. Résine photosensible persistant peut agir comme une couche de cyto-adhésif indésirables qui remplace motifs dictés par parylene-C/SiO 2 géométrie. L&#39;acétone est efficace lors de l&#39;utilisation du procédé décrit ci-dessus de photolithographie et avec les réactifs spécifiques. Cependant, d&#39;autres types de résine photosensible peuvent nécessiter un solvant différent. Pour évaluer l&#39;impact et le succès de la différent étapes de fabrication, l&#39;angle des deux substrats contrastées de contact peuvent être mesurés. figure 2 illustre les modifications qui se produisent au cours du processus d&#39;activation de la puce. Il est probable, cependant, que l&#39;adhésif spécifique et les composants protéiques dans le sérum de répulsion permettent finalement la puce de parylène à motifs pour exercer ses caractéristiques cyto-adhésives ou cyto-répulsive respectifs. Tous les résultats représentatifs utilisés puces avec une épaisseur de parylène de 100 nm, que nous avons modelé avec succès en utilisant des couches à la fois plus épaisses et plus minces de parylène. Fait important, cette technique photolithogravure permet un plus grand contrôle tridimensionnel de configuration de parylène à celle illustrée ici. Par exemple, en utilisant une combinaison de masques photographiques, il est possible de créer des zones de parylène d&#39;épaisseur mixte. Cela ouvre la voie à la création de cultures cellulaires avec défini topographie tridimensionnelle, allant au-delà des régions tout simplement dicter de l&#39;adhésion cellulaire / répulsionsion, offrant potentiellement un moyen d&#39;intégrer les canaux microfluidiques dans la construction. Comme le montre, cependant, cette plate-forme de structuration n&#39;est pas universellement efficace dans tous les types cellulaires. Des lignées cellulaires différentes, avec leurs profils variés de molécules d&#39;adhésion cellulaire, se comportent différemment lorsqu&#39;ils sont cultivés sans surprise sur cette plate-forme. Nous n&#39;avons pas encore identifié les éléments clés dans le sérum, ni les récepteurs de la membrane cellulaire gratuits, qui sous-tendent cette plate-forme cellulaire de motifs. Faire à l&#39;avenir promet d&#39;élargir son utilité et spécificité. Par exemple, une lignée de cellules &quot;non-patterning&quot; pourrait être génétiquement modifié pour exprimer la molécule d&#39;adhésion requis et ainsi de promouvoir la structuration.

Mécanismes qui dictent l&#39;adhésion cellulaire et la structuration de matériaux synthétiques Comprendre est important pour des applications telles que l&#39;ingénierie tissulaire, la découverte de médicaments, et la fabrication de biocapteurs 1-3. De nombreuses techniques sont disponibles et en évolution, chaque profitant des facteurs biologiques, chimiques et physiques qui influent sur une myriade de l&#39;adhésion cellulaire. Ici, nous décrivons une technique de cellule de motif, qui utilise les procédés développés initialement à des fins de fabrication microélectroniques. En tant que tel, la plate-forme est bien placé pour permettre une intégration en aval de technologies microélectroniques, tels que les AEM, dans la plate-forme de structuration. L&#39;interface entre la membrane cellulaire et un matériau adjacent est bidirectionnel et complexe. In vivo, les protéines de la matrice extracellulaire fournissent la structure et la force et l&#39;impact sur ​​le comportement des cellules par l&#39;intermédiaire d&#39;interactions avec des récepteurs d&#39;adhésion cellulaire. De même, les cellules de vITRO interagir avec des substrats synthétiques par des couches de protéines absorbées 4 tandis que les influences physico-chimiques modulent également l&#39;adhérence. Par exemple, une surface de polymère peut être rendu plus &quot;mouillable&quot; (hydrophile) par irradiation par des ions ou des rayons ultraviolets, ou la gravure par traitement avec de l&#39;acide ou de l&#39;hydroxyde 5. Méthodes établies pour un patron de cellules de profiter de ces et d&#39;autres médiateurs d&#39;adhésion cellulaire. Les exemples incluent impression jet d&#39;encre 6, 7 microcontact estampage, l&#39;immobilisation physique 8, 9 microfluidique, la manipulation en temps réel de 10, et la structuration sélective moléculaire de montage (SMAP) 11. Chacun a des avantages et des limites spécifiques. Un facteur clé dans notre travail, cependant, est d&#39;intégrer un patron de cellules avec les systèmes micro-électromécaniques (MEMS). MEMS se réfèrent à très petits dispositifs mécaniques d&#39;entraînement par l&#39;électricité. Cette chevauche l&#39;échelle nanométrique équivalent, nanoelectromechsystèmes anical. Ce concept est devenu pratique uniquement lorsque les stratégies de semi-conducteurs ont permis la fabrication aura lieu à l&#39;échelle microscopique. techniques de microfabrication développées à l&#39;origine pour des produits électroniques de semi-conducteurs ont été trouvés par inadvertance utile pour d&#39;autres utilisations telles que l&#39;électrophysiologie cellulaire, par exemple. Un but en aval clé est de combiner ces technologies microélectroniques avec un processus de structuration de la cellule de haute fidélité (formation d&#39;un dispositif bioMEMS). Plusieurs techniques cellules structuration existantes et autrement fiables et pratiques sont incompatibles avec cette idée. Par exemple, un alignement précis des biocapteurs ou des micro-électronique embarqué est essentielle à leur efficacité, mais il est extrêmement difficile à réaliser en utilisant une technique telle que l&#39;estampage microcontact. Pour contourner ce problème, nous travaillons sur une plate-forme de motifs de base de SiO 2 qui utilise photolithographie imprimé parylène-C. Photolithographie implique le transfert de caractéristiques géométriques deun masque sur un substrat par l&#39;intermédiaire d&#39;une illumination UV. Un masque est conçu en utilisant un programme de conception assistée par ordinateur approprié. Sur une plaque de verre, une mince couche de chrome opaque représente la configuration géométrique souhaitée (une résolution de caractéristique de 1-2 mm est possible). Le substrat à motif est revêtue d&#39;une mince couche de résine photosensible (un polymère sensible à l&#39;UV). Le polymère est ensuite revêtu aligné et mis en contact étroit avec le masque. Une source de rayons UV est appliquée de telle sorte que les zones non protégées sont irradiés et donc devenir soluble et amovible dans l&#39;étape de développement suivante, en laissant une représentation du parylène-C de la configuration de masque derrière. Ce processus a commencé pendant le développement de dispositifs semi-conducteurs. En tant que tel, des tranches de silicium sont fréquemment utilisés en tant que substrat. Dépôt de photolithographie de parylène C sur SiO 2 est donc un processus simple et fiable qui a lieu régulièrement en salle blanche microélectronique. Alors que parylène aplusieurs caractéristiques souhaitables de bio-ingénierie (chimiquement inerte, non bio-dégradables), un facteur limitant son utilisation directe dans la structuration de la cellule est son adhérence cellulaire innée pauvres, attribué en partie à l&#39;extrême hydrophobie. Néanmoins, le parylène-C a déjà été utilisé indirectement pour produire un patron de cellules, par exemple en tant que matrice cellulaire pelable 12,13. Cette approche est limitée par la faible résolution et nécessite plusieurs étapes. Le procédé décrit ici utilise à la place d&#39;une étape d&#39;attaque acide, suivie d&#39;une incubation de sérum, de sorte que les régions du parylène-C deviennent cellule-adhésif, à travers une combinaison de la réduction du caractère hydrophobe et la protéine de liaison sérum. Le résultat final est une construction composée de deux substrats différents qui, après activation biologique, manifestent des caractéristiques cyto-adhésives ou cyto-répulsion respectifs et représente une plate-forme efficace de crépitement de cellule ainsi. Fait important, il n&#39;est pas nécessaire d&#39;introduire ag biologiqueents dans l&#39;installation de salle blanche selon les substrats à motifs peuvent être stockées indéfiniment avant utilisation (la suite de quoi ils sont activés à l&#39;aide de sérum bovin fœtal ou d&#39;une autre solution d&#39;activation). Cette parylene-C/SiO 2 plate-forme de structuration est donc un bon candidat pour une coalition avec des composants MEMS, comme les procédés de fabrication afin reflètent étroitement celles utilisées pour la fabrication microélectronique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Layout editor software package&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:615px;">Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Bespoke photo mask</td>
			<td colspan="2">e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com</td>
			<td>Either fabricate in-house of facilities exist or commision</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">3&#34; Silicon wafers</td>
			<td>e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Atmospheric horizontal furnace</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>For oxidising silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Small spot spectroscopic reflectometer</td>
			<td>e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>To measure depth of silicon dioxide layer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silane adhesion promoter</td>
			<td>e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/</td>
			<td style="width:215px;">1076730050</td>
			<td>Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parylene-C&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010</td>
			<td style="width:572px;">SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/</td>
			<td style="width:215px;">Model PDS2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter</td>
			<td style="width:572px;">e.g. SpiChem, www.2spi.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:383px;">Automated track system for dispensing photoresist on wafers.</td>
			<td>e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track,&#160;</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist.&#160; Pre-bake oven cures the resist.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Photo-resist: Rohm &#38; Haas</td>
			<td style="width:572px;">Rohm &#38; Haas, www.rohmhaas.com/</td>
			<td style="width:215px;">&#160;SPR350-1.2 positive photo-resist</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Phot-mask aligner</td>
			<td>e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microchem MF-26A developer</td>
			<td>Microchem MF-26A developer, www.microchem.com</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed reogions of photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Plasma etch system</td>
			<td>e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>Removes exposed regions of parylene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">Wafer dicing saw</td>
			<td>e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/</td>
			<td style="width:215px;">A929-4&#160;</td>
			<td>To wash off residual photoresist</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen Peroxide&#160;</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">H1009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">98% Sulphuric Acid</td>
			<td style="width:572px;">e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com</td>
			<td style="width:215px;">435589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">10437</td>
			<td>Standard chip activation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:572px;">Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com</td>
			<td style="width:215px;">14170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell patterning on photolithographically defined 
parylene-c: sio2 substrates

Plates-formes cellule de motifs d&#39;appuyer les objectifs de recherche généraux, tels que la construction de réseaux de neurones prédéfinis in vitro et l&#39;exploration de certains aspects centraux de la physiologie cellulaire. Pour combiner facilement un patron de cellules avec Multi-Electrode Arrays (AME) et à base de silicium «laboratoire sur puce» technologies, un protocole de microfabrication-compatible est nécessaire. Nous décrivons un procédé qui utilise le dépôt du polymère de parylène-C sur SiO 2 gaufrettes. Photolithographie permet de motifs précis et fiable de parylène-C à une résolution au niveau du micron. Après activation par immersion dans du sérum de veau fœtal (ou d&#39;une autre solution d&#39;activation spécifique) conduit à un substrat dans lequel les cellules cultivées adhèrent à, ou sont repoussés par, le parylène ou de SiO 2, respectivement les régions. Cette technique a permis la structuration d&#39;une large gamme de types de cellules (y compris les cellules murines hippocampiques primaires, des cellules HEK 293, une lignée cellulaire de tératocarcinome humain neurone-likelignée cellulaire, les cellules granulaires du cervelet primaires murins, et cellules humaines primaires en forme de tige gliome-dérivée). Il est intéressant, cependant, la plate-forme n&#39;est pas universel; reflétant l&#39;importance des molécules d&#39;adhésion cellulaires spécifiques. Ce processus de structuration de la cellule est rentable, fiable, et surtout peut être incorporé dans la microfabrication norme (fabrication de la puce) les protocoles, ouvrant la voie à l&#39;intégration de la technologie microélectronique.

Le procédé de photolithographie un motif de SiO 2 de parylène-C est illustrée sur la figure 1. Une fois préparé, l&#39;activation de puces dans du sérum bovin fœtal permet une large gamme de types de cellules à être modelées en culture. Notre groupe a modelé avec succès des cellules hippocampiques murines primaires 14-16, la ligne HEK 293 de la cellule 17, le tératocarcinome humain de neurone comme (hNT) lignée cellulaire 18, les cellules primaires granulaires du cervelet de souris et des cellules humaines primaires souches comme gliome dérivés. La figure 3 illustre un motif solide de cellules HEK 293 sur un modèle de parylène constitué de nœuds circulaires avec les extensions «réticule». l&#39;activation de la puce dans cet exemple est de sérum bovin fœtal. En revanche, la figure 4 illustre le potentiel pour augmenter la plate-forme de formation de motifs en utilisant des solutions d&#39;activation alternative. Utilisation d&#39;une solution de sérum-albumine bovine (3 mg / ml) et<html> la fibronectine (1 pg / ml) dans du HBSS, le motif précepte précédent a été inversé. La figure 5 illustre un autre type de cellule (une ligne primaire d&#39;origine humaine comme tige-cellule dérivée d&#39;un gliome de grade élevé). Ici, la géométrie du comportement cellulaire des impacts de motif sous-jacent, le motif représenté sur la figure 4A la promotion de la croissance de la cellule le long processus de parylène-C mince écoutes comme représenté sur les figures 4B et 4C. Certains types de cellules ne motif lors de l&#39;utilisation du protocole d&#39;activation de sérum bovin fœtal établi. Figure 6 illustre des cellules 3T3 L1 croissance jusqu&#39;à confluence avec aucune différence discernable cyto-répulsive ou cyto-adhésif entre les deux régions du parylène-C et SiO. pload/50929/50929fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Schéma illustrant le procédé de fabrication de motifs de parylène-C sur SiO 2. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig2.jpg" /> Figure 2. Diagramme de flux illustrant les variations de l&#39;angle de contact pour les motifs parylène-C et de SiO 2 domaines pendant les étapes d&#39;activation de puce. <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig3.jpg" /> Figure 3. Imagerie des cellules vivantes de HEK 293 cellules cultivées sur parylene-C/SiO 2 après trois jours in vitro. Chips incubé pendant 3 heures dans le sérum fœtal bovin, après quoi les cellules ont étéplaqué en suspension à une concentration de 5 x 10 4 cellules / ml. Parylène C favorise l&#39;adhérence cellulaire tout nu SiO 2 repousse les cellules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig3highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig4.jpg" /> Figure 4. Imagerie des cellules vivantes de HEK 293 cellules cultivées sur parylene-C/SiO 2 après trois jours in vitro Chips activées pendant 3 heures dans différentes solutions d&#39;activation rationalisé:. A: sérum de veau foetal, B: vitronectine (1 pg / ml) dans du HBSS, C: la sérum-albumine bovine (3 mg / ml) + vitronectine (1 pg / ml) dans du HBSS, D: albumine bovine de sérum (3 mg / ml) + fibronectine (156; g / ml) dans du HBSS. Les cellules ont été étalées en suspension à une densité de 5 x 10 4 cellules / ml. Notez comment un traitement différent de la puce a abouti à l&#39;inversion du dogme de structuration précédente, avec SiO 2 maintenant adhésif et parylène-C répulsive. Diamètre de noeud parylène-C 250 um, adapté de Hughes et al. 17 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig4highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig5.jpg" /> Figure 5. images d&#39;immunofluorescence de cellules humaines primaires souches comme gliome dérivés cultivées sur divers modèles de parylène C sur SiO 2 A:. schématique illustrant la conception réticulaire de parylène montré en B et C </strong&gt; B:.. Fluorescence au microscope de cellules fixes (après 4 jours in vitro) teinté de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) C:. Micrographie lumière de cellules vivantes sur une même puce D: l&#39;image de fluorescence illustrant cellules GFAP-colorées sur un parylène différente E conception:.. l&#39;image de réflectance du nœud et parlé conception de parylène imagé dans D <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig5highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50929/50929fig6.jpg" /> Figure 6. Imagerie des cellules vivantes de cellules 3T3 L1 cultivées sur parylene-C/SiO 2 après quatre jours in vitro. Chips activées pendant 3 heures dans le sérum fœtal bovin après which cellules ont été étalées en suspension (3 x 10 4 cellules / ml). Dans ce cas, la plate-forme ne permet pas de motifs, avec des cellules de devenir aussi confluentes sur parylène-C et SiO 2 régions. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50929/50929fig6highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Parylene-C: SiO2 Substrates at JoVE.com

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Ce protocole décrit un procédé de microfabrication compatible pour un patron de cellules de SiO 2. Une conception prédéfinie parylène-C par photolithographie est imprimé à la SiO 2 gaufrettes. Après incubation des cellules avec du sérum (ou une autre solution d&#39;activation) adhèrent spécifiquement (et se développent en fonction de la conformité des) sous-jacent parylène-C, tout en étant repoussé par SiO 2 régions.

Cellule structuration par photolithographie sur Défini Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrats

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

13.2K vues.  The University of Edinburgh.  Ce protocole décrit un procédé de microfabrication compatible pour un patron de cellules de SiO 2. Une conception prédéfinie parylène-C par photolithographie est imprimé à la SiO 2 gaufrettes. Après incubation des cellules avec du sérum (ou une autre solution d'activation) adhèrent spécifiquement (et se développent en fonction de la conformité des) sous-jacent parylène-C, tout en étant repoussé par SiO 2 régions. 

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Parylene-C: SiO2 Substrates

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

Modélisation Plasma surface de lithographie pour la création des réseaux cellulaires

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Recherche

Bio-ingénierie

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Créer deux dimensions Substrats motifs pour le confinement des protéines et de cellules

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

Visualisation de Cortex organisation et la dynamique de micro-organismes, l&#39;aide totale microscopie de fluorescence à réflexion

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

La co-culture de cellules utilisant une solution aqueuse Modélisation des systèmes biphasiques

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

Utilisation de l&#39;adhésif Patterning de construire papier dispositifs microfluidiques 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Modélisation soustractive rapide des couches de cellules vivantes avec une sonde microfluidique

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formation et Patterning Light-médiée hydrogels pour la culture cellulaire Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Une méthode polyvalente de patterning Les protéines et les cellules

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

Structuration des protéines bioactives ou Peptides sur Hydrogel utilisant photochimie pour Applications biologiques

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

Évaluation de la prolifération des kératinocytes sur deux et trois dimensions des substrats de collagène de Type I

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...