Les auteurs tiennent à remercier Michael Goldberg pour préparer la solution de siRNA stabilisé et Heather Tobin pour son aide avec les animaux. Cette étude a été financée par le DOD Innovator Award W81XWH-08-1-0659 de DEI. La formation postdoctorale de SK a été soutenu par la fondation Susan G Komen (KG101329). Les auteurs tiennent à remercier Kristin Johnson pour la préparation du schéma.

Une. Préparation de la solution d&#39;injection <ol><li> Préparer 0,2% colorant bleu Evans dans un tampon phosphate salin (PBS) ou une autre solution aqueuse d&#39;intérêt. Ce colorant vital est utile pour évaluer le succès des injections intra-canalaires et est recommandée comme une aide à la visualisation lors de l&#39;élaboration expertise dans la technique. </li></ol> Le volume requis dépendra du nombre et de l&#39;emplacement des glandes à injecter. Tous les 10 glandes mammaires de souris femelles peuvent être injectés mais en raison de la taille plus petite des glandes, des paires de glandes 1 et 5 sont typiquement injectés avec 10 ul de solution. Tous les autres paires mammaires sont injectés avec 20 pl. Ces volumes sont suffisants pour remplir la totalité de l&#39;arbre canalaire. 2. Préparation préopératoire <ol><li> Noter le poids corporel de chaque souris. Comme avec toutes les études précliniques, les poids des animaux doivent être surveillés régulièrement (deux fois par semaine ou plus) pour évaluer la toxicité potentielle. </li><li> Anesthésier la mouse utilisant une chambre isoflurane et appliquer du lubrifiant de l&#39;oeil. Au cours de la procédure de souris continuera d&#39;être anesthésiés par inhalation en utilisant la concentration d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène de 2 à 4% par l&#39;intermédiaire d&#39;un cône de nez. Surveiller attentivement la souris pour les modifications de la fréquence respiratoire, le réglage du niveau de l&#39;isoflurane en conséquence. </li><li> Injecter le méloxicam (5-10 mg / kg) par voie sous cutanée avant la procédure comme l&#39;analgésie. </li><li> Appliquer une crème dépilatoire sur-the-counter cheveux pour la région du mamelon. Attendez 5 min et retirez délicatement les cheveux en vrac avec un applicateur coton-tige en utilisant un mouvement circulaire. Retirer la crème à l&#39;aide de serviettes en papier humides en contact avec l&#39;eau tiède. Rasage n&#39;est pas recommandée en raison du risque d&#39;endommager les mamelons. </li><li> Fixez la souris sous le stéréoscope en collant doucement les extrémités. </li><li> Sites d&#39;injection propres avec des tampons d&#39;alcool. </li></ol> 3. Injection intra-canalaire <ol><li> Localiser mamelons appropriées pour être injecté sous le stéréoscope. Utilisez amende micro-dissection tweenisateurs pour éliminer les peaux mortes qui couvre l&#39;ouverture du mamelon. </li><li> Charge: 10 à 20 ul de solution d&#39;injection dans une seringue de 50 ul avec une aiguille 33 G de moyeu métallique apposée. Parfois, après l&#39;injection, de petites quantités (1 pi) ou moins peuvent s&#39;échapper de la tétine sur tirant l&#39;aiguille. Par conséquent, il est recommandé d&#39;injecter 11 ou 21 ul, respectivement, pour tenir compte de la perte potentielle. </li><li> Maintenez le mamelon doucement avec les fines pinces et soulever légèrement pour positionner pour injection. Il n&#39;est pas nécessaire de couper le mamelon. </li><li> Injecter lentement la solution pour minimiser les dommages potentiels causés par le déplacement rapide de fluide dans les lumières canalaires. Le débit d&#39;injection doit être maintenu à environ 40 pl / min. </li></ol> 4. Soins post-opératoires <ol><li> Observer le site d&#39;injection. Il devrait y avoir aucun signe de traumatisme à la région du mamelon ou du tissu environnant. Enflure dans la région qui entoure le mamelon indique probablement un coussinet adipeux mammaire rathe d&#39;injectionr d&#39;une injection intra-canalaire réussie. </li><li> Sortir l&#39;animal du cône de nez et se déplacer dans une cage séparée pour la récupération. Placez la cage sous une lampe chauffante pour éviter l&#39;hypothermie et d&#39;aider à la récupération. Les souris sont logés individuellement et seront étroitement surveillés jusqu&#39;à ce qu&#39;ils reprennent conscience et la mobilité. </li></ol> 5. Analyse de la glande mammaire tissus <ol><li> A la fin de l&#39;étude, les souris sont euthanasiées par dislocation cervicale suivant CO 2 du gaz comprimé dans une chambre d&#39;isolation. Les glandes mammaires sont excisés et peuvent être utilisés pour l&#39;ensemble de la préparation de montage 11, l&#39;histologie, ou de l&#39;ARN et l&#39;isolement de la protéine. </li></ol>

<ol>
	<li>Dooley, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+lavage+for+detection+of+cellular+atypia+in+women+at+high+risk+for+breast+cancer.">Ductal lavage for detection of cellular atypia in women at high risk for breast cancer.</a> J Natl Cancer Inst. 93, 1624-1632 (2001).</li><li>Jacobs, L., Sukumar, S., Stearns, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraductal+therapy+for+the+prevention+of+breast+cancer.">Intraductal therapy for the prevention of breast cancer.</a> Curr Opin Investig Drugs. 11, 646-652 (2011).</li><li>King, B. L., Love, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraductal+approach+to+the+breast:+raison+d'etre.">The intraductal approach to the breast: raison d'etre.</a> Breast Cancer Res. 8, 206 (2006).</li><li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+access+for+prevention+and+therapy+of+mammary+tumors.">Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors.</a> Cancer Res. 66, 638-645 (2006).</li><li>Stearns, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+and+clinical+evaluation+of+intraductally+administered+agents+in+early+breast+cancer.">Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer.</a> Sci Transl Med. 3, 106ra108 (2011).</li><li>Flanagan, M., Love, S., Hwang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+of+Intraductal+Therapy+for+Ductal+Carcinoma+in+Situ.">Status of Intraductal Therapy for Ductal Carcinoma in Situ.</a> Curr Breast Cancer Rep. 2, 75-82 (2010).</li><li>Nguyen, D. -. A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C., Ip, M. M., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in mammary gland biology and breast cancer research. , 259-270 (2000).</li><li>Behbod, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ.">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Res. 11, R66 (2009).</li><li>Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+mammary+epithelial+cells+in+vivo.">Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 401-404 (2009).</li><li>Reddy, J. P., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RCAS-TVA+system+for+introduction+of+oncogenes+into+selected+somatic+mammary+epithelial+cells+in+vivo.">The RCAS-TVA system for introduction of oncogenes into selected somatic mammary epithelial cells in vivo.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 405-409 (2009).</li><li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+mammary+gland+development+and+function+in+mouse+models.">Evaluation of mammary gland development and function in mouse models.</a> J. Vis. Exp. , e2828 (2011).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun lien financier.

souris transgéniques knockout et sont des outils précieux pour étudier le rôle in vivo de gènes individuels dans le cancer du sein. Cependant, il est coûteux et prend du temps pour créer ces animaux et l&#39;inactivation génique est généralement omniprésente qui nous empêche parfois de reconnaître les effets spécifiques de ce gène sur la glande mammaire. Par conséquent, un effet de choc ciblée permettrait d&#39;atténuer les problèmes d&#39;effets secondaires et la toxicité non spécifique dans d&#39;autres organes. L&#39;injection intra-canalaire de siRNA présenté ici permet à l&#39;inactivation génique localisée dans la glande mammaire de la souris. Il s&#39;agit d&#39;une méthode rapide pour une administration de médicament ciblée et localisée à la glande mammaire ne se limite pas à la délivrance d&#39;ARNi. Une telle délivrance de médicament spécifique à la glande mammaire d&#39;éviter les effets secondaires et la toxicité non spécifique à d&#39;autres organes, et permet l&#39;étude des altérations des gènes à des moments spécifiques au cours du développement de la glande mammaire et la formation de tumeurs du sein. Il n&#39;existe aucune preuve de siparticules d&#39;ARN dans les glandes non-injectés, le foie ou d&#39;autres organes qui fournissent des preuves supplémentaires que ce procédé présente un moyen pratique pour inactivation génique localisée dans la glande mammaire. En outre, les injections intra-canalaires peuvent être répétées toutes les semaines ou toutes les deux semaines pendant plusieurs mois pour permettre un suivi à long terme des agents thérapeutiques. Cette technique offre la possibilité de dosage de la livraison intracanalaire de divers réactifs aux conduits mammaires de souris. Les progrès de la délivrance localisée dans des modèles murins bien caractérisés doivent accélérer l&#39;application du non-invasive, ciblée stratégies thérapeutiques chez l&#39;homme.

La glande mammaire de la souris est composé d&#39;un arbre canalaire-alvéolaire complexe qui converge dans un canal central au niveau du mamelon. Chez la souris, ainsi que les humains, la majorité des tumeurs du sein sont créés dans les cellules epitheliales qui tapissent les conduits de lait. Traitements actuellement disponibles incluent la chimiothérapie par voie intraveineuse, la radiothérapie et la chirurgie. Traitements canalaires localisées ont été explorées 1-3 et offrir des avantages significatifs en termes de toxicité et des effets secondaires réduits. Toutefois, plusieurs défis restent à relever avant ceux-ci peuvent être appliqués plus largement. La possibilité d&#39;effectuer des procédures comparables dans la glande mammaire de la souris facilite la caractérisation des interventions intra-canalaires. Nous présentons ici une méthode non-invasive pour la fourniture de réactifs directement dans le conduit mammaire de la souris. Intracanalaire livraison d&#39;agents chimiothérapeutiques dans les deux patients atteints de cancer du sein et des modèles de souris a été démontré précédemment pour être très efficace sans aucun signe detoxicité systémique ou histopathologique changements à long terme de 3-6. En outre, l&#39;injection des cellules tumorales et la livraison de vecteur lentiviral d&#39;oncogènes ont été précédemment montré pour être réalisable par injection intracanalaire 7-10. En plus de l&#39;administration de médicaments, ce procédé est utile pour le silençage de gènes locale de la glande mammaire par injection de siRNA intracanalaire. Injection de petits volumes de solution siRNA est efficace sans modifier l&#39;anatomie et de la physiologie de la glande mammaire. Dans notre laboratoire, nous avons récemment montré inactivation réussie de gènes de médiateurs clés dans des souris transgéniques qui développent spontanément des tumeurs mammaires résultant dans la prévention de la progression de la tumeur (Brock et al., Non publié). Nous avons été en mesure de répéter les injections toutes les deux semaines dans les mêmes mamelons jusqu&#39;à 7 fois à intervalle de 2 semaines sans endommager les tissus visible ou toxicité. Injections intra-canalaires peuvent être synchronisées dans une souris adulte pour traiter développementévénements opmentally spécifiques relatives au développement de la glande mammaire pendant la grossesse, l&#39;allaitement, et de l&#39;involution ou de cibler les étapes ultérieures au cours du développement et la progression tumorale. Les femelles vierges aussi jeunes que 8 semaines d&#39;âge ont été injectés de façon non invasive dans notre laboratoire.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>2-4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meloxicam</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>5-10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>0.2% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hair removing cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Choose sensitive option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-dissecting tweezers</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>rs-4976</td>
			<td>With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>point style 4, 12 degree bevel (standard)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGLO cyclophilin B control siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001610-01-05</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland

Nous décrivons ici un protocole de livrer divers réactifs à la glande mammaire de souris par des injections intra-canalaires. Délivrance de médicament localisée et le knock-down de gènes au sein de l&#39;épithélium mammaire a été difficile à réaliser en raison de l&#39;absence de molécules de ciblage appropriés qui sont indépendantes des étapes de développement, tels que la grossesse et l&#39;allaitement. Nous décrivons ici une technique pour la délivrance localisée de réactifs de la glande mammaire à un stade quelconque à l&#39;âge adulte par injection intracanalaire dans les tétons de souris. Les injections peuvent être effectuées sur les souris vivantes, sous anesthésie, et de permettre une délivrance de médicament non-invasive et localisée à la glande mammaire. En outre, les injections peuvent être répétées sur plusieurs mois sans endommager le mamelon. Colorants vitaux tels que Bleu Evans sont très utiles pour apprendre la technique. Lors de l&#39;injection intra-canalaire du colorant bleu, l&#39;arbre canalaire entier devient visible à l&#39;œil. En outre, des réactifs marqués par fluorescence permettent égalementvisualisation et la distribution au sein de la glande mammaire. Cette technique est adaptable à une variété de composés comprenant siRNA, les agents chimiothérapeutiques, et des petites molécules.

Les tétons peuvent être facilement localisées à l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope, une fois les cheveux a été supprimée dans la zone qui l&#39;entoure (figure 1A). Pour maîtriser la technique d&#39;injection, il est recommandé d&#39;injecter colorant bleu Evans et surveiller l&#39;intégrité de la glande (figures 1B et C). Cette approche permet aussi la détermination des volumes appropriés pour être injecté dans chaque glande comme on peut visuellement déterminer si le colorant atteint le système canalaire entier (figures 1C et 2A). Une image de l&#39;image de bleu Evans injecté peut alors être comparé à l&#39;ensemble monté sur la glande mammaire, dans lequel l&#39;arbre canalaire entier est coloré avec du colorant carmin alun (Figure 2B). S&#39;il vous plaît noter que la robustesse de ce procédé d&#39;injection est très dépendante de l&#39;opérateur. Par exemple, la perforation de la gaine va se traduire par une injection de coussinet adipeux mammaire et en injectant la solution trop rapide peut endommager la cel épithéliale canalairels et provoquer une réaction inflammatoire. Injection intra-canalaire réussie permet la délivrance de médicament localisé à la glande mammaire et de réduire les effets secondaires non spécifiques, souvent observées autrement. Un exemple d&#39;image d&#39;une glande injecté avec étiqueté par fluorescence siRNA ciblant la cyclophiline (un gène non essentiel) est représenté sur la figure 3. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig1.jpg" /> Figure 1. Une glande mammaire inguinale injecté par le mamelon avec colorant bleu Evans. A) Apparence du mamelon avant l&#39;injection et B) après l&#39;injection de 20 ul colorant bleu Evans. Pas de gonflement ou des dommages aux tissus est observée. C) Lors de l&#39;ouverture de la peau, le colorant permet la visualisation de l&#39;ensemble de l&#39;arbre canalaire mammaire. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig2.jpg" /> Figure 2. Analyse de bleu Evans dans son ensemble-monterglande projetée. A) l&#39;image représentative d&#39;une glande disséqué excisé de l&#39;animal et l&#39;étaler sur une lame de verre immédiatement après l&#39;injection. B) Le total coloration montagne de la même glande avec carmin après graisse avait été autorisé. Comparaison avec A) confirme que la solution injectée remplit l&#39;arbre canalaire et la glande mammaire est anatomiquement intact. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig3.jpg" /> Figure 3. Livraison Intracanalaire de siRNA fluorescent. Représentant l&#39;image de l&#39;échantillon de tissu frais, 48 heures après l&#39;injection excisée.

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Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Un protocole pour la livraison intracanalaire non-invasive de réactifs aqueux de la glande mammaire de la souris est décrite. La méthode prend avantage de l&#39;injection localisée dans les mamelons des glandes mammaires ciblant spécifiquement conduits mammaires. Cette technique est adaptable à une variété de composés comprenant siRNA, les agents chimiothérapeutiques et les petites molécules.

Injection intra-canalaire pour localisée Drug Delivery de la glande mammaire de souris

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

34.6K vues.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School.  Un protocole pour la livraison intracanalaire non-invasive de réactifs aqueux de la glande mammaire de la souris est décrite. La méthode prend avantage de l'injection localisée dans les mamelons des glandes mammaires ciblant spécifiquement conduits mammaires. Cette technique est adaptable à une variété de composés comprenant siRNA, les agents chimiothérapeutiques et les petites molécules. 

Vidéo: Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Souris cellules épithéliales mammaires forme Mammospheres cours de la différenciation lactogène

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Recherche

Biologie

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Changements dans la morphologie glande mammaire et le risque de cancer du sein chez les rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluation de développement des glandes mammaires et fonction dans des modèles murins

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once the pre-cursor round cell begins to elongate and differentiate into what is morphologically recognized as a spermatozoon. However, the spermatozoon is very immature, having no ability for motility or egg recognition. Both of these events occur once the spermatozoa transit a secondary organ known as the epididymis. During the ~12 day passage that it takes for a sperm cell to pass through the epididymis, post-translational modifications of existing proteins play a pivotal role in the maturation of the cell. One major facet of such is protein phosphorylation. In order to characterize phosphorylation events taking place during sperm maturation, both pure sperm cell populations and pre-fractionation of phosphopeptides must be established. Using back flushing techniques, a method for the isolation of pure spermatozoa of high quality and yield from the distal or caudal epididymides is outlined. The steps for solubilization, digestion, and pre-fractionation of sperm phosphopeptides through TiO2 affinity chromatography are explained. Once isolated, phosphopeptides can be injected into MS to identify both protein phosphorylation events on specific amino acid residues and quantify the levels of phosphorylation taking place during the sperm maturation processes.

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Phosphopeptide Analyse des rongeurs spermatozoïdes épididymaires

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

Immunofluorescence indirecte sur des coupes congelées de glande mammaire de souris

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. The first procedure consists of perforation of the tympanic bulla, termed bullostomy; the second one is a transtympanic injection. Both emulate human clinical intratympanic procedures.
Chitosan-glycerophosphate (CGP) and Ringer&#180;s Lactate buffer (RL) were used as biocompatible vehicles for local drug delivery. CGP is a nontoxic biodegradable polymer widely used in pharmaceutical applications. It is a viscous liquid at RT&#160;but it congeals to a semi solid phase at body temperature. RL is an isotonic solution used for intravenous administrations in humans. A small volume of this vehicle is precisely placed on the Round Window (RW) niche by means of a bullostomy. A transtympanic injection fills the middle ear and allows less control but broader access to the inner ear.
The safety profiles of both techniques were studied and compared by using functional and morphological tests. Hearing was evaluated by registering the Auditory Brainstem Response (ABR) before and several times after microsurgery. The cytoarchitecture and preservation level of cochlear structures were studied by conventional histological techniques in paraformaldehyde-fixed and decalcified cochlear samples. In parallel, unfixed cochlear samples were taken and immediately frozen to analyze gene expression profiles of inflammatory markers by quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR).
Both procedures are suitable as drug delivery methods into the mouse middle ear, although transtympanic injection proved to be less invasive compared to bullostomy.

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.

Une étude comparative des médicaments Méthodes de livraison ciblés à l&#39;oreille de la souris intérieure: Bullostomy<em&gt; Versus</em&gt; Transtympaniques Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolement des glandes mammaires de souris intacte, toute analyse d’Expression de la matrice extracellulaire et la morphologie de la glande

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Partial Bile Duct Ligation in the Mouse: A Controlled Model of Localized Obstructive Cholestasis

In rodents, complete bile duct ligation (cBDL) of the common bile duct is an established surgical technique for studying obstructive cholestasis and bile duct proliferation. However, long-term experiments can lead to increased morbidity and mortality. In select mouse strains with underlying liver disease, meaningful comparisons can be made even with ligation of a single lobe of the liver, which can reduce animal losses and expenses. Here, we describe partial bile duct ligation (pBDL) in the mouse, in which only the left hepatic bile duct is ligated, causing biliary obstruction in the left lobe but not the remaining lobes. With careful microsurgical technique, pBDL experiments can be cost-effective, since the unligated lobe serves as an internal control to the ligated lobes, when subjected to the same conditions in the same animal. Unlike cBDL, a separate sham-operated control group is not necessary. pBDL is highly useful to directly compare localized versus systemic effects of cholestasis and other retained bile components. pBDL can also be repurposed as a novel method to investigate mechanisms related to medications and cell migration.

Here, we present partial bile duct ligation as a surgical model of liver injury and regeneration in rodents.

La ligature partielle biliaires chez la souris : un modèle contrôlé de la cholestase Obstructive localisée

In rodents, complete bile duct ligation (cBDL) of the common bile duct is an established surgical technique for studying obstructive cholestasis and bile ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

TRANS-intérieur cellulaire massive Injection de cellules souches embryonnaires conduit à des taux plus élevés de chimérisme

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.