Les auteurs sont reconnaissants à l&#39;installation de noyau d&#39;imagerie INRA MIMA2 (INRA, UMR1198, Jouy-en-Josas) et au personnel de l&#39;unité IERP (UE 0907, l&#39;INRA, Jouy-en-Josas) pour les soins et les installations animal. Nous tenons également à remercier IH Mather, MC Neville et S. Tooze de nous fournir antibodie très utile.

Souris CD1 ont été élevés à l&#39;INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, France). Tous les aspects éthiques du soin des animaux conformes aux lignes directrices et aux exigences d&#39;octroi de licences prévues par le ministère français de l&#39;Agriculture. Les procédures utilisées ont été approuvées par le comité d&#39;éthique local (accord 12/097 du Comethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech). 1. glande mammaire Préparation d&#39;échantillons <ol><li> Souris glande mammaire dissection <ol><li> Euthanasier les souris au jour 10 de la lactation par dislocation cervicale et épingler l&#39;animal vers le bas avec son abdomen vers le haut. </li><li> Mouiller la zone ventrale avec de l&#39;éthanol et le sécher avec une serviette en papier. </li><li> En utilisant des pinces, tirez la peau abdominale entre les deux pattes de derrière et faire une incision (à travers la peau seulement) d&#39;environ 1 cm avec des ciseaux pointus. A partir de cette première incision, puis utilisez des ciseaux pour couper la peau jusqu&#39;au cou sur la souris. Tirez la peau loin du péritoine et pin sur un côté de la peau à la fois, l&#39;étirant enseigné. </li><li> Recueillir les abdominaux et les glandes mammaires inguinales en les poussant loin de la peau avec un tampon et enfin en tirant ou en les coupant du péritoine. Remarque: À cette étape Carmine coloration peut être effectuée afin de visualiser l&#39;épithélium mammaire dans le totalité de la glande 43. Cette approche peut être utile d&#39;analyser la morphologie globale de la glande mammaire dans diverses conditions (traitements physiologiques stades de développement, les maladies, in vivo). </li><li> Retirer le ganglion situé à la jonction de l&#39;abdomen et les ganglions inguinaux 44. </li></ol></li><li> Fixation du tissu mammaire <ol><li> Coupez le tissu mammaire en 3 mm 3 fragments avec un scalpel et rincez immédiatement ces fragments dans un tampon phosphate salin (PBS), pH 7,4, afin d&#39;éliminer autant de lait que possible. </li><li> Sécher rapidement les fragments sur un papierserviette et mettez-les dans une solution froide PBS contenant 4% de paraformaldéhyde (PFA, HCHO, 32% de solution de formaldéhyde, ATTENTION) pour 10 à 15 min sur la glace. Note: Ceci est assez de temps pour permettre une analyse ultérieure sur des tranches de tissu mammaire par IIF36 et / ou hybridation in situ 45. Cependant, comme fixateurs aldéhyde pénètrent lentement dans les morceaux de tissus (~ 1-3 mm par heure), ce délai peut être prolongé pour assurer une fixation optimale de l&#39;échantillon de tissu. Alternativement, fixer des tissus in vivo par perfusion un animal anesthésié avec une solution de fixation (non détaillé dans la présente étude). </li></ol></li><li> Perfusion de saccharose <ol><li> Rincer rapidement les fragments mammaires dans du PBS froid et les plonger dans une solution PBS froid contenant 40% de saccharose (D-saccharose, C12H22O11, M. 342,3 g / mol) pendant 16 48 h à 4 ° C sous agitation douce. </li></ol></li><li> Intégration tissulaire Note: À cette étape, les fragments mammaires peut être re-découpée afin de faire fragments plus petits (2-3 mm 3) Ou pour régler leur forme. <ol><li> Étiqueter correctement les moules en plastique et de remplir un tiers du volume du moule avec du composé OCT, maintenu à la température ambiante. Placez un fragment (2-3 mm 3) du tissu mammaire par moule et couvrir avec le composé octobre </li><li> Placer les moules sur la surface de l&#39;azote liquide (sur une feuille d&#39;aluminium ou en utilisant un tamis métallique) et laisser le produit à congeler. Remarque: Il doit devenir solide et blanc avant d&#39;immerger le moule dans de l&#39;azote liquide. </li></ol></li><li> Stocker les échantillons congelés à -80 ° C jusqu&#39;à ce que les coupes de tissus sont exécutées. </li></ol> 2. sectionnement de tissu congelé Remarque: un cryostat, qui est essentiellement un microtome à l&#39;intérieur d&#39;un congélateur, qui est nécessaire pour faire des coupes de tissus congelés. Une température plus basse est souvent nécessaire pour les tissus adipeux ou riches en lipides tels que la glande mammaire vierge. <ol><li> Réglez la température du cryostat à -26 ° C et attendre jusqu&#39;à ce qu&#39;il ait Stabilisée. Maintenir le bloc de tissu congelé à -26 ° C pendant toute la procédure de découpe entière. Absolument éviter la décongélation du tissu à tout moment pendant la procédure. </li><li> On refroidit la lame de rasoir, le support de coupe, le dispositif anti-roulis et la brosse à -26 ° C en les plaçant dans le cryostat pendant au moins 10 min. Également placer une boîte de glissement à l&#39;intérieur du cryostat afin d&#39;être en mesure de stocker les lames, les sections sont faites. </li><li> Étiqueter correctement les lames de verre qui seront utilisés pour recueillir les coupes de tissus et de les maintenir à température ambiante; autrement coupes de tissus ne seront pas les respecter. Retirer l&#39;échantillon du moule à l&#39;intérieur du cryostat. Note: Utilisation des lames de verre chargées positivement vont grandement favoriser l&#39;adhérence des coupes de tissus congelés frais en raison de l&#39;attraction électrostatique élevé. </li><li> Couvrez la surface d&#39;un disque de tissu métallique avec le composé OCT (maintenu à RT) et pousser l&#39;échantillon congelé sur elle. Placer le montage humide à l&#39;intérieur du cryostat et laissez-cool pendant au moins 15 min. </li><li> Placez le montage humide dans le support de disque du cryostat. Réglez l&#39;épaisseur de coupe à 5-6 pm et, si possible, utiliser une nouvelle lame tranchante ou au moins modifier la zone sur la lame utilisée pour couper chaque échantillon, car il certains tissus suffit à émousser rapidement. </li><li> Ajustez la position du dispositif anti-roulis sur la lame de rasoir en faisant des coupures du milieu de montage jusqu&#39;à ce que les tranches sont formées uniformément et correctement. Idéalement, le dispositif anti-roulis va enjamber la lame de rasoir par environ 1 mm. </li><li> Une fois que les paramètres sont corrects, effectuer des coupes de tissus en tournant la roue dans un mouvement continu et uniforme. Sauf si la température est idéale, une coupe de tissu sera, par nature, essayer de se recroqueviller. <ol><li> Utilisez une brosse à saisir et manœuvrer la section sur la scène afin de le placer comme désiré sur la lame de verre. Utilisez la brosse pour nettoyer les restes éventuellement présents sur le bloc de tissu congelé et / ou la lame de rasoir. </li></ol></li><li> tirerla coupe de tissu vers l&#39;utilisateur et éviter appuyant sur la scène du cryostat. Evitez d&#39;appuyer sur la coupe de tissu sur la scène de cryostat elle peut conduire à l&#39;adhésion de la tranche de tissu sur la scène et donc l&#39;incapacité de le récupérer avec la lame de verre. </li><li> Récupérer des coupes de tissus, un par un en les ramassant à la surface d&#39;une lame de verre, en le tenant au-dessus de la section et l&#39;inclinant vers le bas pour toucher la coupe de tissu. Remarque: Les coupes de tissus adhèrent rapidement au verre chaud due à l&#39;attraction statique. Si plusieurs sections de tissus sont placés sur la même lame, veiller à ne pas se chevaucher et de les espacer suffisamment pour être en mesure de les joindre individuellement dans un cercle hydrophobe (voir section 3.1.1.). </li></ol> 3. immunofluorescence indirecte <ol><li> Localisation sections <ol><li> Utilisez un stylo de barrière hydrophobe pour dessiner un cercle autour du tissu hydrophobe coulissant monté. Supposons que le cercle à sec pendant environ 1 min à température ambiante. Tracez une ligne autour de la tsections d&#39;émission avec un marqueur permanent noir bien ainsi, mais sur le côté de la lame de verre opposée à celle où les coupes de tissus sont. Remarque: Ce cercle est hydrofuge et acétone et insoluble dans l&#39;alcool. Elle fournit donc un obstacle à des solutions aqueuses utilisées pendant la procédure IHC et réduit le volume des réactifs nécessaires. </li><li> Réhydrater les coupes de tissus en les recouvrant d&#39;une baisse de ~ 250 pl de PBS pendant quelques minutes à la température ambiante. Correction des coupes de tissus en les recouvrant d&#39;~ 250 ul d&#39;une solution à 3% de PFA fraîchement préparée dans du PBS pendant 10 à 15 min. Remarque: En option dans ce cas, utiliser une solution d&#39;aldéhyde de trempe (chlorure d&#39;ammonium 50 mM (NH 4 Cl, M. 53,5 g / mol) dans du PBS ou de glycine 0,1 M (C 2 H 5 NO 2, M. 75.07 g / mol) dans du PBS ) pour arrêter la réaction de fixation. Simple et abondante lavage PBS est généralement suffisante pour éliminer l&#39;aldéhyde qui n&#39;a pas réagi. </li></ol></li><li> La récupération de l&#39;antigène (facultatif) <br/&gt; Remarque: Bien que la plupart des antigènes peuvent être détectés sans récupération d&#39;antigène (AR), d&#39;autres seront observées que si cette étape est réalisée. Dans certains cas, AR permet également à l&#39;amélioration du signal observé. <ol><li> Placer la solution de AR (Tris 100 mM (C 4 H 11 NO 3, MM 121,14) 5% d&#39;urée (NH 2 CONH 2, M. 60,06) pH 9,6) dans un bêcher. Le volume de solution d&#39;AR doit être suffisante pour recouvrir complètement les lames de verre placées dans un support en verre. </li><li> Préchauffer la solution de AR à 95 ° C en contrôlant la température avec un thermomètre, puis placer les lames de verre sur un support approprié, immerger la crémaillère dans le tampon à chaud, couverture pour limiter l&#39;évaporation et incuber pendant 10 min à 95 ° C. </li><li> Retirer le bécher du bain d&#39;eau et de laisser les lames de verre pendant 10 minutes dans le tampon. </li></ol></li><li> Immunodétection <ol><li> Rincer les sections de tissus avec du PBS (~ 250 pi / section) et les saturer avec une solutionde 3% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA, ~ 250 ul / section) dans du PBS pendant au moins 30 min à température ambiante. </li><li> Mettre 30 à 50 pi de l&#39;anticorps primaire dilué dans du PBS contenant 2% de BSA dans chaque section de tissu. Remarque: Ce volume est suffisant pour former une goutte qui recouvre entièrement la section de tissu. </li><li> Placer le même volume de diluant (2% de BSA dans du PBS) seul sur une coupe de tissu pour effectuer un contrôle négatif sans anticorps primaire. <ol><li> Inclure systématiquement ce témoin négatif dans chaque expérience IHC et effectuer pour chaque anticorps secondaire utilisé pour estimer le fond de l&#39;expérience (marquage non spécifique due à l&#39;anticorps secondaire et / ou le tissu auto-fluorescence). D&#39;autres types de contrôles positifs ou négatifs peuvent également être effectuées pour garantir la spécificité de l&#39;étiquetage (voir la discussion). </li></ol></li><li> Placer les lames de verre dans une boîte humidifiée O / N à 4 ° C. Remarque: Les anticorps primaires utilisés étaient monoclonal de souris anti-cytokératine8 (CK8, dilution 1:50), anticorps monoclonal de souris anti-cytokératine 14 (CK14, dilution 1:50), la caséine polyclonaux de lapin anti-souris (# 7781, dilution 1:50, généreusement offert par MC Neville, Université du Colorado Health Sciences Center, CO, USA), polyclonal de lapin anti-BTN1 (dilution 1: 300, généreusement fournis par IH Mather, Département des animaux et aviaires Sciences, Université du Maryland, College Park, MD, USA), polyclonal de lapin anti-STX6 ( dilution 1:50, généreusement offert par S. Tooze, Cancer Research UK, London Research Institute, Londres, Royaume-Uni) et polyclonaux de lapin anti-VAMP4 (dilution 1:50). </li><li> Laver soigneusement les coupes de tissus avec du PBS au moins quatre fois pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Diluer l&#39;anticorps approprié secondaire (chèvre rhodamine conjugué anti-lapin IgG (H + L), dilution 1: 300) dans du PBS contenant 2% de BSA, placer 30 à 50 pl de cette solution sur toutes les sections de tissu, et incuber pendant 1,5 h à la température ambiante. <ol><li> Depuis fluorochromes sont des molécules sensibles à la lumière, ne pasexposer des coupes de tissus à la lumière jusqu&#39;à ce que leur analyse. Par IIF sur des coupes de tissus, favoriser des anticorps secondaires couplés à un fluorochrome rouge depuis les membranes cellulaires ont tendance à produire une auto-fluorescence verte qui peut interférer avec le bas étiquetage. En outre, le choix d&#39;un anticorps secondaire rouge fluorophore couplé permet l&#39;étiquetage concomitante de lipides neutres (voir ci-dessous). </li></ol></li><li> Laver soigneusement les coupes de tissus avec du PBS au moins quatre fois pendant 10 min à température ambiante. </li></ol></li><li> Post-fixation (en option) <ol><li> Pour certaines expériences, effectuer post-fixation en incubant les échantillons contenant 2% de PFA dilué dans du PBS pendant 10 min à température ambiante, afin de stabiliser les échafaudages antigène / anticorps. Cependant, cette étape peut être omise dans la plupart des cas. </li></ol></li><li> Les lipides neutres et de l&#39;ADN contre-coloration <ol><li> Pour visualiser CLD et MFG, la couleur des lipides neutres en incubant les coupes de tissus dans 30-50 pi d&#39;une solution de PBS contenant 3 ug / ml de BODIPY 493/ 503 pendant 10 min à température ambiante. Rincer rapidement des sections de tissu à deux reprises avec du PBS. </li><li> Contre-ADN nucléaire avec 30-50 ul d&#39;une solution de PBS contenant 3 M de DAPI (4-6 diamidino-2-phénylindole, 5 mg / ml solution mère) pendant 10 min à température ambiante. Laver les coupes de tissu avec du PBS avant de deux fois le montage des lames pour l&#39;observation. </li></ol></li><li> Section montage <ol><li> Retirer du PBS et placer une goutte de milieu de montage sur chaque section de tissu. </li><li> Placez un côté de la lamelle à un angle contre le tiroir, prendre contact avec le bord extérieur de la goutte de liquide, puis abaissez lentement le capot, éviter les bulles d&#39;air. Laisser le liquide de se répandre entre la lame de verre et la lamelle pendant quelques minutes, puis retirez l&#39;excès de milieu de montage avec une serviette en papier. </li><li> Sceller la lamelle à la lame de verre avec des sections vernis à ongles et de tissus de conserver à 4 ° C pour éviter leur exposition à la lumière jusqu&#39;à l&#39;observation. </li></ol></li></ol>4. Observation fluorescence et Image Acquisition Remarque: Un microscope à fluorescence équipé d&#39;une caméra contrôlée par le logiciel d&#39;acquisition d&#39;image est nécessaire pour observer les résultats IHC. <ol><li> Avant l&#39;acquisition d&#39;images, de vérifier l&#39;intensité de l&#39;étiquetage et d&#39;évaluer l&#39;arrière-plan de l&#39;expérience en regardant les contrôles négatifs. Acquérir des photos de chaque marqueur fluorescent (de canal de couleur) individuellement. </li><li> Acquérir toutes les images, y compris celles des contrôles correspondants, dans les mêmes conditions (exposition et les paramètres généraux) pour chaque canal de couleur. </li><li> Microscopie conventionnelle <ol><li> Effectuer microscopie à épifluorescence avec un microscope équipé de filtres standard pour l&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC, vert), la rhodamine (rouge) et DAPI (bleu) les émissions, × 20 à × 63 (immersion d&#39;huile, NA 1.3) objectifs et une caméra d&#39;imagerie DP50. </li></ol></li><li> La microscopie confocale </li><li> Effectuer la microscopie confocale avec microsadaptation se trouve équipé du logiciel ZEN, en utilisant × 20 × 63 à (immersion d&#39;huile, NA 1.4) et les objectifs 488- et 568-nm excitation longueurs d&#39;onde du laser. </li></ol> 5. Traitement de l&#39;image Remarque: Toutes les images post-traitements sont effectués en utilisant le logiciel gratuit ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). <ol><li> Superposer l&#39;image (fusion) <ol><li> Ouvrez les images acquises dans chaque canal qui sera combinée (Fichier / Ouvrir). Si vous travaillez avec 8 bits images en niveaux de gris, couleur artificielle attribuer à chaque canal en utilisant la table de consultation (tableaux image / Lookup). </li><li> Générer l&#39;image composite à partir d&#39;images en niveaux de gris ou de couleur en utilisant la commande «Fusionner les canaux&quot; (Image / Couleur / fusionner des couches), puis attribuer une couleur à chaque canal. </li><li> Effectuer l&#39;image empile superposition de la même manière par des empilements acquises dans chaque canal qui sera combinée (Fichier / Ouvrir) ouvrant et en utilisant la commande «Fusionner canaux &amp;# 8221; (Image / Couleur / fusionner des couches) d&#39;attribuer une couleur à chaque canal. Enregistrer la pile composite comme une séquence d&#39;images ou un film (voir section 5.4). </li></ol></li><li> Image pile Z projection <ol><li> Utilisez la fonction Z de projection (Image / Stack / Zproject, Intensité Max) pour fournir une vue en deux dimensions de toutes les images d&#39;une pile d&#39;images en les projetant sur l&#39;axe perpendiculaire au plan de l&#39;image (axe z). L&#39;option &quot;Maximum Intensity&quot; crée une image dans laquelle chaque pixel contient la valeur maximale sur toutes les images de la pile. Cela génère une seule image permettant la visualisation de tous les coloration observée à travers l&#39;ensemble de la pile d&#39;image pour un canal particulier ou après la superposition de plusieurs canaux. </li></ol></li><li> Projection d&#39;images 3D de pile <ol><li> Utilisez la commande de projection 3D (image projet / Stack / 3D, Brightest Point, l&#39;axe Y) pour générer une séquence de projections d&#39;un volume de rotation sur un plan. Le rendu visuel de surfaces et les structures internes dépend à la fois la méthode de projection (le plus proche point, point le plus lumineux (utilisé ici), ou valeur moyenne) et les paramètres de visualisation sélectionnés. Chaque trame de la séquence d&#39;animation est le résultat de la projection à partir d&#39;un angle de vue différent. </li><li> Faire pivoter l&#39;image 3D créée autour de chacun des trois axes orthogonaux (l&#39;axe des y a été choisi ici). Enregistrer la séquence produite comme une seule image ou un film. </li></ol></li><li> Pile de l&#39;image à la conversion de film <ol><li> Ouvrez une pile d&#39;images (Fichier / Ouvrir) et l&#39;enregistrer comme un film au format AVI en utilisant la commande &quot;AVI&quot; (Fichier / Enregistrer sous / AVI). </li></ol></li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

IHC est une méthode expérimentale relativement simple et directe pour localiser l&#39;antigène dans des sections de tissus, qui dépend principalement sur les interactions épitope-anticorps spécifiques. Bien qu&#39;un grand nombre de protocoles sont utilisés pour localiser une protéine par IIF, l&#39;âme de ces procédures est presque toujours le même. Cependant, il ya certains aspects critiques qui peuvent fortement influencer le résultat et doivent donc être optimisés pour chaque étude IHC individu. L&#39...

La glande mammaire est un organe exocrine mammifère atypique dont la fonction principale est de produire du lait pour nourrir les nouveau-nés. Le développement du tissu mammaire survient principalement après la naissance et se caractérise par un processus unique dans lequel l&#39;épithélium envahit le stroma environnant. Ce tissu subit de nombreux changements (croissance, la différenciation et de régression), en particulier au cours de la vie adulte, de manière concomitante avec des variations dans l&#39;état reproducteur (Figure 1). En plus de la morphologie globale du tissu, les proportions des différents types de cellules, ainsi que leur disposition à l&#39;intérieur de la glande mammaire changer de façon spectaculaire au cours du développement 5.1. Au cours de la vie embryonnaire, l&#39;épithélium mammaire dérive de lignes de lait mammaires, qui est défini par un léger épaississement et la stratification de l&#39;ectoderme, entre les parties avant et arrière des membres de chaque côté de la ligne médiane autour jour embryonnaire 10,5 (de E10.5) (Figure 1A ).Sur E11.5, la ligne de lait se décompose en placodes individuels, qui sont positionnés de manière symétrique le long de la ligne de lait mammaire en des emplacements reproductibles, et le mésenchyme environnant commence à se condenser. Les placodes commencent à sombrer plus profondément dans le derme et le mésenchyme mammaire organise en couches concentriques autour du bourgeon mammaire (E12.5-E14.5). Comme de E15.5, l&#39;épithélium mammaire, commence à proliférer et allongé pour former le germe primaire qui pousse à travers le mésenchyme mammaire vers le coussinet adipeux. Le germe primaire développe un lumen creux avec une ouverture sur la peau, caractérisée par la formation de la gaine du mamelon. Sur a 18,5, le conduit allongeant a grandi dans le coussinet de graisse et a ramifié dans un petit système canalaire arborisée englobé dans le coussinet adipeux. Développement est essentiellement arrêté et la glande mammaire reste rudimentaire morphogenetically repos jusqu&#39;à la puberté. Dans l&#39;embryon mâle, l&#39;activation des récepteurs androgènes conduit à la dégénérescence des bourgeons, qui disparaissentpar E15.5. Comme de E18, le développement mammaire cesse jusqu&#39;à la puberté 6-9. À la naissance, la glande mammaire abrite un système canalaire rudimentaire qui allonge et les branches lentement (croissance isométrique). Au début de la puberté, les structures sphériques situés aux extrémités des conduits appelés les bourgeons terminaux (TEBS), sont formées d&#39;une couche externe de cellules de la coiffe et une âme interne multicouche de cellules (cellules de l&#39;organisme). Ces structures sont très proliférative et infiltrent le tissu stromal environnante en réponse aux signaux hormonaux. Prolifération dans les résultats TEBS d&#39;allongement canalaire, couplé avec la morphogenèse de ramification. Ce processus conduit à la mise en place d&#39;un réseau arborisée épithéliale de base émanant de la tétine (figure 1B, la puberté). A ~ 10-12 semaines après la naissance, lorsque l&#39;épithélium envahi tout le a coussinet adipeux, son expansion et arrête le TEB disparaître. Le développement de Ductal subit alors des modifications dynamiques, à savoir, successive la prolifération et la régression des cellules épithéliales selon des cycles oestraux 10 (figure 1B, adultes). Dès le début de la gestation, le tissu mammaire subit une croissance importante et des changements morphologiques pour se préparer à l&#39;allaitement. L&#39;épithélium mammaire largement proliférer et se différencier, ce qui conduit à un réseau tubulo-alvéolaire hautement ramifié. En même temps, les cellules epitheliales mammaires (CEM) deviennent polarisés et capable de synthétiser et sécréter des produits laitiers. CEM organisent en de nombreuses structures alvéolaires (de acini) qui sont entourés par des cellules myoépithéliales contractiles et incorporés dans un stroma composée de tissus conjonctifs et adipeux, les vaisseaux sanguins et les terminaisons nerveuses (figure 1B, la grossesse). En outre, le côté basal de CEM est en contact étroit avec la membrane basale (de la matrice extracellulaire), et les interactions entre ces deux entités réguler étroitement à la fois fonction de la morphogenèse et sécrétoire de la mamanry épithélium 11-13. Tous ces procédés reposent sur l&#39;action de divers signaux de l&#39;environnement, dont les plus importants sont les facteurs paracrines hormones14, et la matrice extracellulaire. Par exemple, la progestérone induit étendue latérale de ramification 15 et alveologenesis qui, en combinaison avec la prolactine (PRL) 16,17, favorise et entretient la différenciation des alvéoles. En plus de stéroïdes et PRL18, les cytokines et les voies de signalisation associées au développement (Wnt et Notch voies de signalisation) sont également impliqués dans l&#39;engagement de la lignée mammaire et le développement 19-21. À la fin de la grossesse, les CEM luminal commencent à produire un lait riche en protéines connu sous le nom de colostrum dans la lumière des alvéoles. En outre, la progestérone agit sur la perméabilité épithéliale et depuis les jonctions serrées sont encore ouverts, le colostrum est également trouvé dans la circulation sanguine maternelle. Après l&#39;accouchement, la mammarépithélium y occupe la quasi-totalité du volume de la glande mammaire et est hautement organisée (Figure 2, l&#39;épithélium mammaire). Unités productrices de lait, à savoir les alvéoles (Figure 2, alvéole), sont formés par une monocouche de cellules épithéliales mammaires sécrétoires polarisées (de mESCs), avec leur membrane plasmique apicale délimitant la lumière. Alvéoles se disposent en lobules qui sont regroupés en lobes reliés à des conduits qui drainent le lait au milieu extérieur (Figure 2, lobe). Allaitement se produit, ie., MESCs commencent à sécréter des quantités abondantes de lait, déclenchées principalement par la baisse des hormones placentaires (principalement la progestérone) (figure 1B, lactation). Les gènes de protéines de lait sont activés dans un cours à temps temporelle définie allant de la grossesse à l&#39;allaitement 9,22,23, principalement en réponse à PRL pituitaire publié au moment de la tétée. Parallèlement, les contacts entre mESCs et la matrice extracellulaire de protéines de lait à la fois stimuler Synthesis par des signaux qui sont médiés par les interactions entre les intégrines cellulaires et laminine 24,25, et suppriment l&#39;apoptose dans mESCs 26,27. Ces voies de signalisation donnent lieu à l&#39;activation des protéines de lait de 28 promoteurs de gènes par le biais de l&#39;activation de facteurs de transcription spécifique 29. Contacts cellule-cellule sont également importants pour certains aspects de la différenciation, y compris l&#39;établissement de la polarité apicale et la sécrétion vectoriel de produits laitiers. Jonctions serrées rapidement fermer après le début de la lactation et mESCs orchestrer finement l&#39;absorption de molécules dans le sang ainsi que la synthèse, le transport et la sécrétion des composants du lait, en réponse aux besoins nutritionnels des nouveau-nés. Au moment de la tétée, la contraction des cellules myoépithéliales entourant les alvéoles se produit en réponse à l&#39;ocytocine et conduit à l&#39;éjection du lait à travers les conduits et dans le mamelon. Le lait est un liquide complexe qui contient des protéines (surtoutcaséines), des sucres (lactose principalement), des lipides et des minéraux, ainsi que des molécules bioactives telles que des immunoglobulines A (IgA), des facteurs de croissance et hormones. Les caséines sont synthétisés, assemblés en structures supramoléculaires, à savoir les micelles de caséine, transportés le long de la voie sécrétoire, et ensuite libérés par exocytose, à savoir la fusion des vésicules de sécrétion contenant de la caséine (SV) avec la membrane plasmique apicale des MESC (figure 2). Trafic intracellulaire repose sur les échanges de matériels entre les compartiments membranaires et implique Soluble N-éthylmaléimide sensible Fusion (NSF) Attachment Protein (SNAP) Receptor (SNARE) 30,31. La famille des protéines SNARE est subdivisé en SNAREs vésiculaires (v-SNARE), présents dans la membrane des vésicules, et des pièges cibles (t-SNARE), localisés sur les membranes cibles. Par zipping à travers leurs domaines coiled-coil, V- et t-SNARE assemblent pour former un complexe de faisceau à quatre hélices hautement stable, dénommé ecomplexe SNARE e. Ce complexe favorise la fusion de deux bicouches lipidiques opposées en les amenant progressivement à proximité immédiate 30,32. Ensuite, complexes SNARE sont dissociées par l&#39;adénosine triphosphatase NSF et ses protéine adaptatrice protéines SNAP et le filet, sont recyclés à leur compartiment d&#39;origine 33. Fait intéressant, chaque protéine SNARE réside principalement dans les compartiments cellulaires distincts et SNARE appariement peut contribuer à la spécificité des événements intracellulaires 34 de fusion. Des études antérieures suggèrent qu&#39;au moins 23 protéines (SNAP23) et associée à la vésicule Membrane Protein 8 (VAMP8), et syntaxins (STX) Synaptosomal associée -7 et -12 jouent un rôle dans la caséine exocytose 35,36. Ces protéines ont également été trouvés en association avec la fraction lipidique du lait, à savoir, matière grasse du lait globules (MFG) 37. Le modèle qui prévaut courant postule que les gouttelettes lipidiques cytoplasmiques (CLD) sont formées par l&#39;accumulation de l neutreipids (principalement des triglycérides et des esters de sterol) et cholestérol dérivé de l&#39;alimentation maternelle entre les deux feuillets du réticulum endoplasmique (ER) de 38 à 41 membrane. Pour les CLD sont formées, au moins en partie, par la fusion de petites CLD pendant son transport vers le côté apical de mESCs où ils sont libérés en tant que MFG (1-10 um de diamètre) par bourgeonnement, étant enveloppé par la membrane plasmique apicale des MESC 40-42. Allaitement cesse après petits sont sevrés et les mESCs meurent progressivement par apoptose, conduisant à la régression du tissu mammaire à un état ​​pubertaire (figure 1B, l&#39;involution). Immunofluorescence (IF) est une méthode de laboratoire analytique commun utilisé dans presque tous les aspects de la biologie, à la fois dans la recherche et en diagnostic clinique. Si les techniques peuvent être effectuées sur des coupes de tissus (immunohistochimie, IHC) ou cellulaires (immunocytochimie, CPI) échantillons. Cette approche puissante repose sur l&#39;utilisation de fluorescent-des anticorps marqués qui se lient spécifiquement (directement ou indirectement) à l&#39;antigène d&#39;intérêt, permettant ainsi la visualisation de sa distribution dans les tissus par microscopie de fluorescence. Les signaux de fluorescence dépendent principalement de la qualité et la concentration des anticorps et la manipulation de l&#39;échantillon. Un protocole simple immunofluorescence indirecte (IIF) est présenté pour détecter les produits de lait (caséines et MFG) et des protéines impliquées dans la sécrétion de lait produit (butyrophiline (BTN1), caisse claire protéines) sur des sections congelées de tissu mammaire de la souris (Figure 3). Bien que ce protocole fournit un aperçu complet IHC, allant de la collecte de tissus à l&#39;image de post-traitement, critique et des étapes facultatives ainsi que quelques recommandations techniques sont également présentés et discutés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:756px;" width="755">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dissection</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:236px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Pins</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ethanol</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Scissors</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel and adapted blades</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ice</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Towel paper</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Tissue sample preparation</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate Buffered Saline (pH7.4)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>P-3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml)</td>
			<td style="width:155px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OCT compound/Tissue Tek</td>
			<td style="width:155px;">Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose (D-saccharose)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>27480.294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Plastic molds</td>
			<td style="width:155px;">Dominique Dutscher</td>
			<td>39910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Cryostat/sample support</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Razor blades (SEC35)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>152200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Slide box</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>10143560W90/1014356190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Brushes</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">IHC</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Super Pap Pen</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>Z377821-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Permanent marker (black)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:239px;">50 mM NH4Cl in PBS</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A-0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">0.1 M glycine in PBS</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>24403.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Heater (up to 100&#176;C)</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI</td>
			<td style="width:155px;">Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000/H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade)</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td>CORN2980-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Nail polish</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Primary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences 
			Center, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Biolegend (Covance)</td>
			<td>MMS-162P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Scientific</td>
			<td>MS-115-P0/P1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:239px;">Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:239px;">Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">generously gifted S. Tooze 
			(Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td>ab3348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Secondary antibodies</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;">Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution)</td>
			<td style="width:155px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-025-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Counterstains</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">Bodipy 493/503</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies (Molecular Probes)</td>
			<td>D-1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Observation/Image capture</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">conventional fluorescence microscope</td>
			<td style="width:155px;">Leica Leitz DMRB 
			microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Standard filters for FITC, Rhodamine 
			and DAPI emissions,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), Cell&#710;F software (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:239px;">Laser Scanning Microscope (confocal microscopy)</td>
			<td style="width:155px;">Zeiss LSM 
			510 microscope</td>
			<td></td>
			<td style="width:236px;">Plan-Apochromat &#215;63 oil-immersion objective (NA 1.4),&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; CLSM 510 software,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Image treatment</td>
			<td style="width:155px;">Company</td>
			<td style="width:127px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ 1.49k software</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
			<td>Free software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

indirect immunofluorescence on frozen sections of mouse mammary gland

L&#39;immunofluorescence indirecte est utilisé pour détecter et localiser des protéines d&#39;intérêt dans un tissu. Le protocole présenté ici décrit un procédé simple et complet pour la détection de protéines immunitaire, la souris glande mammaire en lactation étant pris comme exemple. Un protocole de préparation des échantillons de tissu, en particulier en ce qui concerne la dissection de la glande mammaire de la souris, la fixation du tissu et la coupe de tissu congelé, sont décrites en détail. Un protocole standard pour effectuer immunofluorescence indirecte, y compris une étape de récupération de l&#39;antigène en option, est également présenté. L&#39;observation des coupes de tissus marqués ainsi que l&#39;acquisition de l&#39;image et post-traitements sont également indiqués. Cette procédure donne une vue d&#39;ensemble, à partir de la collection de tissus d&#39;origine animale pour la localisation cellulaire d&#39;une protéine. Bien que ce procédé général peut être appliqué à d&#39;autres échantillons de tissu, elle doit être adaptée à chaque couple d&#39;anticorps de tissu / primaire étudié.

La glande mammaire est une glande sous-cutané situé le long de la structure à la fois ventrale du thorax et de l&#39;abdomen chez les rongeurs. L&#39;emplacement des cinq paires de glandes de la souris pendant la gestation est montré dans la figure 4. La morphologie de la glande mammaire change radicalement au cours de son développement, reflétant des modifications fonctionnelles requises pour préparer la lactation complète (figure 1B). Chez les ani...

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Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Le protocole d&#39;immunofluorescence indirecte décrite dans cet article permet la détection et la localisation de protéines dans la glande mammaire de la souris. Procédé complète est donnée pour préparer des échantillons de la glande mammaire, pour effectuer l&#39;immunohistochimie, l&#39;image de coupes de tissus par microscopie à fluorescence, et de reconstruire des images.

Immunofluorescence indirecte sur des coupes congelées de glande mammaire de souris

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

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Research

JoVE Journal

Biology

36.5K vues.  INRA.  Le protocole d'immunofluorescence indirecte décrite dans cet article permet la détection et la localisation de protéines dans la glande mammaire de la souris. Procédé complète est donnée pour préparer des échantillons de la glande mammaire, pour effectuer l'immunohistochimie, l'image de coupes de tissus par microscopie à fluorescence, et de reconstruire des images. 

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Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

L&#39;immunohistochimie sur coupes en paraffine d&#39;épiderme de souris en utilisant des anticorps fluorescents

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Recherche

Biologie

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Souris cellules épithéliales mammaires forme Mammospheres cours de la différenciation lactogène

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Changements dans la morphologie glande mammaire et le risque de cancer du sein chez les rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

L&#39;isolement des cellules souches de la souris salivaires Gland

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluation de développement des glandes mammaires et fonction dans des modèles murins

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Profilage Single Cell transcriptionnelle des cardiomyocytes de souris adultes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Injection intra-canalaire pour localisée Drug Delivery de la glande mammaire de souris

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and activating sperm, the components in the seminal fluid can also influence female physiology to augment fertilization success of the sperm donor. While many studies have reported such effects in species with separate sexes, few studies have addressed this in simultaneously hermaphroditic animals. This video protocol presents a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using a simultaneously hermaphroditic freshwater snail, the great pond snail Lymnaea stagnalis, as model organism. While the procedure is shown using complete prostate gland extracts, individual components (i.e., proteins, peptides, and other compounds) of the seminal fluid can be tested in the same way. Effects of the receipt of ejaculate components on egg laying can be quantified in terms of frequency of egg laying and more subtle estimates of female reproductive performance such as egg numbers within each egg masses. Results show that seminal fluid proteins affect female reproductive output in this simultaneous hermaphrodite, highlighting their importance for sexual selection.

This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.

Effet de la Femme accessoire Gland produits sur la ponte dans les gastéropodes

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

Isolement des glandes mammaires de souris intacte, toute analyse d’Expression de la matrice extracellulaire et la morphologie de la glande

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...