The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.

1. Préparation de la Culture, des Médias et Plats <ol><li> Ajouter 200 ml d&#39;Biggers Whitten et Whitten (BWW) 17 solution de travail en ajoutant 5,54 g de NaCl, 0,356 g de KCl, 0,25 g de CaCl2, 0,162 g de H 2 KO 4 P et 0,294 g MgSO 4 à 1 L d&#39;eau Milli-Q . Ce est la solution de stock et peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu&#39;à un mois. </li><li> De la solution de réserve, ajouter 420 mg de NaHCO 3 -, 200 mg de glucose, 6 pyruvate mg de sodium, 600 mg de sérum-albumine bovine, 0,74 lactate ml de sodium, et 4,0 ml de tampon HEPES à 193 ml du BWW stock. Ce est la solution de travail et se fait toujours fraîches le jour et équilibré à 37 ° C avant utilisation. </li><li> Pour faire la canule, prendre polyéthylène (PE) tubes d&#39;un diamètre intérieur de 0,4 mm et un diamètre externe de 1,1 mm et maintenez sur feu doux (généralement méthanol flamme) de telle sorte que le tube commence à fondre. Immédiatement retirer le tube outwARD se étirer et de faire le diamètre extérieur plus étroit. </li><li> Cut pour produire un rétrécissement d&#39;une extrémité qui permet de faciliter la canulation du canal déférent. </li><li> Couper l&#39;autre extrémité de la canule à environ 15 cm. Insérer une aiguille 30 G dans l&#39;extrémité émoussée, et joindre une seringue de 3 ml à elle (complètement rétractée). </li><li> Faire un embout d&#39;aspiration en coupant une longueur de 20 cm de tube PE (4,2 mm de diamètre intérieur, 6,4 mm de diamètre extérieur). Insérez une embouchure à une extrémité. </li><li> Insérer le support de tube de verre de micro-capillaire et le verre micro-capillaire lui-même (généralement 3 ul d&#39;une souris, 40 pi d&#39;un rat). </li></ol> 2. Retrait de l&#39;épididyme de souris <ol><li> Euthanasier les souris selon des procédures IACUC approuvés spécifiques à chaque institution. </li><li> Prenez l&#39;animal et faire une petite incision dans le scrotum pour exposer l&#39;épididyme. Tirez le testicule et l&#39;épididyme hors de la cavité à l&#39;aide d&#39;une paire de pince # 5 d&#39;horloger. </li><li> Couper les canaux déférents de sorte qu&#39;au moins 1-2 cm restent attachés à la queue de l&#39;épididyme. En outre, couper les canaux efférents proximales et tissus reliant les épididyme au testicule et retirer la totalité de la piste reproducteur masculin. </li><li> Placez la piste entière reproducteur masculin sous un microscope de dissection avec une plage de grossissement de l&#39;ordre de 5-40X. </li></ol> 3. cannulating l&#39;épididyme <ol><li> Ruban en bas de la canule de microscope, de telle sorte que 2.1 cm de l&#39;extrémité (en forme de cône) rétrécie est libre et visible à travers la lentille. </li><li> Prenez une paire de # 5 pinces d&#39;horloger et serrer doucement chaque côté du canal déférent et tirez le canal déférent sur la canule, de sorte que la canule va dans le canal déférent. </li><li> Prenez une longueur de non-absorbable tressé de soie noire traitée (taille 5-0) et faire un nœud autour des canaux déférents canule. Assurer le nœud est tiré étroitement pour maintenir la canule à l&#39;intérieur des canaux déférents lorsque la pression d&#39;air from la seringue est appliquée. </li></ol> 4. rétrograde ou Backflushing de Caudal spermatozoïdes épididymaires <ol><li> Utilisation horlogers # 5 pince, saisir l&#39;extrémité distale de l&#39;épididyme de cauda et enlever la tunique albuginée afin d&#39;exposer un seul tube de l&#39;épididyme. </li><li> Utilisation de la pince, tirez doucement sur le tube pour exposer puis démêler de manière à créer une ouverture pour le sperme d&#39;être libéré. </li><li> Poussez doucement sur les 3 ml (souris) ou 20 ml (rat) seringue pour expulser l&#39;air de la seringue dans le canal déférent. À la pression appropriée, les spermatozoïdes va commencer à revenir lentement sur le tubule brisée à l&#39;extrémité distale de la queue de l&#39;épididyme. A cette époque, appliquer une aspiration à l&#39;embouchure de tirer les spermatozoïdes dans le capillaire de verre. Remarque: En général, dans une souris, 2-3 ul de spermatozoïdes peut être obtenu en fonction de l&#39;âge de l&#39;animal. Une volonté de rat, le rendement moyen de 30 à 40 pi. </li></ol> 5. laveret la lyse des spermatozoïdes dans la préparation pour protéomique <ol><li> Expulser les spermatozoïdes dans le tube capillaire en verre dans 1 ml de solution de solution BWW (37 ° C) en soufflant doucement dans l&#39;embout ou la fixation d&#39;une seringue et d&#39;expulser de l&#39;air de manière à pousser les spermatozoïdes arrière du capillaire. </li><li> Une fois que les spermatozoïdes sont diffusés, laver 3x (300 g, 5 min) avec 1 ml BWW pour éliminer les protéines contaminantes. Après le lavage final, éliminer le surnageant. Remarque: À ce stade, les spermatozoïdes peuvent être congelés pour une utilisation ultérieure. </li><li> Solubiliser les protéines à l&#39;aide de 4% de CHAPS, 2 M, thio-urée et 50 mM de Tris, pH 7,4 pendant 1 h sous agitation en tourbillons intermittent. </li><li> Après la lyse des cellules, centrifugeuse (10 000 xg, 20 min), prendre surnageant et transférer dans un nouveau tube. Remarque: À ce stade, la quantification des protéines peut être effectuée. </li></ol> 6. disulfure réduction et alkylation <ol><li> Ajouter 10 mM de DTT comme une concentration finale de protéines lysées, vortex et incuber à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Ajouter 50 mM idodoacetamide comme une concentration finale de lysat, vortex et incuber à température ambiante pendant 30 min dans l&#39;obscurité. </li></ol> 7. Précipitation <ol><li> Le méthanol chloroforme précipiter l&#39;échantillon en ajoutant 1 volume de lysat (400 ul à titre d&#39;exemple), ajouter un volume (400 ul) de méthanol et 0,5 volume (200 ul) du chloroforme. </li><li> Vortex de l&#39;échantillon et de spin (10000 xg, 2 min). </li><li> Notez que deux phases apparaîtront après centrifugation. Jeter toutes, mais de 2 mm de la couche supérieure (en faisant attention de ne pas perturber l&#39;interface). </li><li> Ajouter 1 volume (400 pi) de méthanol, le tube inverti 1-2X doucement pour mélanger et encore tourner (10000 xg, 15 min). Rejeter le surnageant à perdre et l&#39;air culot sec 3-4 min. </li></ol> 8. digestion par la trypsine <ol><li> Reconstituer la trypsine dans 25 mM de bicarbonate d&#39;ammonium contenant 1 M d&#39;urée à un rapport de 50: 1 (poids / poids; teneur en protéines: la trypsine) et incubées overnight à 37 ° C, de préférence à 700 rpm sur un thermomixer. </li><li> Spin (10000 xg, 15 min) pour sédimenter matière non digérée. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. </li></ol> 9. Phosphopeptide Enrichissement <ol><li> Effectuer la purification et l&#39;enrichissement de phosphopeptides du tryptique digérer comme décrit précédemment 18. Diluer peptides tryptiques 10 fois dans du tampon de DHB [DHB tampon se compose de: 350 mg / ml d&#39;acide 2,5 dihydrobenzesulfonic (DHB), 80% (v / v), ACN (acétonitrile), 2% (v / v) de TFA (trifluoroacétique l&#39;acide)] et se appliquent à sécher TiO 2 perles (200 ug). </li><li> Laisser un rotateur à la température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Laver l&#39;échantillon avec un tampon de DHB, tourner et retirer surnageant. Laver ensuite l&#39;échantillon trois fois avec le tampon de lavage [80% ACN (v / v), 2% de TFA (v / v)] pour supprimer le DHB. </li><li> Après l&#39;essorage final, on élue directement les phosphopeptides en utilisant un tampon d&#39;élution par addition de 25 ul d&#39;un hydroxyde d&#39;ammonium à 2,5%, pH ≥ 10,5 solution. Sla broche et retirer le surnageant. Neutraliser immédiatement avec ~ 0,3 acide formique ul. </li></ol>

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	<li>Blandau, R., Rumery, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+swimming+movements+of+epididymal+spermatozoa+to+their+fertilizing+capacity.">The relationship of swimming movements of epididymal spermatozoa to their fertilizing capacity.</a> Fertil. Steril. 15, 571-579 (1964).</li><li>Tournade, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diff&#233;rence+de+motilit&#233;+des+spermatozo&#239;des+pr&#233;lev&#233;s+dans+les+divers+segments+de+l&#8217;&#233;pididyme.">Diff&#233;rence de motilit&#233; des spermatozo&#239;des pr&#233;lev&#233;s dans les divers segments de l&#8217;&#233;pididyme.</a> C. R. Soc. Biol. 74, 738-739 (1913).</li><li>Wyker, R., Howards, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropuncture+studies+of+the+motility+of+rete+testis+and+epididymal+spermatozoa.">Micropuncture studies of the motility of rete testis and epididymal spermatozoa.</a> Fertil. Steril. 28, 108-112 (1977).</li><li>Eddy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+germ+cell+gene+expression.">Male germ cell gene expression.</a> Recent progress in hormone research. 57, 103-128 (2002).</li><li>Lin, M., Lee, Y. H., Xu, W., Baker, M. A., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ontogeny of Tyrosine Phosphorylation-Signaling Pathways During Spermatogenesis and Epididymal Maturation in the Mouse. 75 (4), 588-597 (2006).</li><li>Jones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+structure+and+remodelling+during+sperm+maturation+in+the+epididymis.">Plasma membrane structure and remodelling during sperm maturation in the epididymis.</a> J. Reprod. Fertil. Suppl. 53, 73-84 (1998).</li><li>Robaire, B., Hinton, B. T., Orgebin-Crist, M. C., Neill, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Epididymis. 3, 1072-1120 (2006).</li><li>Lacham, O., Trounson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+capacity+of+epididymal+and+testicular+spermatozoa+microinjected+under+the+zona+pellucida+of+the+mouse+oocyte.">Fertilizing capacity of epididymal and testicular spermatozoa microinjected under the zona pellucida of the mouse oocyte.</a> Mol. Reprod. Dev. 29, 85-93 (1991).</li><li>Bedford, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+duct+ligation+on+the+fertilizing+ability+of+spermatozoa+from+different+regions+of+the+rabbit+epididymis.">Effects of duct ligation on the fertilizing ability of spermatozoa from different regions of the rabbit epididymis.</a> J. Exp. Zool. 166, 271-281 (1967).</li><li>Orgebin-Crist, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+function+of+the+epididymis.">Studies on the function of the epididymis.</a> Biol, Reprod. 1, 155-175 (1969).</li><li>Orgebin-Crist, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+spermatozoa+in+the+rabbit+epididymis:+effect+of+castration+and+testosterone+replacement.">Maturation of spermatozoa in the rabbit epididymis: effect of castration and testosterone replacement.</a> J. Exp. Zool. 185, 301-310 (1973).</li><li>Lin, M., Hess, R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+sperm+maturation+in+vitro+in+epididymal+cell+cultures+of+the+tammar+wallaby+(Macropus+eugenii):+disruption+of+motility+initiation+and+sperm+morphogenesis+by+inhibition+of+actin+polymerization.">Induction of sperm maturation in vitro in epididymal cell cultures of the tammar wallaby (Macropus eugenii): disruption of motility initiation and sperm morphogenesis by inhibition of actin polymerization.</a> Reproduction. 124, 107-117 (2002).</li><li>Baker, M. A., Hetherington, L., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+SRC+as+a+key+PKA-stimulated+tyrosine+kinase+involved+in+the+capacitation-associated+hyperactivation+of+murine+spermatozoa.">Identification of SRC as a key PKA-stimulated tyrosine kinase involved in the capacitation-associated hyperactivation of murine spermatozoa.</a> J. Cell. Sci. 119, 3182-3192 (2006).</li><li>Baker, M. A., Hetherington, L., Curry, B., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+consequent+stimulation+of+the+tyrosine+kinase+c-Abl+by+PKA+in+mouse+spermatozoa;+its+implications+during+capacitation.">Phosphorylation and consequent stimulation of the tyrosine kinase c-Abl by PKA in mouse spermatozoa; its implications during capacitation.</a> Dev. Biol. 333, 57-66 (2009).</li><li>Baker, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Titanium+Dioxide+To+Find+Phosphopeptide+and+Total+Protein+Changes+During+Epididymal+Sperm+Maturation.">Use of Titanium Dioxide To Find Phosphopeptide and Total Protein Changes During Epididymal Sperm Maturation.</a> J. Proteome. Res. 10 (3), 1004-1017 (2010).</li><li>Baker, M. A., Weinberg, A., Hetherington, L., Velkov, T., Aitken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Ejaculatory+Changes+in+the+Metabolic+Status+of+Rat+Spermatozoa+as+Measured+by+GC-MS.">Post-Ejaculatory Changes in the Metabolic Status of Rat Spermatozoa as Measured by GC-MS.</a> Metabolomics. 11, 1-14 (2012).</li><li>Biggers, J. D., Whitten, W. K., Whittingham, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The culture of mouse embryos in vitro. , (1971).</li><li>Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+from+peptide+mixtures+using+titanium+dioxide+microcolumns.">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns.</a> Mol. Cell. Proteomics. 4, 873-886 (2005).</li><li>Wessel, D., Flugge, U. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+quantitative+recovery+of+protein+in+dilute+solution+in+the+presence+of+detergents+and+lipids.">A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids.</a> Anal. Biochem. 138, 141-143 (1984).</li><li>Thingholm, T. E., Jorgensen, T. J., Jensen, O. N., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+selective+enrichment+of+phosphorylated+peptides+using+titanium+dioxide.">Highly selective enrichment of phosphorylated peptides using titanium dioxide.</a> Nat. Protoc. 1, 1929-1935 (2006).</li><li>Thingholm, T. E., Larsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+titanium+dioxide+micro-columns+to+selectively+isolate+phosphopeptides+from+proteolytic+digests.">The use of titanium dioxide micro-columns to selectively isolate phosphopeptides from proteolytic digests.</a> Methods. Mol. Biol. 527, 57-66 (2009).</li><li>Ecroyd, H., Asquith, K. L., Jones, R. C., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+signal+transduction+pathways+during+epididymal+maturation+is+calcium+dependent.">The development of signal transduction pathways during epididymal maturation is calcium dependent.</a> Dev. Biol. 268, 53-63 (2004).</li><li>Ecroyd, H., Jones, R. C., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+Phosphorylation+of+HSP-90+During+Mammalian+Sperm+Capacitation.">Tyrosine Phosphorylation of HSP-90 During Mammalian Sperm Capacitation.</a> Biol. Reprod. 69 (6), 1801-1807 (2003).</li><li>Jones, R., Mann, T., Sherins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxidative+breakdown+of+phospholipids+in+human+spermatozoa,+spermicidal+properties+of+fatty+acid+peroxides,+and+protective+action+of+seminal+plasma.">Peroxidative breakdown of phospholipids in human spermatozoa, spermicidal properties of fatty acid peroxides, and protective action of seminal plasma.</a> Fertil. Steril. 31, 531-537 (1979).</li><li>Wade, M. A., Jones, R. C., Murdoch, R. N., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+activation+and+second+messenger+signalling+in+spermatozoa+from+rat+cauda+epididymidis.">Motility activation and second messenger signalling in spermatozoa from rat cauda epididymidis.</a> Reproduction. 125, 175-183 (2003).</li><li>Nolan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm-specific+protein+kinase+A+catalytic+subunit+C{alpha}2+orchestrates+cAMP+signaling+for+male+fertility.">Sperm-specific protein kinase A catalytic subunit C{alpha}2 orchestrates cAMP signaling for male fertility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13483-13488 (2004).</li><li>Mitchell, L. A., Nixon, B., Baker, M. A., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+role+of+SRC+in+capacitation-associated+tyrosine+phosphorylation+of+human+spermatozoa.">Investigation of the role of SRC in capacitation-associated tyrosine phosphorylation of human spermatozoa.</a> Mol. Hum. Reprod. 14, 235-243 (2008).</li><li>Leclerc, P., Goupil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+human+sperm+tyrosine+kinase+c-yes.+Activation+by+cyclic+adenosine+3',5'-monophosphate+and+inhibition+by+Ca(2).">Regulation of the human sperm tyrosine kinase c-yes. Activation by cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and inhibition by Ca(2).</a> Biol. Reprod. 67, 301-307 (2002).</li><li>Krapf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Ser/Thr+phosphatases+induces+capacitation-associated+signaling+in+the+presence+of+Src+kinase+inhibitors.">Inhibition of Ser/Thr phosphatases induces capacitation-associated signaling in the presence of Src kinase inhibitors.</a> J. Biol. Chem. 285, 7977-7985 (2010).</li><li>Lundgren, D. H., Hwang, S. I., Wu, L., Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+spectral+counting+in+quantitative+proteomics.">Role of spectral counting in quantitative proteomics.</a> Expert. Rev. Proteomics. 7, 39-53 (2010).</li><li>Platt, M. D., Salicioni, A. M., Hunt, D. F., Visconti, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differential+isotopic+labeling+and+mass+spectrometry+to+analyze+capacitation-associated+changes+in+the+phosphorylation+status+of+mouse+sperm+proteins.">Use of differential isotopic labeling and mass spectrometry to analyze capacitation-associated changes in the phosphorylation status of mouse sperm proteins.</a> J. Proteome. Res. 8, 1431-1440 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Les étapes critiques pour une analyse protéomique succès et reproductible des spermatozoïdes sont: 1) la pureté du produit de départ; 2) l&#39;élimination des sels et détergents non désirées; 3) la dénaturation des protéines dans leur intégralité, afin de permettre la trypsine pour digérer un rendement élevé de protéines et 4) réduisant au minimum la manipulation des échantillons pour réduire la perte de peptide. Pour Backflush succès la queue de l&#39;épididyme, il est essentiel de localiser la zone à partir de laquelle les spermatozoïdes se quitter. Dans le cas du rat et la souris, ce est au niveau du sommet de la zone concave, au milieu de la région caudale de l&#39;épididyme (voir la figure 2A). Si l&#39;on vient de plus vers le canal déférent, rinçage est plus facile et le taux de réussite est généralement plus élevé. Toutefois, cela vient de la perte de nombre de spermatozoïdes. Par ailleurs, si l&#39;on tente de déplacer plus proximale au corpus, le montant de la pression nécessaire pour pousser les spermatozoïdes à travers le epididymconduits AL est souvent si élevé, que les dommages à l&#39;épididyme se produit inévitablement. Rinçage à contre courant de l&#39;épididyme est traditionnellement réalisée en utilisant de l&#39;eau saturée de l&#39;huile minérale et une solution saline équilibrée dans la seringue elle-même comme milieu pour éliminer les spermatozoïdes 22-25. Les deux procédures sont potentiellement problématique de LC-MS. Tout d&#39;abord, minérale est susceptible de bloquer les nano-colonnes nano-C18 qui sont essentiellement utilisés dans le monde entier pour l&#39;analyse protéomique et les soins doivent être prises afin qu&#39;aucun est reporté dans la procédure. Si cela se produit, il est impossible de poursuivre et l&#39;échantillon est essentiellement perdu. Cela peut être surmonté par l&#39;utilisation de BWW ou d&#39;autres solutions salines équilibrées dans la seringue, cependant, bien que ce est un succès, nous avons vite reconnu que bon nombre des spermatozoïdes deviennent mobiles dès que la solution de BWW est entré en contact et mélangé avec le épididyme caudal cellules. Pour contourner ce problème, nous Backflush simplement les spermatozoïdes avec l&#39;air. Non seulement la quallité des spermatozoïdes comparable à celle des procédés en phase liquide, mais la quantité est identique. Phosphoprotéomique est peut-être l&#39;un des seuls moyens d&#39;établir des voies de signalisation qui se produisent dans les spermatozoïdes après l&#39;éjaculation. L&#39;une des principales voies que nous examinons est le processus de capacitation. Les spermatozoïdes doit subir &quot;capacitation&quot; avant qu&#39;il ne soit capable de se lier à un oeuf. Dans la pratique, ceci est réalisé essentiellement par incubation des spermatozoïdes pendant une période de temps (40 min souris, rat 1,5 h; h 24.3 humain) en solution BWW avec de l&#39;albumine sérique. Auparavant, nous et d&#39;autres avons montré un rôle pour plusieurs kinases impliquées dans la capacitation. D&#39;intérêt, la suppression de la PKA μ II produire des souris dont les spermatozoïdes nager spontanément in vitro, mais ne peut pas subir une hyperactivation 26. Cette dernière est une marque de capacitation, lequel spermatozoïdes à modifier leur modèle de natation d&#39;une grande vitesse, faible amplitude, à une faiblevitesse, grande amplitude fréquence de battement. Nous avons montré kinases en aval impliqués dans ce processus comprennent pp60-CSRC (SRC) 13,27 c-28 et oui c-ABL 14. Fait intéressant, l&#39;inhibition de la SRC se arrête capacitation dépendant phosphorylation sur tyrosine 13. Cependant, cela peut être surmonté avec de l&#39;acide okadaïque, ce qui suggère que la SRC ne est pas directement impliqué dans l&#39;apparition générale de la phosphorylation sur tyrosine 29 mais peut réglementer une phosphatase 29. Le problème avec l&#39;utilisation BWW comme un moyen de forcer les spermatozoïdes de l&#39;épididyme est que, une fois activé, les spermatozoïdes de souris seulement prendre environ 40 min à capacitation. Étant donné que l&#39;isolement des spermatozoïdes peut prendre 5 min / souris et souvent plusieurs souris sont utilisées dans une expérience, puis spermatozoïdes sera à différents stades de maturité au début de l&#39;expérience. Pour surmonter cela, la pression d&#39;air peut être utilisé pour pousser les spermatozoïdes de l&#39;épididyme caudal dans une canule de verre. Non seulement tout le inact de spermeIVE et essentiellement comme ils se trouvent dans le milieu caudale, il permet de comparer phosphoprotéomique non-mobiles et mobiles. Manutention pour phosphoprotéomique échantillon doit être maintenu à un minimum lorsque l&#39;on compare spermatozoïdes dans deux états fonctionnels différents. L&#39;utilisation de méthanol chloroforme sur les autres méthodes traditionnelles de précipitation des protéines 1) diminue la nécessité d&#39;étapes de lavage supplémentaires, 2) élimine presque toutes traces de sels et graisses et 3) a une capacité éprouvée pour précipiter les protéines de faible abondance sur 19 TCA. La précipitation des protéines avant la digestion par la trypsine est recommandée car non seulement cette aide à dénaturer la protéine (ce qui facilite la digestion de la trypsine), mais élimine la plupart des métabolites MS-incompatibles présents dans la cellule. La comparaison des phosphopeptides de sperme peut être fait dans un certain nombre de façons. Au niveau de base, une simple comparaison du phosphopeptide identifié dans un échantillon, à celle dans un autreéchantillon dans le processus connu sous le nom &quot;spectral counting&quot; peut être fait. Cependant la critique a été à cette démarche essentiellement parce que les études protéomiques début utilisaient faibles répétitions (pour une discussion plus approfondie voir Lundren et al. 30). Une approche plus sophistiquée consiste à examiner l&#39;intensité de la masse peptidique parente et comparer avec les autres échantillons (comparaison sans étiquette). Dans l&#39;exemple représenté sur la figure 4, un peptide de absents de la non mobile (figure 4 en haut) mais présente dans le motile (figure 4 en bas) de spermatozoïdes à partir de m / z de 650 à 670 peut être vu. Ce processus, appelé label-MS sans quantification est une stratégie sans étiquette. Une stratégie alternative couramment utilisée pour réduire la quantité de pistes nécessaires pour la quantification protéomique est d&#39;utiliser les isotopes. Comme la masse de l&#39;isotope est différent, le spectromètre de masse peut être utilisée pour comparer les intensités des Eluting peptides. Cependant, contrairement à la plupart des autres types de cellules, certains marquage isotopique ne peut pas être appliquée aux spermatozoïdes. Par exemple, l&#39;addition d&#39;isotopes stables (un isotope lourd est ajouté à un échantillon, tandis qu&#39;une version plus légère est ajoutée à l&#39;autre) peuvent être utilisés en culture tissulaire. Lorsque les isotopes se incorporés dans la protéine, une analyse protéomique peut être effectuée en combinant les deux échantillons (multiplexage). Toutefois, dans le cas de spermatozoïdes, ce ne est pas possible, simplement en vertu du fait que 1) marquage isotopique nécessite plusieurs passages (jusqu&#39;à 8) en culture tissulaire, et 2) les cellules de sperme n&#39;a aucune transcription des gènes nucléaires et de la traduction et, par conséquent, ils ne peuvent pas incorporer toute façon les isotopes dans toutes leurs protéines. Une façon de contourner cela est de commander des souris radiomarqués, cependant, ce sont notoirement coûteux. Une approche alternative est d&#39;utiliser une étiquette chimique. Cela a été fait lorsque les souris non capacitation ont été comparées avec des souris avec capacités. Dans ce cas, un D 0 et D un <sub&gt; 3 -label a été utilisé pour faire la distinction entre un échantillon et l&#39;autre dans le 31 spectromètre de masse. D&#39;autres approches peuvent inclure l&#39;utilisation de iTRAQ (TAG isobarique pour la quantification relative et absolue), lequel lysines sont étiquetés chimiquement avec différents isotopes de masse; iCAT (isotope codé balise d&#39;affinité) lequel cystéines sont étiquetés avec différents isotopes de masse et l&#39;étiquetage de l&#39;eau lourde et légère. Dans chaque cas, cependant, une chose doit être gardé à l&#39;esprit. Le MS ne signale que ce qui est présent dans un échantillon, et ce est un reflet de tout ce qui est arrivé à cet échantillon jusqu&#39;à ce point. Minimiser la manipulation des échantillons tout en maximisant le rendement à chaque étape est nécessaire pour une analyse protéomique succès.

Ayant émergé du testicule, les spermatozoïdes sont fortement différenciés mais remarquablement, ces cellules sont immatures 1,2. En tant que tel, ils ne ont pas une fonctionnalité complète, y compris la capacité de nager et se lier à un ovocyte 3. Bien que d&#39;autres maturation du spermatozoïde est nécessaire, ce ne peut avoir lieu par les voies canoniques, car à ce stade de leur processus de différenciation cellulaire, ils sont incapables de la transcription génique et encore la biosynthèse des protéines 4. La compétence biologique est conférée spermatozoïdes qu&#39;ils quittent le testicule et entrent dans une partie du système reproducteur mâle connu comme l&#39;épididyme 5. L&#39;épididyme est un tube enroulé étroitement, hautement différenciée qui relie les canaux efférents (du testicule) pour le canal déférent et est présent chez tous les mammifères mâles 6. Spermatozoïdes acquérir progressivement leur potentiel fertilisant pendant la descente de l&#39;épididyme, en se appuyant sur l&#39;environnement luminal en constante évolution qui est created par les cellules épithéliales de l&#39;épididyme locales 7. Les différentes activités de sécrétion et ré-absorption présents dans l&#39;acte de l&#39;épididyme milieu de modifier le sperme lui-même, changeant son protéines, glucides et lipides composition 6. L&#39;importance de l&#39;épididyme, en particulier la région initiale »habitant» de cette structure a été illustrée en utilisant des techniques chirurgicales de ligature 8. Spermatozoïdes retenu dans le testicule par efferent ligature du canal sont complètement défaut dans toute capacité à féconder l&#39;ovocyte 9-11. En plus de l&#39;environnement de l&#39;épididyme, les voies de transduction du signal au sein de l&#39;ouvrage de spermatozoïdes de manière post-traductionnelle de modifier le complément de la cellule de sperme existant. Par exemple, les spermatozoïdes depuis le début des régions de l&#39;épididyme afficher différents modèles de la phosphorylation des protéines par rapport à ces dernières régions 5,12. Ce ne est pas surprenant car il ya de grandes différences dans la capability des spermatozoïdes à partir de ces régions. Par exemple, les spermatozoïdes du début, habitant épididyme sont immotilite. En revanche, les cellules de sperme provenant de la région de cheval seront soumis avant la motilité progressive une fois placés dans un milieu isotonique. Comme les cellules de sperme de l&#39;épididyme sont incapables de novo la biosynthèse des protéines, toutes les voies intrinsèques réglementant la fonction des spermatozoïdes doivent être par des modifications post-traductionnelles (PTM). Par conséquent, il va de soi que la protéomique, et en particulier l&#39;enquête du PTM comme la phosphorylation doit être un axe majeur si nous voulons comprendre la maturation des cellules de sperme. Une autre méthode pour obtenir des spermatozoïdes epididymidies utiliser rétro-rinçant 13-16. Bien que cette technique est certainement plus de temps et prend un plus grand degré de compétence par l&#39;opérateur, les spermatozoïdes obtenu constamment démontrer pureté supérieure à 99,99%. En outre, contrairement à tous les autres techniques, les spermatozoïdes can être isolé dans un état de repos, ce qui permet d&#39;étudier comment la motilité des spermatozoïdes est lancé. Comme préparation de l&#39;échantillon est l&#39;aspect le plus important pour l&#39;analyse protéomique, l&#39;isolement des spermatozoïdes est devenu l&#39;un des aspects les plus importants des études de sperme-protéomique. Ce protocole fournit une explication sur la façon dont les spermatozoïdes sont isolés de la queue de l&#39;épididyme. Suite à cela, le TiO 2 phosphopeptide procédé d&#39;enrichissement est présenté, avec une référence spécifique sur la façon d&#39;extraire des peptides à partir des cellules de sperme très différenciés. L&#39;approche de MS peut être utilisée pour distinguer l&#39;évolution des phosphopeptides si l&#39;on devait comparer l&#39;épididyme spermatozoïdes caudale dans un État (immobiles ou non-capacitation) à un autre (mobiles, capacitation, acrosome réagi, etc.) ce qui en fait une approche puissante pour étudier spermatozoïdes fonction.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="687">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>195464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-D Quantitation Kit</td>
			<td>VWR (GE Healthcare)</td>
			<td>80-6483-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonia Solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>1300C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>BDH</td>
			<td>10077.6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">di-sodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O6440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine-L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes (free acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetic acid free acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Res. Org.</td>
			<td>0090M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10158.6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll (sterile)</td>
			<td>VWR (GE Healthcare)</td>
			<td>GEHE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pierce)</td>
			<td>PIE78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Medical Store</td>
			<td>CH 600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>10247.4V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Ultra Pure Grade</td>
			<td>Amresco (Astral)</td>
			<td>AM0497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin Gold-Mass Spec Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4 mm polyethylene tubing</td>
			<td style="width:175px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:129px;">ET317100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">30 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;">Terumo</td>
			<td style="width:129px;">NN2038R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3 mL syringe</td>
			<td style="width:175px;">Terumo</td>
			<td style="width:129px;">SS035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4.2 mm polyethylene tubing</td>
			<td style="width:175px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:129px;">ET317640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Braided silk (5-0)</td>
			<td style="width:175px;">Dynek</td>
			<td style="width:129px;">CSS0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>299537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TiO2 beads (from disassembled column)</td>
			<td style="width:175px;">Titansphere</td>
			<td style="width:129px;">6HT68003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eppendorf Tube</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C7B30</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">C0856</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phosphopeptide analysis of rodent epididymal spermatozoa

Les spermatozoïdes sont tout à fait unique parmi les types de cellules. Bien que produite dans les testicules, à la fois la transcription des gènes nucléaires et la traduction sont éteints fois la cuve ronde pré-curseur commence à se allonger et de se différencier dans ce qui est morphologiquement reconnu comme un spermatozoïde. Toutefois, le spermatozoïde est très immature, ne ayant aucune possibilité pour la motilité ou la reconnaissance d&#39;oeuf. Ces deux événements se produisent une fois le transit des spermatozoïdes un organe secondaire connu comme l&#39;épididyme. Pendant la journée, ~ 12 passage que cela prend pour une cellule de sperme de passer à travers l&#39;épididyme, les modifications post-traductionnelles des protéines existantes jouent un rôle essentiel dans la maturation de la cellule. Un aspect important de ce type est la phosphorylation des protéines. Afin de caractériser les événements de phosphorylation qui auront lieu pendant la maturation des spermatozoïdes, les deux populations de cellules de sperme purs et pré-fractionnement de phosphopeptides doivent être établies. Utilisation de retour techniques de chasse, une méthode pour l&#39;isolement de pur spermatozoïdes of haute qualité et le rendement de l&#39;épididyme distales ou caudale est décrite. Les étapes de solubilisation, la digestion et de pré-fractionnement de phosphopeptides de sperme par Chromatographie d&#39;affinité de TiO 2 sont expliqués. Une fois isolé, phosphopeptides peuvent être injectés dans MS pour identifier les deux événements de phosphorylation de protéines sur des résidus spécifiques d&#39;acides aminés et de quantifier les niveaux de phosphorylation qui se déroule au cours du processus de maturation des spermatozoïdes.

La qualité des résultats de toute analyse protéomique est fortement tributaire de la matière de départ. Avec MS modernes, de légères contaminations dans la préparation des échantillons sont facilement ramassés. Par conséquent, il est essentiel, dans le cas de la protéomique des cellules de sperme, de choisir une méthode qui donne des spermatozoïdes de haute pureté. Comme illustré sur la figure 1, rinçage rétrograde est utilisé pour récupérer les spermatozoïdes de l&#39;épididyme caudal. Cela implique cannulating le canal déférent avec tube PE qui permet d&#39;appliquer lentement la pression d&#39;air de la seringue attachée. Figure 1A démontre la queue de l&#39;épididyme avec les canaux déférents. Figure 1B est un gros plan de la façon dont le canal déférent est liée où le canule est insérée. Ce faisant, donc, les spermatozoïdes sont libérés à la fin excisé d&#39;un tubule des épididymes caudales. Comme le montre la Figure 2A, les spermatozoïdes sont extraits des régions sommet du Caudun épididyme et sont aspirés vers le haut dans un capillaire en verre dans un état ​​de repos (figure 2B). Cela présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes traditionnelles &quot;swim-up&quot;, et non le moindre, est la possibilité d&#39;effectuer une analyse phoshoproteomic des spermatozoïdes avant et après l&#39;activation de la motilité. Les spermatozoïdes peut alors être expulsé dans les médias de son choix. Figure 2C (côté gauche) montre comment le sperme regarder immédiatement après l&#39;expulsion en BWW médias. La plupart des cellules sont agglutinées. Cependant, après 10 min de la compétence des cellules est démontrée parce qu&#39;ils nagent à l&#39;homogénéité dans la solution (figure 2C, bonnes cellules de côté). Depuis la technique de rinçage a très peu d&#39;impact sur les spermatozoïdes, on obtient près de 100% de la motilité et les cellules se disperser rapidement dans les médias sans provocation externe. Dans une expérience typique de rinçage, le sperme récupéré de la Swiss-souris contiententre 5.1 x 10 6 cellules. Ce est très dépendante de l&#39;âge de l&#39;animal et peut varier de différentes souches de souris. Dans un Rat norvégien, on obtient généralement de 200 x 10 6 spermatozoïdes, ± 20%. La figure 2D représente la pureté de spermatozoïdes obtenu à partir de la queue de l&#39;épididyme du rat. Outre l&#39;échantillon lui-même, l&#39;une des principales questions concernant la préparation de l&#39;échantillon est le rendement de digestion par la trypsine. La précipitation des protéines joue un rôle majeur, non seulement pour éliminer les détergents et les sels indésirables, qui sont tous deux incompatibles avec MS, mais aussi dans la dénaturation des protéines. Nous avons trouvé le méthanol-chloroforme précipitations pour fonctionner au mieux. Non seulement cette procédure été rapporté pour précipiter faibles protéines abondantes mieux que d&#39;autres, y compris précipitation au TCA 19, mais il a des avantages supplémentaires. À la suite de précipitation au TCA, il est souvent nécessaire de réajuster le pH après la suspension de la pastille de TCA qui peut rester tout à faitacide. Bien que le culot précipité de TCA peut être lavé dans des solutions organiques élevées pour éliminer l&#39;acide, ce qui ajoute à la manipulation et reproductibilité des résultats de l&#39;échantillon. Le défaut de neutraliser l&#39;acide se traduira par des rendements pauvres peptidiques tryptiques. Le méthanol-chloroforme précipitation est non seulement rapide, mais ne sera pas acidifier l&#39;échantillon. La figure 3 illustre le culot de protéine habituellement vu de 100 ug d&#39;échantillon entre l&#39;interphase inférieur et supérieur. L&#39;isolement des phosphopeptides peut se produire dans un certain nombre de manières; cependant dépend de la reproductibilité de l&#39;échantillon a été traité jusqu&#39;à et y compris ce stade. Une des méthodes les plus courantes en développement est TiO 2, développé à l&#39;origine par le groupe de Martin Larsen 18,20,21. Bien que décrit comme un processus à utiliser dans microcolonnes, nous pouvons obtenir des données reproductibles en utilisant la chromatographie lot. Le succès du processus est fortement tributaire de la mémoire tampon d&#39;élution, qui doit être folle<html> e avec la composition correcte; autrement phosphopeptides ne sont pas élues à tous. La reproductibilité des données de protocole et représentatives de TiO 2 enrichi phosphopeptides de queue de l&#39;épididyme sperme dans un non-mobiles (Figure 4 en haut) et mobiles (Figure 4 en bas) état ​​de m / z 650 à 670 peut être vu. Nous avons démontré que ce est une technique extrêmement reproductible, même en utilisant 17 répétitions biologique. Les stries bleues apparaissant dans le temps sont des peptides se éluant à partir d&#39;une nano-colonne C18 en tant que la concentration d&#39;acétonitrile augmente. De toute évidence, dans la population mobiles (n = 3 montre, n = 8 de fonctionner normalement), il ya un groupe de peptide, avec une masse monoisotopique autour de la gamme Da 651,5 qui est totalement absent dans la gamme non mobiles. La spectrométrie de masse en tandem est ensuite utilisé pour identifier ce peptide. 546 / 51546fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figure 1:. Canulation de la queue de l&#39;épididyme (A) Image de la queue de l&#39;épididyme. La canule se est enregistrée pour exposer environ 1-2 cm de l&#39;extrémité pré-tiré. Ce est insérée dans le canal déférent à l&#39;aide de fines # 5watchmakers forceps. (B) La canule est maintenu en place en attachant soie fine autour d&#39;un segment contenant à la fois le canal déférent et la canule. De la souris, environ 2 à 3 pi de cellules de l&#39;épididyme caudal et on recueille le fluide à une concentration de 1 x 10 6 / ul. De le rat (illustré), environ 30-40 ul de fluide sont obtenus à des concentrations similaires. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig2highres.jpg" /> Figure 2: capillaire en verre utilisée pour recueillir des spermatozoïdes épididymaires compétente. (A) Un tube à partir du sommet de la queue e<html> pididymis est isolé et cassé. La position approximative à partir de laquelle cela se produit est montré. (B) Le haut de l&#39;image montre un tube capillaire en verre vide et le fond montre une d&#39;un rat préalablement rincé. Il n&#39;y a pas de contamination du sang et des cellules épithéliales contamination minime. (C) Comme les spermatozoïdes sont encore non dilué dans le fluide de l&#39;épididyme, ils ne ont pas commencé à se activer. Lorsque les spermatozoïdes sont initialement expulsé dans une solution de BWW, ils sortent comme une &quot;chaîne&quot; compact (côté gauche). La compétence de la cellule est facilement établie, puisque, après 10 minutes la plupart des spermatozoïdes nagent dans une solution sans aucune perturbation externe (côté droit). (D) Une image d&#39;une aliquote de cellules de l&#39;épididyme caudal immédiatement après qu&#39;ils ont été laissés à la nage montre sur la pureté des cellules. g3highres.jpg &quot;/&gt; Figure 3:. Méthanol-chloroforme précipitation fois que les spermatozoïdes ont été solubilisé, la fraction soluble est précipité méthanol-chloroforme pour assurer la dénaturation des protéines et l&#39;élimination des substances contaminantes. Le culot de protéine apparaît à l&#39;interface entre les phases de méthanol / eau et du chloroforme. La couche supérieure est retirée avec précaution afin de ne pas perturber cette pastille. Il est courant de laisser environ 3.2 mm de la phase supérieure ainsi que la protéine ne est perdue. <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig4highres.jpg" width="600" /> Figure 4:. Typique de TiO 2 enrichi en phosphopeptide de profil selon le protocole décrit, caudale spermatozoïdes épididymaires ont été isolés dans les deux immobiles (top, N = 3) ou mobiles états (en bas, N = 3). Un cluster de peptide avec une masse de mono-isotopique de ~ 651,5 Dun se révèle être présent dans les populations mobiles mais complètement absent dans celles immobiles (flèche). Les comparaisons de cette nature sont appelées &quot;(MS-fondé) sans étiquette&quot;. La masse peptidique et temps de rétention sont ensuite utilisés pour cibler le composé de la spectrométrie de masse en tandem et identifier la protéine à partir de laquelle le peptide a été dérivé.

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Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Phosphopeptide Analyse des rongeurs spermatozoïdes épididymaires

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

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Biology

12.8K vues.  University of Newcastle. Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

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Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primaire Dissocié cultures Mésencéphale dopamine cellulaire du nouveau-né contre les rongeurs

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

La méthode de culture des embryons rongeurs entier en utilisant le système des rotateurs de type flacon de culture

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform surgery on a rodent. Students, post-doctoral scholars, and others interested in performing surgery on rodents as part of a research protocol may not have had formal surgical training as part of their required coursework. Surgery itself is a technical skill, and one that will improve with practice. The principles of aseptic technique, however, often remain unexplained or untaught. For most new surgeons, this vital information is presented in piecemeal fashion or learned on the job, neither of which is ideal. It may also make learning how to perform a particular surgery difficult, as the new surgeon is learning both a surgical technique and the principles of asepsis at the same time. This article summarizes and makes recommendations for basic surgical skills and techniques necessary for successful rodent surgery. This article is designed to supplement hands-on training by the user's institution.

Before attempting surgery, a new surgeon should have training in basic surgical techniques and concepts. This article will present basic surgical considerations with an emphasis on rodents.

Principes de la chirurgie des rongeurs pour le nouveau chirurgien

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

Ex méthode in vivo pour l&#39;imagerie haute résolution de la motilité Cilia dans Rongeur épithélium des voies respiratoires

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Rongeurs transgéniques test pour quantifier Homme cellules germinales Mutant Fréquence

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Rongeur de travail Modèle de coeur pour l&#39;étude de la performance myocardique et la consommation d&#39;oxygène

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocole de laboratoire pour les Analyses de contenu Gut génétiques de macroinvertébrés aquatiques Using Group-specific ADNr amorces

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

Préparation des cellules progénitrices adipeuses à partir de tissus adipeux épididymaux de souris

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Viral Transgene Expression in Rodent Hearts and the Assessment of Cardiac Arrhythmia Risk

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents have become essential models for cardiovascular research. However, spontaneous lethal cardiac arrhythmias that often cause mortality in heart disease patients are rare in rodent models of heart disease. This is primarily due to the species differences in cardiac electrical properties between human&#160;and rodents and poses a challenge to the study of cardiac arrhythmias using rodents. This protocol describes an approach to enable efficient transgene expression in mouse and rat ventricular myocardium using echocardiography-guided intramuscular injections of recombinant virus (adenovirus and adeno-associated virus). This work also outlines a method to enable reliable assessment of cardiac susceptibility to arrhythmias using isolated, Langendorff-perfused mouse and rat hearts with both adrenergic and programmed electrical stimulations. These techniques are critical for studying heart rhythm disorders associated with adverse cardiac remodeling after injuries, such as myocardial infarction.

The present protocol describes methods for transgene expression in rat and mouse hearts by direct intramyocardial injection of the virus under echocardiography guidance. Methods for the assessment of the susceptibility of hearts to ventricular arrhythmias by the programmed electrical stimulation of isolated, Langendorff-perfused hearts are also explained here.

Expression de transgènes viraux dans les cœurs de rongeurs et évaluation du risque d’arythmie cardiaque

Heart disease is the leading cause of morbidity and mortality worldwide. Due to the ease of handling&#160;and abundance of transgenic strains, rodents ...