Nous remercions Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann et Walker Jackson pour la lecture attentive du manuscrit. Les auteurs ont reçu des fonds qui ont été fournis par le ministère de la recherche MIWF de l&#39;état Rhénanie du Nord-Westphalie (SR), le BMBF-Projekträger DLR collaboration américano-allemand en neurosciences computationnelles (CRCNS; SR), des centres d&#39;excellence dans les maladies neurodégénératives (COEN; SR), et l&#39;Université du programme de financement intra-muros Bonn (BONFOR; SR).

1. Configuration requise <ol><li> Système de microscope: Bonne visualisation de la Dendrite est crucial. Si possible, utilisez un système de microscope à balayage laser à deux photons. Dans nos expériences, nous avons utilisé une portée TRIM II, LaVision Biotec, Bielefeld, en Allemagne ou un système Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin équipé d&#39;un Ti: saphir laser ultrarapide pulsé (Chameleon Ultra II, Coherent) et un objectif élevé NA (60X, 0,9 NA, Olympus) pour visualiser les dendrites que nous avions remplis avec un colorant fluorescent via la pipette de patch. Bien que photo-dommages est pensé pour être moins sévère en utilisant un balayage à 2 photons, de réduire la puissance du laser (en dessous de 8 mW au niveau du tissu) et temps de séjour (moins de 1 ps) ou autant que possible. </li><li> Une deuxième possibilité consiste à déclencher une source de lumière de fluorescence à champ large (LED ou une lampe à fluorescence) en synchronisme avec l&#39;acquisition afin de réduire le temps d&#39;exposition le plus possible. Nous avons utilisé un monochromateur avec une source de lumière intégrée (TILLPhotoniques, Grafelfing, Allemagne) sur un Zeiss Axioskop 2 FS microscope droit qui était équipé d&#39;un éclairage infrarouge Dodt contraste (TILLPhotonics, Gräfelfing, Allemagne). Dans nos expériences, les temps d&#39;exposition variaient de généralement 10 ms max. 30 msec. </li><li> Utilisation d&#39;un amplificateur micro-iontophorèse rapide, par exemple un système de micro-iontophorèse à deux canaux MVCS-C-02 (npi électronique, Tamm, Allemagne) avec compensation de capacité rapide. Les microélectrodes d&#39;iontophorèse à pointe fine ont des résistances de 25 à 100 MQ (en fonction essentiellement de la taille de la pointe et la forme pipette), et des temps de montée rapides ne peuvent être atteints que si la compensation de capacité de l&#39;amplificateur iontophorèse est réglé de manière optimale. Cette compensation rapide est nécessaire d&#39;appliquer des impulsions de courant avec une brève apparition rapide et dans la plage inférieure à la milliseconde à la pipette par iontophorèse et ainsi éjecter le transmetteur à haute résolution spatiale en tailles de spot inférieure à 1 um 13. des amplificateurs de ionophorèse sont aldonc disponible à partir de plusieurs autres entreprises, que nous n&#39;avons pas testé dans notre laboratoire. Ces dispositifs sont à notre connaissance pas équipé d&#39;un circuit de compensation de capacité. </li></ol> 2. Préparer des solutions <ol><li> Préparer liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) et une solution interne car il est nécessaire pour la conception expérimentale. La seule addition à la solution interne, qui est nécessaire, est un colorant fluorescent rouge ou verte (par exemple 50 à 200 uM Alexa Fluor 488 ou 594 hydrazide, Invitrogen), en fonction de l&#39;équipement optique. Voici un exemple pour ACSF saccharose qui peut être utilisée pour la dissection, en mM: NaCl 60, ​​100 saccharose, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, NaHCO3 26, CaCl2 1, MgCl2 5, 20 glucose, et pour ACSF normale solution pour les expériences de patch-clamp en mm: 125 NaCl, KCl 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 2,6 CaCl2, 1,3 MgCl2, 15 glucose. </li><li>Carbogenize (95% O 2, 5% de CO 2) toutes les solutions extracellulaires constamment. </li><li> Préparer une solution interne, par exemple, en mm: 140 K-gluconate, 7 KCl, 5 HEPES-acide, 0,5 MgCl2, 5 Phosphocréatine, 0,16 EGTA, avec 50 à 200 uM Alexa 488. </li><li> Pour glutamate micro-iontophorèse préparer une solution avec de l&#39;acide glutamique 150 mM et ajuster le pH à 7,0 avec du NaOH. Ajouter 50 -200 iM Alexa Fluor 488 ou 594 hydrazide (Invitrogen) pour la visualisation. </li><li> Pour ionophorèse du GABA préparer une solution 1 M de GABA et ajuster le pH à 5 avec HCl 15. A ce pH, le GABA est chargé, alors seulement il peut être appliqué à l&#39;aide iontophorèse. S&#39;il vous plaît noter que le faible pH dans la solution éjectée dans l&#39;espace extracellulaire pourraient effectuer transmission GABA lui-même 16,17. Protéger la solution GABA de la lumière et de préparer fréquemment solution de GABA frais, puisque solution âgée peut perdre de son efficacité. </li><li> S&#39;il est difficile de voir les événements GABAergiques, une chaîne high Cl - solution interne force motrice, par exemple en précisant KCl, pourraient aider à visualiser les événements GABAergiques pour voir si l&#39;iontophorèse GABA travaille, mais pour étudier l&#39;intégration synaptique une force motrice physiologique pourrait être recommandé. Pour la détection générale de petits événements GABAergiques, un protocole illustré à la figure 8C peut aider. </li></ol> 3. Tirez et tester les Pipettes d&#39;ionophorèse <ol><li> En général, tirant les bonnes pipettes est peut-être l&#39;étape la plus critique pour atteindre iontophorèse, un neurotransmetteur contrôlée. Lors de l&#39;utilisation iontophorèse en culture cellulaire, il est possible de tirer de très fines électrodes similaires à microélectrodes tranchants 10. Dans les expériences de patch-clamp en tranches aiguës, cependant, ces pipettes très minces virage sur la surface de la tranche quand ils sont descendus dans le tissu avec un angle, ce qui rend impossible d&#39;atteindre dendrites profondes. </li><li> Par conséquent, tirer une pipette avec une très petite pointe, afin que personne neurotransmitter peut s&#39;échapper, mais la pointe doit être encore suffisamment rigide pour pénétrer dans le tissu (figure 2). Par exemple, utiliser 150 Go F 8P des pipettes de classe (Produits Science, Hofheim, Allemagne) et un extracteur horizontal (par exemple un extracteur DMZ-Universal, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Allemagne; ou un P-97 Extracteur, Instrument Company Sutter , Novato, CA) avec plusieurs étapes de traction pour atteindre une petite ouverture, mais aussi un court tapper avec un angle de pente (figure 2 et tableau 2). </li><li> Il est également possible d&#39;utiliser des pipettes en verre de quartz de tirer pipettes iontophorétiques 10. Ceux-ci sont censés avoir de meilleures propriétés mécaniques et d&#39;être plus fiable, mais extracteurs laser spéciaux sont nécessaires. Mais il est également possible d&#39;obtenir de bons résultats avec des pipettes en verre normales, qui sont habituellement utilisés pour tirer des pipettes de patch. </li><li> Testez les performances de la pipette et la résistance dans une chambre sans tissu, avant de les utiliser pour la premièretemps, depuis la fuite de glutamate pourrait nuire au tissu. </li><li> Mettre en place l&#39;amplificateur d&#39;iontophorèse correctement. Puis remplir la pipette avec le neurotransmetteur et la solution contenant le colorant et placez-le dans le bain (ACSF). </li><li> Compenser la capacitance (Figure 3). Habituellement pipettes très forte auront une capacité plus élevée que celles émoussés. </li><li> Vérifier la résistance de la pipette: L&#39;amplificateur micro-iontophorèse utilisé ici a une accumulation dans le dispositif pour mesurer la résistance de la pipette. Il évoque brèves impulsions de test rectangulaires, qui peuvent être contrôlés avec un oscilloscope standard ou une carte A / D relié à un ordinateur avec un logiciel d&#39;acquisition. Selon la forme et la taille de la pointe, la pointe doit avoir une résistance entre 25 à 90 MQ. </li><li> Focus sur la pointe avec un objectif à immersion dans l&#39;eau 60X ou 40X et passer à l&#39;imagerie de fluorescence et, si possible, agrandir En cas de fuite de colorant fluorescent sur la pointe de la pipette, appliquer une petite positive (dans le cas de glutamate) ou négative (dans le cas de GABA, figure 4) conservent courant (&lt;0,02 mA). Si cela n&#39;aide pas à annuler la fuite, changer la pipette. </li><li> Appliquer un courant d&#39;étape fort ou utiliser le déclencheur manuel et surveiller la pointe dans l&#39;image fluorescente pour voir si la solution ne peut être éjecté hors de la pipette. Comme mentionné ci-dessus, le groupe de l&#39;impulsion de courant est fonction de la charge de la molécule qui est censé être éjecté. Pour éjecter glutamate est un courant négatif et pour GABA A de courant positif (figure 4). </li><li> Les bulles d&#39;air dans la pipette que l&#39;éjection du bloc de colorant et d&#39;un émetteur, peuvent être corrigées en appliquant une forte éjection à plusieurs reprises en cours. </li><li> Pris dans leur ensemble, s&#39;il n&#39;y a pas de fuite visible et l&#39;éjection de test a réussi, à compenser la capacitance et commencer l&#39;expérience. </li><li> Attention: Depuis compensation de capacité est obtenue par un circuit de rétroaction, ce circuit peut osciller dépassement ou si elle est overcompensated. Utiliser doucement le réglage de la molette de compensation de capacité. </li><li> Selon la stabilité de l&#39;extracteur, il est parfois nécessaire d&#39;ajuster les paramètres de l&#39;extracteur de temps en temps, depuis le filament peut avoir changé propriétés. Cependant, si une fois une bonne pipette est conçu, il peut être utilisé pour plusieurs jours. Par conséquent, après la fin de l&#39;expérience stocker la pipette par ionophorèse dans un récipient fermé, sans endommager la pointe. </li><li> Pour l&#39;expérience suivante remplir la pipette avec la solution de neurotransmetteur, appliquer plusieurs impulsions d&#39;éjection fort pour dégager l&#39;extrémité, puis vérifier si les propriétés (résistance) changer de façon significative. Puis compenser la capacitance et utiliser la pipette à nouveau. Ne pas utiliser une pipette unique avec différentes solutions de neurotransmetteurs. </li></ol> 4. Préparer les tranches de cerveau <ol><li> Si la micro-iontophorèse est utilisé pour la première fois définitivement préparer des tranches après l&#39;établissement d&#39;un programme de marche de l&#39;extracteur de façon fiable. </li> &lt;procédures li&gt; Perform anesthésie et la décapitation, conformément aux lignes directrices de soins aux animaux de votre institution ou une autorité locale. </li><li> Après l&#39;enlèvement du cerveau, la transférer à froid de la glace saccharose ACSF (voir protocole 2.1). </li><li> Couper la région d&#39;intérêt en tranches d&#39;épaisseur appropriée (par exemple 300 um). </li><li> Incuber les tranches dans ACSF saccharose à 35 ° C pendant 30 min. Par la suite, les transférer sur une chambre de retenue immergée contenant ACSF normal à température ambiante. </li><li> Tout au long de la préparation et de l&#39;expérience carbogenize l&#39;ACSF entourant les tranches avec 95% d&#39;O 2, 5% de CO 2. </li></ol> 5. Établir un enregistrement cellules entières <ol><li> Positionner la pipette d&#39;iontophorèse (s) déjà proche de la surface de la tranche avant de colmatage d&#39;une cellule, afin d&#39;éviter un positionnement durable, après l&#39;établissement du mode de cellule entière. </li><li> Tirer une faible résistance pipette de patch (3-5 mQ), remplissez-le avec la dye contenant une solution interne et appliquer une pression positive à la pipette (30 - 60 mbar). </li><li> Entrez le bain et l&#39;approche de la cellule sous guidage visuel (contraste de Dodt infrarouge ou deux image en contraste de gradient photon). </li><li> Surveiller la résistance de la pipette avec une impulsion d&#39;essai (par exemple -10 mV, 20 ms) en mode de blocage de tension. En touchant le tissu corriger le potentiel de décalage. </li><li> Approche de la cellule et appuyez doucement sur la pointe de la pipette en elle jusqu&#39;à ce qu&#39;un «fossette» peut être vu clairement. Libérer immédiatement la pression de la pipette, appliquer 40 - 60 mbar de pression négative et commuter le potentiel de membrane de -65 mV. </li><li> Lorsque le courant de maintien atteint des valeurs inférieures à 100 pA, relâchez la pression négative. </li><li> Après avoir établi une joint giga (résistance&gt; 1 VA), la rupture de la membrane avec une courte, forte aspiration à la pipette ou une brève surcompensation du circuit de compensation de capacité. </li><li> Selon le mode (pince de tension ou de courant) est nécessairepour la conception expérimentale, de compenser de manière appropriée. </li><li> Commencer à mettre la pipette iontophorèse dans sa position finale. Si une description plus détaillée de la façon de réaliser avec succès des enregistrements de patch-clamp est nécessaire, il ya plusieurs excellentes lignes directrices disponibles 18,19. </li></ol> 6. Placez la pipette Iontophoretic et de générer un potentiel Iontophoretic Postsynaptic <ol><li> En général, les événements iontophorétiques peuvent être invoquées à des endroits définis en fonction de l&#39;expérience souhaitée, par exemple, à une dendrite épineux pour le glutamate micro-iontophorèse, à l&#39;arbre dendritique, soma ou axone segment initial de GABA micro-iontophorèse. </li><li> Approche de la cellule jusqu&#39;à environ la distance de 1 um sans le toucher. Après avoir atteint la position d&#39;intérêt, il est essentiel qu&#39;aucun neurotransmetteur est fuit et que la capacité pipette est compensée correctement. </li><li> Si s&#39;approchant de la cellule par un glutamate rempli pipett iontophorétiquee provoque une dépolarisation détectée du potentiel de membrane, d&#39;ajuster le courant conserver si possible, ou changer la pipette. </li><li> Appliquer courtes impulsions de courant négatives, à partir de zéro et augmenter le courant systématiquement (par exemple de 0,1 à 0,4 ms, de 0,01 à 1 uA impulsions). Cela permet de savoir dans quelle plage du courant d&#39;iontophorèse évoque les réponses souhaitées dans le groupe expérimental spécifique mis en place. </li><li> S&#39;il n&#39;ya pas de réponse détectable, soulevez la pipette plusieurs centaines de micromètres et d&#39;appliquer un fort courant d&#39;éjection (&gt; 0,1 mA) pour nettoyer l&#39;embout. Réglez la compensation de capacité, l&#39;approche de la cellule, et essayez à nouveau. </li><li> S&#39;il n&#39;y a toujours pas de réponse, réduire le courant conserver. Soyez très prudent avec les paramètres de numérotation car cette procédure peut entraîner la libération de neurotransmetteurs incontrôlée. Par conséquent, constamment surveiller l&#39;enregistrement de détecter les changements respectifs dans le potentiel de membrane. </li><li> S&#39;il est difficile de détecter des événements GABAergiques, il peut être utile d&#39;utiliser unen composition de la solution interne qui donne une grande Cl - force motrice. Pour atteindre cet objectif, réduire la concentration de Cl - dans la solution pipette (voir section 2.6 du protocole.). Cela se traduira par des événements GABAergiques plus au potentiel de membrane au repos en raison d&#39;une force d&#39;entraînement supérieur. </li><li> Sinon, injecter étapes longues actuels résultent en membrane chances potentielles de -100 mV à -48 mV (figure 8C). Avec ce protocole, le Cl - force motrice est augmentée à des potentiels hyperpolarisés provoquant une réponse GABA dépolarisants. </li><li> Il est également possible d&#39;utiliser le protocole d&#39;injection de courant étapes pour déterminer le potentiel d&#39;inversion des événements évoqués, ce qui permet de déterminer la nature GABAergique des événements. Fuite de GABA est plus difficile à détecter que la fuite de glutamate. Dans ce cas, une surveillance constante de la résistance d&#39;entrée peut aider, quand la pipette remplie GABA est abordée. Si la résistance d&#39;entrée diminue, le courant ne peut retenir be augmentée ou une pipette différent devrait être utilisé. </li><li> Comme les expériences de contrôle pour ionophorèse glutamate, nous vous proposons un 2 + expérience d&#39;imagerie Ca, en utilisant 200 uM OGB-1 et n ° EGTA dans la solution de la pipette pour visualiser l&#39;afflux de calcium locales qui pourraient être causés par des fuites de glutamate. </li><li> En général, pour obtenir une réponse stable, il est très important d&#39;avoir une pipette mécaniquement stable pour éviter toute dérive dans le temps. La dérive peut être causée par des changements de température, il est donc recommandé d&#39;allumer l&#39;appareil au moins une demi-heure avant les mesures pour éviter la dérive thermique. Assurez-vous d&#39;utiliser les bonnes joints de la cartouche dans le porte-pipette et la pointe est vraiment fixé. Le titulaire lui-même peut en outre être fixé avec du ruban téflon, en outre, être sûr qu&#39;il n&#39;y a pas de tension sur les câbles de la headstage ou manipulateur, qui est aussi une source potentielle de dérive. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+induces+de+novo+growth+of+functional+spines+in+developing+cortex.">Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex.</a> Nature. 474, 100-104 (2011).</li><li>Fino, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-Photon+and+Visible-Light+Photoactivation+of+Neurons+and+Dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines.</a> Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous expliquons ici comment appliquer rapidement des micro-iontophorèse de neurotransmetteurs pour enquêter sur l&#39;intégration synaptique sur dendrites. Cette technique a été utilisée avec succès pour étudier la transmission synaptique glutamatergique et GABAergique dans différentes régions du cerveau in vitro et in vivo 9,20-22. Micro-iontophorèse a été utilisé pendant plus de 60 ans, mais dans les premières années, il a été principalement utilisé pour appliquer localement neur...

Neurones dans le système nerveux central reçoivent une variété d&#39;entrées synaptiques sur leurs processus dendritiques fines et ramifiées 1. Là-bas, la majorité des entrées dendritiques excitateurs sont médiés par des synapses glutamatergiques. Ces synapses peuvent être activés de façon répartie dans l&#39;espace, ce qui entraîne l&#39;intégration linéaire post-synaptique des potentiels post-synaptiques excitateurs (EPSP). Si les synapses sont activées simultanément et à proximité spatiale sur la dendrites, ces entrées excitatrices peuvent être intégrés supra-linéaire et génèrent des pointes dendritique 2-5. De plus, l&#39;intégration des entrées excitatrices dépend de l&#39;emplacement de l&#39;entrée sur l&#39;arbre dendritique. Signaux qui arrivent à la région de la touffe distale sont beaucoup plus atténué que les intrants proximales en raison de câble filtrage 6. Dans l&#39;hippocampe, des entrées vers les dendrites éloignés de touffes apicales sont générés par une région du cerveau différentes de celles sur dendri proximaleTES 7. Une question intéressante est donc de savoir comment entrée synaptique est traitée par différents compartiments dendritiques et si l&#39;intégration dendritique réglemente l&#39;influence de ces entrées en couches sur la décharge neuronale de différentes manières. Non seulement les propriétés fonctionnelles, les caractéristiques morphologiques de la Dendrite, le lieu et le regroupement des entrées affectent l&#39;intégration dendritique d&#39;entrées excitateurs, aussi les entrées inhibitrices supplémentaires à partir de terminaux GABAergiques un facteur déterminant pour l&#39;efficacité des synapses glutamatergiques 8,9. Ces différents aspects de l&#39;intégration synaptique peuvent être idéalement étudiés en utilisant neurotransmetteur micro-iontophorèse, ce qui permet une application définie dans l&#39;espace des différents neurotransmetteurs à des domaines dendritiques. Nous montrons ici comment mettre en place avec succès des micro-iontophorèse de glutamate et de GABA pour enquêter sur l&#39;intégration du signal dans les neurones. Pour cette application, à pointe finepipettes à haute résistance remplis de solutions de neurotransmetteurs concentrés sont utilisés. Ces pipettes sont positionnés à proximité de la membrane externe de la cellule, où les récepteurs de neurotransmetteurs sont situés. Une bonne visualisation des branches dendritiques est nécessaire. Le mieux est réalisé en utilisant des colorants fluorescents qui sont introduits via la pipette de patch. Ensuite, une très courte (&lt;1 ms) d&#39;impulsions de courant (dans la plage de 10 à 100 nA) est utilisé pour éjecter les molécules de neurotransmetteurs chargées. Avec ces courtes impulsions et de la rémunération de la capacité effective, potentiels ou courants post-synaptiques peuvent être évoqués avec précision temporelle et spatiale, ce qui signifie que l&#39;emplacement de l&#39;entrée excitatrice est connue avec précision. Glutamate micro-iontophorèse peut activer synapses dans un rayon défini, ce qui est inférieur à 6 um comme indiqué ici (Figure 1 9), mais il est également possible de parvenir à la résolution de la synapse unique 10-12. Heine, M., et al </em&gt; a montré que la résolution spatiale rapide micro-iontophorèse peut même être ajusté à repérer tailles inférieures à 0,5 um, ce qui est plus petite que la taille des spots régulièrement obtenus avec uncaging deux photons de glutamate 13. Avec rapide micro-iontophorèse, il est facilement possible d&#39;utiliser deux ou plusieurs pipettes iontophorétiques et les placer à des endroits différents, même éloignés sur l&#39;arbre dendritique. De cette manière, l&#39;intégration des événements excitants, y compris ceux provenant de différentes voies, peut être étudiée. Il est également possible d&#39;utiliser un glutamate et une pipette remplie par iontophorèse GABA dans le même temps. De cette façon, l&#39;effet de l&#39;inhibition GABAergique à différents emplacements par rapport à l&#39;entrée d&#39;excitation (en chemin, hors sentier inhibition) peut être étudiée. En outre, l&#39;impact de l&#39;inhibition par les interneurones ciblant les domaines neuronales spécifiques, comme dendrites distales, soma ou axones 14, peut être étudiée en utilisant l&#39;iontophorèse GABA. Dans les neurones en culture, rapide micro-iontophorèse offre la possibilité d&#39;investigate distribution de synapse unique et les aspects élémentaires de la communication synaptique dans les neurones dans beaucoup plus de détails 10,11. Dans cet article, nous montrons en détail comment établir iontophorèse glutamate et de GABA pour l&#39;utilisation dans des tranches de cerveau aigus, ce qui permet d&#39;instruction intégration synaptique des entrées excitateurs et inhibiteurs en fonction de l&#39;emplacement d&#39;entrée, les forces d&#39;entrée, et le moment, seul ou en interaction. Nous allons souligner les avantages et les limites de cette technique et comment résoudre avec succès.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin)</td>
			<td>LaVision Biotec, Bielefeld, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon laser scanning microscope Ultima IV</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Coherent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X Objective, NA 0.9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope</td>
			<td>TILLPhotonics, Gr&auml;felfing, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>TILLPhotonics, Gr&auml;felfing, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-iontophoresis system MVCS-02</td>
			<td>NPI Electronics, Tamm, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter puller P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Company, Novato, CA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments (150 GB F 8P)</td>
			<td>Science Products, Hofheim, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 hydrazide</td>
			<td>Molecular Probes life technologies</td>
			<td>A-10436</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Molecular Probes life technologies</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5835</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09137.1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09108.1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast micro-iontophoresis of glutamate and gaba: a useful tool to investigate synaptic integration

L&#39;un des intérêts fondamentaux en neurosciences est de comprendre l&#39;intégration d&#39;entrées excitateurs et inhibiteurs long de la structure très complexe de l&#39;arbre dendritique, ce qui conduit finalement à la sortie neuronale de potentiels d&#39;action à l&#39;axone. L&#39;influence de divers paramètres spatiaux et temporels de l&#39;entrée synaptique spécifique sur la production neuronale est actuellement à l&#39;étude, par exemple, l&#39;atténuation dépendante de la distance d&#39;entrées dendritiques, l&#39;interaction dépendant de la localisation des entrées spatialement distincts, l&#39;influence de l&#39;inhibition GABAergig sur l&#39;intégration d&#39;excitation, linéaire et modes d&#39;intégration non-linéaires, et beaucoup plus. Avec rapide micro-iontophorèse de glutamate et le GABA, il est possible d&#39;étudier précisément l&#39;intégration spatiale et temporelle de l&#39;excitation et l&#39;inhibition GABAergique glutamatergique. Exigences techniques critiques sont soit une lampe fluorescente déclenché, la diode électroluminescente (LED), ou une à deux photons scanning microscope pour visualiser branches dendritiques sans introduire significative photo-dommages des tissus. En outre, il est très important d&#39;avoir un amplificateur micro-iontophorèse qui permet de compensation de capacité rapide de pipettes à haute résistance. Un autre point crucial est que aucun émetteur est involontairement libéré par la pipette pendant l&#39;expérience. Une fois établie, cette technique va donner des signaux fiables et reproductibles avec une grande neurotransmetteur et l&#39;emplacement spécificité. Par rapport au glutamate et le GABA uncaging, ionophorèse rapide permet d&#39;utiliser deux émetteurs en même temps, mais à des endroits très éloignés sans limitation dans le champ de vue. Il ya aussi des avantages par rapport à une stimulation électrique des axones focale: avec micro-iontophorèse l&#39;emplacement du site d&#39;entrée est définitivement connus et il est sûr que seul le neurotransmetteur d&#39;intérêt est publié. Cependant, il doit être considéré que la micro-iontophorèse seulement l&#39;postsynapse est activé et aspects présynaptique de la libération de neurotransmetteurs ne sont pas résolus. Dans cet article, nous montrons comment mettre en place des micro-iontophorèse dans des expériences de tranches de cerveau.

Une approche simple pour déterminer la propagation spatiale de l&#39;iontophorèse est de retirer la pipette iontophorèse par étapes à partir de la dendrite, tout en maintenant constant le glutamate éjecté. Nous avons constaté que l&#39;étendue spatiale d&#39;une stimulation micro-iontophorèse avait un diamètre d&#39;environ 12 um (figure 1 montrant rayon). Quelle profondeur dans le tissu de la ionophorèse peut être utilisé dépend de la rigidité de la pipette. Cependant, les pipettes iont...

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Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Dans cet article, nous introduisons rapide micro-iontophorèse de neurotransmetteurs comme une technique pour étudier l&#39;intégration des signaux post-synaptiques avec une grande précision spatiale et temporelle.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

fast-micro-iontophoresis-glutamate-gaba-useful-tool-to-investigate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.4K vues.  University of Bonn. Dans cet article, nous introduisons rapide micro-iontophorèse de neurotransmetteurs comme une technique pour étudier l'intégration des signaux post-synaptiques avec une grande précision spatiale et temporelle.

Vidéo: Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

Coupez-chargement: Un outil utile pour examiner l&#39;étendue du couplage Tracer Gap jonction entre neurones rétiniens

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Recherche

Neurosciences

MPI CyberMotion Simulator: Implementation of a Novel Motion Simulator to Investigate Multisensory Path Integration in Three Dimensions

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. Humans can do path integration based exclusively on visual 2-3, auditory 4, or inertial cues 5. However, with multiple cues present, inertial cues - particularly kinaesthetic - seem to dominate 6-7. In the absence of vision, humans tend to overestimate short distances (&lt;5 m) and turning angles (&lt;30&deg;), but underestimate longer ones 5. Movement through physical space therefore does not seem to be accurately represented by the brain.
Extensive work has been done on evaluating path integration in the horizontal plane, but little is known about vertical movement (see 3 for virtual movement from vision alone). One reason for this is that traditional motion simulators have a small range of motion restricted mainly to the horizontal plane. Here we take advantage of a motion simulator 8-9 with a large range of motion to assess whether path integration is similar between horizontal and vertical planes. The relative contributions of inertial and visual cues for path navigation were also assessed.
16 observers sat upright in a seat mounted to the flange of a modified KUKA anthropomorphic robot arm. Sensory information was manipulated by providing visual (optic flow, limited lifetime star field), vestibular-kinaesthetic (passive self motion with eyes closed), or visual and vestibular-kinaesthetic motion cues. Movement trajectories in the horizontal, sagittal and frontal planes consisted of two segment lengths (1st: 0.4 m, 2nd: 1 m; &plusmn;0.24 m/s2 peak acceleration). The angle of the two segments was either 45&deg; or 90&deg;. Observers pointed back to their origin by moving an arrow that was superimposed on an avatar presented on the screen.
Observers were more likely to underestimate angle size for movement in the horizontal plane compared to the vertical planes. In the frontal plane observers were more likely to overestimate angle size while there was no such bias in the sagittal plane. Finally, observers responded slower when answering based on vestibular-kinaesthetic information alone. Human path integration based on vestibular-kinaesthetic information alone thus takes longer than when visual information is present. That pointing is consistent with underestimating and overestimating the angle one has moved through in the horizontal and vertical planes respectively, suggests that the neural representation of self-motion through space is non-symmetrical which may relate to the fact that humans experience movement mostly within the horizontal plane.

An efficient way to gain insight into how humans navigate themselves in three dimensions is described. The method takes advantage of a motion simulator capable of moving observers in ways unattainable by traditional simulators. Results confirm that movement in the horizontal plane is underestimated, while vertical movement is overestimated.

MPI CyberMotion Simulator: la mise en œuvre d&#39;un simulateur de mouvement Novel pour étudier l&#39;intégration multisensorielle chemin en trois dimensions

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Quantification automatisée de la fluorescence dans Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Issu l&#39;évolution temporelle du glutamate Dégagement avec une analyse de déconvolution des courants de Transporteur ASTROCYTIQUES

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell surface mobility1-7. To study receptor cell surface localization and endocytosis, the technique described here combines the use of fluorescent &#945;-bungarotoxin with cells expressing constructs containing an &#945;-bungarotoxin (Bgt) binding site (BBS). The BBS (WRYYESSLEPYPD) is based on the &#945; subunit of the muscle nicotinic acetylcholine receptor, which binds Bgt with high affinity8,9. Incorporation of the BBS site allows surface localization and measurements of receptor insertion or removal with application of exogenous fluorescent Bgt, as previously described in the tracking of GABAA and metabotropic GABAB receptors2,10. In addition to the BBS site, we inserted a pH-sensitive GFP (pHGFP11) between amino acids 4 and 5 of the mature GABAAR subunit by standard molecular biology and PCR cloning strategies (see Figure 1)12. The BBS is 3&#39; of the pH-sensitive GFP reporter, separated by a 13-amino acid alanine/proline linker. For trafficking studies described in this publication that are based on fixed samples, the pHGFP serves as a reporter of total tagged GABAAR subunit protein levels, allowing normalization of the Bgt labeled receptor population to total receptor population. This minimizes cell to cell Bgt staining signal variability resulting from higher or lower baseline expression of the tagged GABAAR subunits. Furthermore the pHGFP tag enables easy identification of construct expressing cells for live or fixed imaging experiments.

Using an &amp;#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Here we demonstrate the use of fluorescent Alexa dye coupled to &#945;-bungarotoxin to measure GABA A receptor surface localization and endocytosis in hippocampal neurons. Through the use of constructs bearing a short extracellular tag that binds &#945;-bungarotoxin, analysis of plasma membrane protein endocytic trafficking can be achieved.

L&#39;utilisation d&#39;un α-bungarotoxine Reliure Tag du site à étudier récepteur GABA A membrane localisation et le trafic

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In particular, endogenously-generated network activity, which strongly varies as a function of the state of vigilance, significantly modulates neuronal computation. To investigate how different spontaneous cerebral dynamics impact single neurons&#39; integrative properties, we developed a new experimental strategy in the rat consisting in suppressing in vivo all cerebral activity by means of a systemic injection of a high dose of sodium pentobarbital. Cortical activities, continuously monitored by combined electrocorticogram (ECoG) and intracellular recordings are progressively slowed down, leading to a steady isoelectric profile. This extreme brain state, putting the rat into a deep comatose, was carefully monitored by measuring the physiological constants of the animal throughout the experiments. Intracellular recordings allowed us to characterize and compare the integrative properties of the same neuron embedded into physiologically relevant cortical dynamics, such as those encountered in the sleep-wake cycle, and when the brain was fully silent.

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

This procedure performs long-lasting in vivo intracellular recordings from single neurons during physiologically relevant cerebral states and after complete abolition of ongoing electrical activities, resulting in an isoelectric brain state. The physiological constants of the animal are carefully monitored during the transition to the artificial comatose condition.

Induction d&#39;un Etat isoélectrique cerveau chargé d&#39;enquêter sur l&#39;impact de l&#39;activité sur Endogène Synaptic Neuronal excitabilité<em&gt; In Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, and anxiety. Traditionally, microdialysis has been the most common (lauded) technique to examine neurotransmitter changes that occur in these disorders. But because microdialysis has the ability to measure slow 1-20 minute changes across large areas of tissue, it has the disadvantage of invasiveness, potentially destroying intrinsic connections within the brain and a slow sampling capability. A relatively newer technique, the microelectrode array (MEA), has numerous advantages for measuring specific neurotransmitter changes within discrete brain regions as they occur, making for a spatially and temporally precise approach. In addition, using MEAs is minimally invasive, allowing for measurement of neurotransmitter alterations in vivo. In our laboratory, we have been specifically interested in changes in the neurotransmitter, glutamate, related to Alzheimer's disease pathology. As such, the method described here has been used to assess potential hippocampal disruptions in glutamate in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Briefly, the method used involves coating a multi-site microelectrode with an enzyme very selective for the neurotransmitter of interest and using self-referencing sites to subtract out background noise and interferents. After plating and calibration, the MEA can be constructed with a micropipette and lowered into the brain region of interest using a stereotaxic device. Here, the method described involves anesthetizing rTg(TauP301L)4510 mice and using a stereotaxic device to precisely target sub-regions (DG, CA1, and CA3) of the hippocampus.

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer&#039;s Mouse Models

Here, we describe the setup, software navigation, and data analysis for a spatially and temporally precise method of measuring tonic and phasic extracellular glutamate changes in vivo using enzyme-linked microelectrode arrays (MEA).

En utilisant biocapteurs à base d&#39;enzymes pour mesurer Tonic et Phasic Glutamate dans les modèles murins d&#39;Alzheimer

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Culture In Vivo-comme les Astrocytes Murine en utilisant le protocole AWESAM rapide, Simple et peu coûteux

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Alliant Optogenetics artificiel microARN pour caractériser les effets du gène Knockdown fonction présynaptique dans les Circuits de neurones intacts

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

Un dosage de haut-débit-flux de Calcium pour l’étude des récepteurs NMDA avec sensibilité à la Glycine/D-sérine et Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...