Cette étude a été financée par une subvention de la Fondation allemande pour la science (DFG, Ro2327 / 6-1) à CRR Les auteurs tiennent à remercier S. Durry et C. Rodrigue pour l&#39;assistance technique d&#39;experts, et M. Dubbert (Laboratoire d&#39;Electronique, Institut de zoologie , Université de Cologne, Allemagne) pour l&#39;aider à mettre en œuvre le contrôleur de cellule de Pockels et le commutateur HF.

<ol>
	<li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+Na++imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons.">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li><li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+Na++signals+in+spines+and+dendrites.">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li><li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+new+fluorescent+Na++indicator+CoroNa+Green:+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na++imaging.">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li><li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes.">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li><li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li><li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission.">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li><li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mismatch+between+the+Na++flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment.">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li><li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na++imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na++influx+between+axon+and+soma.">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li><li>Denk, W., Piston, D., Webb, W., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 445-458 (1995).</li><li>Jaffe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds+in+the+cilia+of+olfactory+sensory+neurons.">Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation.">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices.">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Ca(2+)+and+Na(+)+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation.">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li><li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K+pump+current+and+[Na](i)+in+rabbit+ventricular+myocytes:+Local+[Na](i)+depletion+and+Na+buffering.">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li><li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells.">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li><li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mobility+in+muscle+cells.">Ionic mobility in muscle cells.</a> Science. 166, 1297-1298 (1969).</li><li>Palma-Cerda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+caged+neurotransmitter+analogs+selective+for+glutamate+receptor+sub-types+based+on+methoxynitroindoline+and+nitrophenylethoxycarbonyl+caging+groups.">New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups.</a> Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).</li><li>Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405+nm:+photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li><li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+modulator+microscopy.">Spatial light modulator microscopy.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêts. Les auteurs ont reçu un soutien financier permettant de publication ouverte d&#39;accès par Rapp optoélectronique (Wedel, Allemagne), qui produit un instrument utilisé dans l&#39;article de la vidéo. La société a été impliqué ni dans les expériences ni dans le traitement des données, ni dans l&#39;écriture de manuscrit.

La présente étude montre que SBFI est bien adapté pour l&#39;imagerie à deux photons des transitoires de sodium intracellulaire dans de petits compartiments cellulaires. Il doit être gardé à l&#39;esprit, cependant, que le rendement quantique de SBFI est plutôt faible et 15 par rapport l&#39;évolution de la concentration de sodium sont assez petites avec une activité physiologique. Ainsi, la mesure haute résolution des transitoires Na + dans les processus de qualité est une tâche relativement fastidieuse, et binning ou moyenne de plusieurs essais peuvent être nécessaires pour obtenir des signaux satisfaisants. En outre, la cinétique des phénomènes transitoires de sodium sont étonnamment faible, ce qui rend obligatoire à enregistrer pendant des périodes de temps prolongées. Cette observation correspond à ceux d&#39;études antérieures, où la pourriture monoexponentielle des transitoires de sodium dans les dendrites neuronales et dans les astrocytes a été caractérisée par de grandes constantes de temps de décroissance de l&#39;ordre de 10 secondes à la température ambiante 1,2,6. transitoires de sodium semblent donc exercer une coopérative de temps beaucoup plus lenturse et beaucoup plus grandes constantes de temps de décroissance par rapport à des transitoires de calcium 16. Mettez de côté ces inconvénients, l&#39;imagerie de sodium se révèle être un outil précieux pour l&#39;étude des propriétés physiologiques des sous-domaines neuronales. Par exemple, l&#39;imagerie de sodium peut servir à surveiller l&#39;activité synaptique excitatrice au niveau ou à proximité de synapses actives. Parce que le sodium est essentiellement non tamponnée 8,17, transitoires de sodium induite par l&#39;activité-sont liés de façon linéaire à un large éventail de la libération de glutamate synaptique ou exogène glutamate appliquées. Ils représentent donc des indicateurs directs et impartiaux sur l&#39;activité glutamatergique des neurones. En outre, l&#39;indicateur de sodium colorants présentent de haute K d (K le d de SBFI est de l&#39;ordre de 25 mM 1). Même à des concentrations de colorant intracellulaires relativement élevées utilisées pour obtenir suffisamment de luminosité (en général 0,5 à 1 mM), la K élevé d &#39;s impliquent que les colorants eux-mêmes n&#39;agissent pas comme des tampons pour sodieux. Par conséquent, ils ne faussent pas le cours de l&#39;amplitude, ni le temps de transitoires de sodium, qui est toujours un sujet de préoccupation quand colorants sensibles au calcium sont introduits dans les cellules 18. On peut donc supposer que les signaux détectés représentent un bon indicateur des changements «réels» en sodium intracellulaire. Leur évolution temporelle lente implique alors que la vitesse de diffusion de sodium intracellulaire dans les neurones est beaucoup plus faible que précédemment supposé 19. Une exigence essentielle pour la bonne exécution des expériences portant sur les propriétés de transmission et afflux de sodium voies synaptiques excitateurs dans les épines et les dendrites est l&#39;induction d&#39;une activation rapide et très localisée des structures post-synaptiques. Ceci peut être obtenu par l&#39;application rapide et locale de glutamate ou agonistes à proximité immédiate d&#39;une colonne vertébrale ou une dendrite par la photolyse flash de composés en cage. Photolyse éclair ne dama pas mécaniquementge le tissu, est libre d&#39;artefacts de mouvement et est bien établie pour l&#39;enquête de questions connexes (par exemple la signalisation calcique locale). Le diamètre de la tache uncaging était de 1,5 um dans le plan xy. Uncaging près d&#39;un des signaux de sodium épineux dendrites induites dans les deux épines et la dendrite mère. Alors que les signaux ont tendance à être plus grand dans les épines les plus proches de l&#39;endroit uncaging, les amplitudes dans la dendrite mère et les épines les plus éloignées étaient encore assez semblables à ceux à proximité directe de la place uncaging. Uncaging a été effectuée pour 300 ms au cours de laquelle courants entrants ont augmenté en amplitude. Glutamate Uncaged aurait diffusé dans le tissu au cours de la même période, l&#39;activation de récepteurs ionotropiques du glutamate et afflux de sodium sur les régions et les épines dendritiques plus loin de la place uncaging. Un problème intrinsèque qui se produit lors de l&#39;utilisation d&#39;un laser UV pour la photolyse de composés en cage administrés à travers la solution de bain de celluleest «filtrage interne. En raison de la vitesse de la cage d&#39;absorption élevée, une lumière UV est atténué fortement le long de la voie à partir de l&#39;objectif vers le site de stimulation 20,21. Une façon possible d&#39;éviter cela est perfusion locale de la cage qui est limité seulement au site de stimulation, ce qui réduit en outre la quantité de composé nécessaire pour une cage minimum. Par rapport à uncaging UV à balayage laser à médiation, proche infra-rouge à deux photons uncaging 22 est spatialement plus précise, principalement parce que la précision de la stimulation est augmentée dans l&#39;axe z. D&#39;autre part, en raison de la faible section des cages couramment utilisés pour des longueurs d&#39;onde utilisées comme avec excitation à deux photons, soit une forte concentration du composé en cage ou très élevée, des intensités de lumière potentiellement phototoxiques sont nécessaires. En outre, deux photons uncaging nécessite un investissement beaucoup plus élevé dans l&#39;équipement; entre autres, un laser IR supplémentaire en plus des composants optiques nécessaires, il faut. Les deux SBFI et MNI-glutamate sont excitables dans la gamme de longueur d&#39;onde identique. Cela peut conduire à une interdépendance involontaire du laser UV et uncaging SBFI laser ou d&#39;imagerie infrarouge et MNI-glutamate, ce qui entraîne le blanchiment de SBFI uncaging par le flash et / ou un uncaging continu de glutamate par les rayons infrarouges. Cependant, comme le montre la figure 6C, ni un flash UV par lui-même, ni d&#39;imagerie photonique plusieurs causé ces effets réciproques dans nos conditions expérimentales. Systèmes UV-flash similaires à celle décrite ici sont utilisées en routine dans de nombreux autres laboratoires et peuvent assez facilement être incorporés dans n&#39;importe quel multi-photons imagerie microscope existant. Il offre l&#39;avantage que le faisceau laser pour la photolyse peut être positionné librement dans le champ de vision. En outre, le système permet un repositionnement rapide et automatique du faisceau laser et le volume de sortie, respectivement, dans le champ de vision au cours de l&#39;expérience. Oumodification de r simplifie et améliore le positionnement précis de l&#39;endroit uncaging, de sorte que les images du logiciel d&#39;imagerie peuvent servir à ajuster imagerie et uncaging cadres congruente. L&#39;ensemble de cellule entière de patch-clamp et d&#39;imagerie de sodium à plusieurs photons dans les dendrites et les épines de neurones centraux, combiné avec un mode opératoire modifié pour uncaging induite par la lumière UV de glutamate, permet une activation fiable et focale des récepteurs du glutamate dans le tissu. Il peut donc servir à analyser les propriétés de la transmission synaptique excitatrice et de signaux de sodium dans les neurones post-synaptiques dans le tissu intact.

Les améliorations récentes des techniques de microscopie optique telles que la microscopie multi-photons ont permis l&#39;étude des paramètres morphologiques et physiologiques de cellules du cerveau dans le tissu intact avec une résolution spatiale et temporelle. Combiné avec l&#39;électrophysiologie, ces techniques sont aujourd&#39;hui largement utilisés pour analyser les signaux électriques liés à l&#39;activité de neurones ainsi que des signaux de calcium concomitants dans de petits compartiments sous-cellulaires, à savoir dans les dendrites fines et épines dendritiques. En plus de transitoires de calcium, l&#39;activité synaptique induit également des signaux de sodium dans les dendrites et des épines, dont les propriétés sont en grande partie inexploré. De tels signaux peuvent être analysés par imagerie à deux photons de sodium intracellulaire ([Na +] i) qui permet la mesure en ligne de la [Na +] i transitoires pendant des périodes prolongées sans décoloration significative de colorant ou photo-endommagement 1,2. Pour l&#39;imagerie de i [Na +] </sub&gt;, à seulement quelques colorants indicateurs chimiques sont disponibles, par exemple Corona vert ou Asante Natrium vert 3,4. La sonde fluorescente le plus couramment utilisé pour Na + est de l&#39;isophtalate de benzofurane imagerie (SBFI) de liaison du sodium. C&#39;est un quotientométrique, excité-UV colorant similaire à la célèbre colorant sensible au calcium fura-2 et a été utilisé pour l&#39;imagerie conventionnelle Na + dans de nombreux types de cellules (par exemple 5,6). Il existe différentes possibilités d&#39;exciter le colorant et la perception de sa fluorescence. Si une haute résolution temporelle (ie un taux de rafraîchissement élevé d&#39;imagerie) est nécessaire en combinaison avec l&#39;information spatiale, SBFI peut être excité par une lampe à arc au xénon ou une diode (LED) dispositif émettant de la lumière de forte puissance et son émission détectée avec une charge à haute vitesse dispositif -coupled (CCD) de 7,8. Pour une résolution spatiale maximale en profondeur dans le tissu, la microscopie à balayage laser multi-photonique est la méthode de choix 9. La relativement faible véhicu quantiquence de SBFI nécessite des concentrations relativement élevées de colorant (0,5 à 2 mm), et un chargement direct de la forme de SBFI membrane imperméable par une forte microélectrodes 10 ou la pipette en patch 1. Utilisation SBFI, des travaux antérieurs effectués dans des tranches de tissu aigus de l&#39;hippocampe de rongeurs démontré transitoires de sodium liées à l&#39;activité dans les dendrites et les épines des neurones pyramidaux CA1 qui sont principalement causées par des afflux de sodium par ionotropique récepteurs NMDA 1,2. Pour l&#39;étude des propriétés de ces signaux locaux de sodium de façon plus détaillée, l&#39;activation spécifique des récepteurs post-synaptiques par application d&#39;agonistes du récepteur est un procédé bien adapté de choix. Pour imiter l&#39;activité présynaptique et la libération du transmetteur, l&#39;application devrait être relativement brève et ciblée pour permettre la stimulation locale. Ceci, toutefois, se révèle être très difficile dans le tissu intact. Application d&#39;une pression locale d&#39;agonistes des récepteurs à l&#39;aide d&#39;une pipette à pointe fine permet ap très focalplication, mais accueille le risque potentiel pour produire le mouvement de la structure d&#39;intérêt (par exemple, comme une dendrite ou épines dendritiques), et donc empêche l&#39;imagerie haute résolution. La pertinence de l&#39;ionophorèse de substances neuro-actif dépend de leurs propriétés électriques et amplitudes de courant élevées peut produire des artefacts cellulaires ainsi. Une façon de contourner ces obstacles est l&#39;emploi des composés photo-actif et leur photolyse flash. Fondamentalement, deux principes différents sont utilisés pour la photo-activation des substances en cage: I) grand champ photolyse éclair 11 et II) uncaging focale utilisant des modules de balayage en combinaison avec des lasers 12. Bien que grand champ photolyse éclair est utilisé pour activer les grandes régions d&#39;intérêt, par exemple une cellule entière, uncaging focal est utilisé pour stimuler spécifiquement les petits compartiments cellulaires. Dans la présente étude, nous démontrons une procédure de cellules entières de patch-clamp et multi-pimagerie de sodium dans Hoton dendrites et des épines de neurones centraux, combinée à une procédure modifiée pour uncaging induite à la lumière UV-de glutamate, ce qui permet l&#39;activation et fiable focal des récepteurs du glutamate dans le tissu.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:239px;">Hadrware/Software Component</td>
			<td style="width:231px;">Manufacturer</td>
			<td style="width:183px;">Type</td>
			<td style="width:487px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>1405059</td>
			<td>75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>ProgRes MF</td>
			<td>IR-DIC compatible camera</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>Huygens Pofessional X11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fiber optic spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>USB 4000</td>
			<td>Miniature fiber optic spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Filter tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cenrifugal filter, 0.2 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging software</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR beam power controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR laser</td>
			<td>SpectraPhysics</td>
			<td>Mai-Tai VF-N1S</td>
			<td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR power monitor</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Micromanipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>PCS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Microscope/Imaging System</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>BX51WI/FV300</td>
			<td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">ND filter wheel</td>
			<td>Newport</td>
			<td>50Q04AV.2</td>
			<td>UV fused silica, optical density 0.05-2.0</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Objective</td>
			<td>Nikon Instruments Europe</td>
			<td>NIR Apo 60x/1.0w</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>NPI Electronic</td>
			<td>PDES-DXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>350-80 LA-BK</td>
			<td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell driver</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M302-RM</td>
			<td>High voltage differential amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>LS6ZM2</td>
			<td>ALMgF2-coated BeCu blades</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter driver</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>Uniblitz VCM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Slicer / Vibratome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Uncaging software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser&#160;</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-355/10</td>
			<td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser scanning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA 40</td>
			<td>Galvanometric scanning system</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Name of Compound</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CNQX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">SBFI K+ Salt</td>
			<td>Teflabs</td>
			<td>OO32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">NMI-caged-L-Glutamate</td>
			<td>Torcis</td>
			<td>1490</td>
			<td>Caged glutamatereleased upon UV absobtion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

Multi-photon microscopie à fluorescence a permis l&#39;analyse de paramètres morphologiques et physiologiques des cellules du cerveau dans du tissu intact avec une résolution spatiale et temporelle élevée. Combiné avec l&#39;électrophysiologie, il est largement utilisé pour étudier signaux calciques liées à l&#39;activité dans de petits compartiments sous-cellulaires tels que des dendrites et des épines dendritiques. En plus des transitoires calciques, l&#39;activité synaptique induit également des signaux de sodium post-synaptiques, dont les propriétés ne sont que peu compris. Ici, nous décrivons un procédé de cellule entière de patch-clamp et de l&#39;image combinée sodium multi-photons dans les domaines de la micro-cellulaires des neurones centraux. En outre, on introduit une procédure modifiée de l&#39;ultra-violet (UV) uncaging -light induite par du glutamate, qui permet une activation fiable et focale des récepteurs du glutamate dans le tissu. A cet effet, des enregistrements de cellules entières ont été effectués sur une subdivision corne d&#39;Ammon (CA1) des neurones pyramidaux dans des coupes tissulaires aiguës de l&#39;hippocampe de souris. Les neurones ont été remplis avec le colorant fluorescent SBFI sensible du sodium à travers le patch-pipette, et multi-photon excitation de SBFI permis la visualisation des dendrites et des épines adjacentes. Pour établir uncaging focal induite par les UV, de plusieurs paramètres, y compris l&#39;intensité de la lumière, le volume affecté par le faisceau de uncaging UV, le positionnement de la poutre ainsi que la concentration du composé en cage ont été testés et optimisés. Nos résultats montrent que la perfusion locale avec le glutamate cage (INM-glutamate) et son résultat uncaging-UV focal courants entrants et les transitoires de sodium dans les dendrites et des épines. Evolution dans le temps et l&#39;amplitude des deux courants entrants et des signaux de sodium sont en corrélation avec la durée de l&#39;impulsion uncaging. De plus, nos résultats montrent que les signaux de sodium intracellulaires sont bloquées, en présence d&#39;inhibiteurs de récepteurs ionotropiques du glutamate, ce qui montre qu&#39;ils sont médiés par l&#39;influx de sodium bien que cette voie. En résumé, notre méthode fournit un outil fiable pour larecherche de signaux de sodium intracellulaires induits par l&#39;activation du récepteur correspondant dans le tissu cérébral intact.

Dans la présente étude, nous démontrons une procédure pour la microscopie multi-photons de la dynamique de sodium cellulaires avec le colorant fluorescent de SBFI dépendant du sodium dans les neurones pyramidaux CA1 de la souris aiguë des coupes de tissu hippocampique. En outre, nous montrons comment combiner cette technique d&#39;imagerie avec uncaging basé à balayage laser de composés neuro-actif (par exemple le glutamate en cage) et son ciblage précis de micro-domaines cellulaires. Chargement en cours neurones avec SBFI par le patch-pipette permis la visualisation de l&#39;ensemble de la cellule, y compris des dendrites et des épines fines adjacentes en employant multi-photon excitation (figure 6A, B, D et figure 7A). <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> Figure 6 signaux de sodium et les courants synaptiques induites par photolyse éclair de glutamate cage. (A) Maximde projection d&#39;image d&#39;un neurone al pyramidale CA1 chargé avec SBFI via la pipette de patch (PP). La boîte de montre, à un grossissement de la zone dans B. LP indique la position et l&#39;orientation de la pipette de perfusion locale de glutamate cage (B). Haute puissance de projection maximale d&#39;un empilement de coupes optiques d&#39;une dendrite d&#39;épines dendritiques adjacents. Les piles de sections optiques ont subi z-alignement et déconvolution. La croix rouge indique la région cible du faisceau uncaging. La ligne en pointillés d&#39;orange délimite la région d&#39;intérêt à partir de laquelle l&#39;émission de fluorescence a été enregistré. La boîte indique la zone indiquée élargie dans D. (C) A gauche: signal de sodium (rangée du haut) et somatique courant entrant (rangée du bas) induite par photolyse éclair de glutamate cage (indiqué par le flash jaune). La ligne rouge représente un ajustement des données expérimentales. La zone grise représente la période pendant laquelle le flash uncaging (300msec) obstrué l&#39;imagerie de SBFI fluorescence droite:. Sans pré-perfusion avec du glutamate en cage, même UV-flash ni évoqué un changement de SBFI émission, ni un courant vers l&#39;intérieur (D) à gauche:. l&#39;image de haute puissance de la dendrite et à proximité épines délimitées dans B. Parallèlement, la même image avec des valeurs de gris inversés. Les lignes pointillées indiquent les régions d&#39;intérêt dans lequel l&#39;émission de fluorescence a été enregistré. La croix rouge indique la localisation du faisceau uncaging droite:. Transitoires sodium induites par UV-flash photolyse de glutamate cage. Bleu trace: signaux sodium dans la dendrite; trace rouge: réponse moyenne de trois épines adjacentes à la place uncaging; trace verte: réponse moyenne de trois épines éloignés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour une version plus grande de cette figure.</a> Après perfusion locale avec en cageglutamate, l&#39;application d&#39;un rayonnement UV-flash à proximité d&#39;une dendrite a entraîné une diminution transitoire dans l&#39;émission de fluorescence de SBFI, ce qui reflète une augmentation de la concentration de sodium intracellulaire (Figure 6C, D et figure 7B). Dans le même temps, un courant vers l&#39;intérieur a été observée à la soma (Figure 6C et la figure 7B). L&#39;augmentation de la durée de l&#39;éclair UV conduit à augmenter les amplitudes des deux courants vers l&#39;intérieur du provoquée et les signaux de sodium (données non présentées), ce qui indique que le système est bien à l&#39;intérieur de sa gamme dynamique et que les réponses cellulaires ni ni uncaging ont été saturés. L&#39;application d&#39;un rayonnement UV-éclair d&#39;une durée identique ou plus pour des tranches qui n&#39;ont pas été pré-perfusé avec du glutamate en cage, jamais provoqué des changements dans la fluorescence SBFI ni courants entrants, indiquant que ces signaux sont dus à la uncaging du glutamate (Figure 6C). De plus, ces résultats montrent qu&#39;aucun des composants interdépendance Imaging- uncaging et on observe uelon nos conditions expérimentales. signaux de sodium peuvent également être détectés dans les épines dendritiques (figure 6D). Alors que nous n&#39;avons pas cherché à obtenir une stimulation d&#39;une seule colonne vertébrale qu&#39;avec glutamate uncaging, les amplitudes maximales ont tendance à être légèrement plus élevé dans les épines à proximité de la place uncaging, tandis que les épines plus loin ont montré des changements de fluorescence pratiquement identiques à celles de la dendrite mère (Figure 6D). Enfin, nous avons étudié la voie pour l&#39;entrée de sodium dans les dendrites et des épines en réponse à uncaging de glutamate. Pour ce faire, nous avons utilisé CNQX et APV, qui sont sélectifs pour les bloqueurs sodium-perméable, récepteurs ionotropiques du glutamate et de la AMPA- sous-type NMDA, respectivement. Nos résultats montrent que les signaux de sodium intracellulaire induites par le glutamate et les courants somatiques provoquées ont été omises dans la présence de ces bloqueurs (figure 7B). Lors de wash-out des bloqueurs, les signaux sont repris. Ceci démontre that uncaging de glutamate active récepteurs ionotropiques du glutamate sur les neurones pyramidaux CA1, qui interviennent dans l&#39;afflux de sodium dans les dendrites et des épines, ce qui transitoires de sodium intracellulaire et courants entrants. <img alt="Figure 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> Figure 7 profil pharmacologique des signaux de sodium évoqués et courants entrants. (A) remplie SBFI neurone CA1 pyramidale avec la pipette en patch (PP) fixé à la soma (B) gauche:. Courant transitoire de sodium et somatique induite par photo-activation du glutamate dans une cage de dendrites et des épines attachés Center. Perfusion avec la les bloqueurs des récepteurs ionotropiques du glutamate et CNQX APV inhibe à la fois le signal de sodium et le courant entrant induit par uncaging Droit:. Après lavage par des bloqueurs, les signaux sont restitués. Les représen ligne rougect un ajustement des données expérimentales. La zone grise représente la période pendant laquelle le flash uncaging (300 ms) obstrué l&#39;imagerie de fluorescence SBFI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour une version plus grande de cette figure.</a>

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Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Nous décrivons la combinaison de l&#39;effet des UV focal photo-activation de composés neuro-actif avec la cellule entière de patch-clamp et de l&#39;imagerie multi-photons de transitoires de sodium intracellulaire dans les dendrites et les épines de neurones de l&#39;hippocampe dans les tranches de tissu aiguë du cerveau de la souris.

Multi-photon intracellulaire Imaging sodium Combiné avec uncaging focale médiation-UV de glutamate dans CA1 pyramidale neurones

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

multi-photon-intracellular-sodium-imaging-combined-with-uv-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K vues.  Heinrich Heine University Düsseldorf.  Nous décrivons la combinaison de l'effet des UV focal photo-activation de composés neuro-actif avec la cellule entière de patch-clamp et de l'imagerie multi-photons de transitoires de sodium intracellulaire dans les dendrites et les épines de neurones de l'hippocampe dans les tranches de tissu aiguë du cerveau de la souris. 

Vidéo: Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

Imagerie optique des neurones dans le ganglion de crabe Stomatogastric avec tension colorants sensibles

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Recherche

Neurosciences

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Une méthode pour High Fidelity optogénétiques contrôle de Pyramidal neurones individuels<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Intracellulaire enregistrement, le mappage des champs sensorielle, et la culture de neurones identifiés dans le Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Issu l&#39;évolution temporelle du glutamate Dégagement avec une analyse de déconvolution des courants de Transporteur ASTROCYTIQUES

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Interrogation fonctionnelle des adultes hypothalamique neurogenèse avec Focal radiologique inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

Neurones olfactifs obtenus à l&#39;aide biopsie nasale combinée avec laser-Microdissection: Une approche potentielle pour étudier la réponse au traitement dans les troubles mentaux

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

Imagerie 3-D et de l&#39;analyse des neurones infecté<em&gt; In Vivo</em&gt; Avec<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to study the molecular composition of membranes produced a significant decline in its use. Recently, there has been a major revival in freeze-fracture electron microscopy thanks to the development of effective ways to reveal integral membrane proteins by immunogold labeling. One of these methods is known as detergent-solubilized Freeze-fracture Replica Immunolabeling (FRIL).
The combination of the FRIL technique with optogenetics allows a correlated analysis of the structural and functional properties of central synapses. Using this approach it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their respective expression of a tagged channelrhodopsin and specific molecular markers. The distinctive appearance of the postsynaptic membrane specialization of glutamatergic synapses further allows, upon labeling of ionotropic glutamate receptors, to quantify and analyze the intrasynaptic distribution of these receptors. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to prepare paired replicas and how to immunolabel them. We will also discuss the caveats and limitations of the FRIL technique, in particular those associated with potential sampling biases. The high reproducibility and versatility of the FRIL technique, when combined with optogenetics, offers a very powerful approach for the characterization of different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.
Here, we provide an example how this approach was used to gain insights into structure-function relationships of excitatory synapses at neurons of the intercalated cell masses of the mouse amygdala. In particular, we have investigated the expression of ionotropic glutamate receptors at identified inputs originated from the thalamic posterior intralaminar and medial geniculate nuclei. These synapses were shown to relay sensory information relevant for fear learning and to undergo plastic changes upon fear conditioning.

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Combiné optogénétiques et Cryo-fracture Replica immunomarquage examiner l&#39;aménagement spécifique à l&#39;entrée de Glutamate Receptors dans l&#39;amygdale Souris

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Étiquetage balistique des neurones pyramidaux dans les tranches de cerveau et dans la culture cellulaire primaire

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...