L’imagerie haute résolution de synapses simples exprimant un capteur de glutamate rapide permet de détecter l’inadéquation locale entre la libération de l’émetteur et l’absorption. Dans le cas de la maladie, cette méthode peut être utilisée pour identifier les synapses dysfonctionnelles. Pour la correction de l’autofluorescence, d’abord, placez une tranche de cerveau de la souris d’intérêt dans la chambre d’enregistrement d’un microscope à un photon.
Submergez la tranche dans du liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné et utilisez l’objectif d’immersion d’eau 20x pour localiser le striatum dorsal. Fixez les tranches avec une grille en nylon sur une harpe platine pour minimiser le mouvement des tissus et passez à l’objectif d’immersion d’eau 63x. À l’aide d’un filtre à passage élevé à 510 nanomètres, acquérir ensemble une image des structures positives du capteur autofluorescent et glutamate.
À l’aide d’un filtre à passage élevé à 600 nanomètres, acquérir une deuxième image des structures autofluorescentes seules. Pour définir la plage, utilisez les intensités moyennes des 10 pixels les plus brillants et les 10 pixels les plus foncés pour mettre à l’échelle les images rouges et jaunes. Ensuite, effectuez une soustraction de l’image jaune moins rouge et recalez l’image soustraite pour générer un fichier TIFF 8 bits standard pour une visualisation pratique du bouton d’intérêt.
Pour effectuer une recherche de boutons réactifs, vous avez besoin d’une micropipette en verre appropriée pour la stimulation électrique. Utilisez un puller à micropipette pour produire des pipettes de stimulation à partir de capillaires en verre borosilicate avec des diamètres internes d’environ un micromètre. Pour sonder la libération potentielle dépendante d’action du glutamate à partir d’un ensemble de boutons candidats, sélectionnez un grossissement 63x et un filtre à émission de 510 nanomètres.
Chargez l’image soustraite pour permettre le placement d’une électrode de stimulation en verre à côté d’une varicosité fluorescente, en évitant la proximité d’axones supplémentaires. Dans quelles varicosités associées à une bifurcation ou une allocation maximale dans une partie plus profonde de la tranche. Placez l’électrode de stimulation près du bouton d’intérêt et éteignez la lumière, car les enregistrements doivent être exécutés dans l’obscurité totale.
Ensuite, allumez le système d’application de bain multicanal, avec un canal fournissant la solution de bain standard et les autres canaux fournissant les bloqueurs nécessaires des canaux iions, transporteurs, ou récepteurs membranaires, y compris la tétrototoxine pour bloquer la génération potentielle d’action. Contrôler le débit sur le site de l’enregistrement et allumer le stimulateur pour fournir des impulsions actuelles dépolarisantes de deux à 10 microampes à la pipette de stimulation. La libération est maintenant activée par l’afflux direct de calcium par des canaux fermés de tension.
Pour visualiser la libération de glutamate dans le dégagement, en utilisant le microscope X, Y lecteurs, placer le capteur de glutamate testé bouton positif près du centre viewfield. Après avoir arrêté l’acquisition, cliquez sur l’image avec le bouton de la souris gauche pour déterminer la position X et Y du centre bouton de repos. Les coordonnées X et Y du curseur de l’ensemble seront affichées.
À l’aide des données d’étalonnage, calculer les coordonnées du site où le faisceau laser doit être envoyé pour l’excitation de la fluorescence du capteur de glutamate en utilisant les formules comme indiqué. Pour créer une séquence d’un point dans le logiciel de contrôle laser, sélectionnez le point dans la boîte ajouter à la séquence sur la page de séquence du logiciel de contrôle laser et définir les courses et exécuter le retard à zéro, et la séquence à exécuter à TLL. Ensuite, cliquez sur séquence de démarrage.
Dans le logiciel de contrôle de la caméra, sélectionnez les paramètres d’imagerie appropriés et sélectionnez le démarrage externe pour le mode déclencheur. Cliquez sur prendre le signal dans le logiciel de contrôle de la caméra. Ensuite, lancez le protocole expérimental établi pour le dispositif déclencheur, et implémentez l’essai de protocole expérimental avec la chronologie appropriée, de sorte que la caméra va acquérir 400 images avec une fréquence de 2,48 kilohertz au cours d’un essai, avec une fréquence de répétition de 0,1 hertz ou inférieure.
Pour identifier les synapses pathologiques, activez les routines d’élévation et calculez l’intensité de fluorescence, l’écart moyen et type pour la région d’intérêt choisie au repos. Déterminer et boxer la zone occupée par des pixels dont l’intensité de fluorescence est supérieure à la moyenne plus trois écarts types, et déterminer un diamètre virtuel en microns en supposant une forme circulaire de la zone supra-seuil. Tracez l’intensité de fluorescence par rapport au temps, car la différence entre la valeur réelle d’intensité de fluorescence et la valeur d’intensité de fluorescence au repos divisée par la valeur d’intensité de fluorescence au repos.
Déterminer l’amplitude maximale de la réponse à la fluorescence. Effectuez un raccord monoexponentiel pour la désintégration à partir du pic de la réponse de fluorescence, et déterminez la constante de temps de décomposition, TauD. Pour estimer l’amplitude maximale à une synapse donnée, sélectionnez le pixel avec le changement le plus élevé de l’intensité de fluorescence, qui est le meilleur indicateur de la charge de glutamate présentée aux machines de dégagement de la synapse.
L’imagerie synapse unique peut être utilisée pour identifier deux classes de synapses cortostriatales en utilisant les critères de taille et de rapport d’impulsion appariés. À des intervalles de stimulus de 20 à 50 millisecondes, les plus petits terminaux interenterochephalic sont enclins à la dépression appariée d’impulsion, alors que les plus grands terminaux pyramidaux de région ont montré la facilitation appariée d’impulsion. Les essais sur le comportement moteur effectués sur des souris et des souris de type sauvage exprimant un phénotype huntington, révèlent une coorélation positive significative entre les résultats obtenus pour la course totale de chemin dans le champ ouvert, et l’étape au-dessus de la latence.
En outre, la formation image simple de glutamate de synapse montre que les souris symptomatiques de Huntington ont exhibé un déficit dans la vitesse de la décomposition juxtasynpatic de glutamate comme reflété dans les valeurs de TauD des réponses de glutamate à la stimulation simple de synapse. Chez les animaux de type sauvage, une telle prolongation n’a été observée qu’après l’application d’un inhibiteur sélectif et non transportable de l’absorption du glutamate. L’évaluation de la probabilité d’occurrence d’une valeur taud donnée en tranches de souris de type sauvage, et des souris exprimant les symptômes de la maladie de Huntington, a révélé que chez les animaux de type sauvage, taud ne dépasse jamais 15 millisecondes.
Dans la maladie symptomatique de Huntington cependant, 40% des synapses montrent des valeurs de TauD entre 16 et 58 millisecondes, en dépit d’une tendance pour une réduction de la quantité de glutamate libéré. Par conséquent, taud pourrait être considéré comme un biomarqueur pour les synapses dysfonctionnelles dans la maladie de Huntington, et peut encore être utilisé pour vérifier la récupération fonctionnelle dans des expériences ciblant le transport astrocytique glutamate. Ce protocole pour la surveillance de glutamate aux synapses corticostriatal individuelles peut aider à clarifier le rôle de l’insuffisance d’absorption de glutamate dans la pathogénie de la maladie neurodegenerative.
L’imagerie synapse unique est particulièrement utile pour explorer les sites présynaptiques des synapses excitatrices.
